专利名称：重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法
技术领域：
本发明涉及2-氨基-4-甲硫基丁酸的酶法生产工艺，特别涉及一种在酶促合成基础上发展起来的用重组工程菌的酶催化技术来生产2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法。
背景技术：
2-氨基-4-甲硫基丁酸(蛋氨酸)被广泛用于医药、食品、饲料和化妆品等领域，其中饲料添加剂的用量最大。作为禽类第一限制性必需氨基酸，蛋氨酸是动物饲料里一种必不可少的添加剂，加有蛋氨酸的动物饲料可以在短时间内帮助动物快速成长，增加瘦肉量和缩短饲养周期，节省大约40%的饲料。在医药工业中，蛋氨酸是氨基酸输液和复合氨基酸的主要成份之一。蛋氨酸除了参与动物体内甲基的转移及磷的代谢和肾上腺素、胆碱和肌酸的合成外，还是合成蛋白质和胱氨酸的原料；另外，蛋氨酸是一种很好的抗氧化剂，因为蛋氨酸分子中所含的硫原子能清除自由基，身体细胞内的核酸胶原蛋白质的合成都需要蛋氨酸，对服用避孕药的妇女，服用蛋氨酸也有好处；此外蛋氨酸在食品工业、生物和化学研究、照相技术、美容和化妆品等领域中也有广泛的应用。蛋氨酸的生产方法分为化学法和生物法两大类；化学法按原料分为丙烯醛法、氨基内酯法、丙二酸酯法、酪朊水解法、固液相转移催化法等，目前世界上主要的蛋氨酸生产公司均以丙烯醛法为基础发展出自己蛋氨酸生产工艺，其余的化学方法在工艺路线、产品收率等方面与丙烯醛法有很大差距，现基本废弃不用。近几年来生物法在医药品和精细化工生产中发展迅速，主要有发酵法和生物催化法。发酵法生产蛋氨酸全部为L型，主要借助微生物具有合成各种氨基酸的能力，通过对菌株的诱变处理，选育出各种营养缺陷型及抗性变异株，以解除代谢调节中的反馈及阻遏，达到过量合成氨基酸的目的。蛋氨酸在蛋白质合成中是信息核糖核酸“翻译”成蛋白质过程中的第一步，所以没有蛋氨酸的存在就无法开始合成蛋白质，就不能像其它氨基酸那样利用相应的遗传缺陷型菌株经发酵法生产。发酵法生产蛋氨酸收率很低，没有工业化应用价值。最近吉林大成集团在发酵法生产蛋氨酸方面有了突破性进展，该公司宣称在未来的3年内，大成生化集团的发酵法合成蛋氨酸生产工艺有望研发成功并实现工业化生产。 另外一种具有工业化应用潜力的的方法为生物催化法，许多企业也对生物催化法生产蛋氨酸进行了大力的研究如德固赛公司报道了腈水合酶法蛋氨酸合成工艺从β_甲硫基丙醛出发，通过Strecker反应合成2-氨基-4-甲硫基丁腈后，利用氰基耐受型腈水合酶催化水合得到2-氨基-4-甲硫基丁酰胺，最后在金属催化剂催化下得到蛋氨酸，反应方程式如式(I)所示
权利要求
1.一种重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法，其特征在于所述方法为以含腈水解酶的重组工程菌诱导培养获得的湿菌体为酶源，以2-氨基-4-甲硫基丁腈为底物，于pH值7. (T9. O缓冲液的反应体系中，在25 40°C、15(T200rpm条件下转化反应O.5^2h,反应结束后将反应液后处理，获得2-氨基-4-甲硫基丁酸；所述酶源获得方法为构建含SEQ ID NO :1所示腈水解酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组腈水解酶的湿菌体。
2.如权利要求I所述的重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸方法，其特征在于所述2-氨基-4-甲硫基丁腈的初始质量终浓度为6. (T36g/L反应体系，所述湿菌体的加入量以菌体干重计为2. 5飞.25g/L反应体系。
3.如权利要求I所述的重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸方法，其特征在于所述反应液后处理方法为反应结束后，将反应液离心，取上清液用无水乙醇搅拌萃取，置于4°C下静置结晶，抽滤，取滤饼在真空干燥箱中干燥，即获得2-氨基-4-甲硫基丁酸。
4.如权利要求I所述的重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸方法，其特征在于所述酶源的获得方法为 (1)重组基因工程菌将来源于敏捷嗜酸菌(Acidovoraxfacilis) CCTCC NO. M209044菌株中的基因组DNA为模板，经过PCR扩增得到SEQ ID NO : I所示腈水解酶基因，然后构建含腈水解酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得重组基因工程菌； (2)酶源将步骤(I)重组工程菌接种至含50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37°C培养12h，获得种子液，将种子液以体积比3%的接种量接种到新鲜的含50 μ g/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37°C培养至0D600为O. 6^0. 8，再加入终浓度为O. 2mM的IPTG，37°C诱导培养8h，获得诱导培养液，然后将诱导培养液在4°C、IOOOOrpm离心lOmin，弃去上清收集湿菌体，获得所述酶源。
5.如权利要求4所述的重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸方法，其特征在于所述方法为以含腈水解酶的重组工程菌诱导培养获得的湿菌体为酶源，以2-氨基-4-甲硫基丁腈为底物，于PH值8. OTris-HCl缓冲液的反应体系中，在30°C、150rpm条件下转化反应O. 5h，反应结束后，将反应液离心，弃沉淀，取上清液加入无水乙醇搅拌萃取，于4°C下静置结晶，抽滤，取滤饼在真空干燥箱中干燥，即获得2-氨基-4-甲硫基丁酸；所述2-氨基-4-甲硫基丁腈的初始质量终浓度为6. Og/L应体系，所述湿菌体的加入量以菌体干重计为2. 5g/L反应体系。
全文摘要
本发明公开了一种重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法以含腈水解酶的重组工程菌诱导培养获得的湿菌体为酶源，以2-氨基-4-甲硫基丁腈为底物，于pH值7.0~9.0缓冲液的反应体系中，在25~40℃、150~200rpm水浴摇床反应0.5~2h，反应结束后将反应液后处理获得2-氨基-4-甲硫基丁酸；本发明将基因工程菌用于生物催化生产蛋氨酸实验，该菌可有效生物催化生产蛋氨酸，2h内2-氨基-4-甲硫基丁腈转化率达到80~100%，因此该菌在生物催化生产蛋氨酸的领域中具有广泛的应用前景。
文档编号C12N1/21GK102911975SQ20121033538
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年9月12日
发明者郑裕国, 金利群, 柳志强, 薛亚平, 沈寅初 申请人:浙江工业大学