专利名称：一种大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业育种领域，尤其涉及一种大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒及其应用。
背景技术：
大葱(Alliumfistulosum L. var. giganteum Makino),植物学分类属于百合科(Liliaceae)、葱属(Allium)、葱种(f istulosum)中的一个变种(var. giganteum Makino)。以叶鞘抱合而成的肥大假茎(葱白)为主要产品，因在葱中植株高大而得名。大葱在葱蒜类蔬菜中占有非常重要的位置，是中国人日常生活中不可缺少的重要蔬菜作物之一。在中国普遍栽培，全国常年栽培大葱约计50多万hm2，年产大葱1760多万 t。大葱主要分布在中国的秦岭-淮河以北地区。其中，山东、河南、河北、辽宁等省份栽培较为集中，单产水平也较高。大葱营养成分丰富，据测定每百克大葱含蛋白质I 2. 4g，脂肪O. 3g，碳水化合物
6 8. 6g,热量32千卡，粗纤维O. 5g, I丐12mg,磷46mg,铁O. 6mg,胡萝卜素I. 2mg,硫胺素O. 08mg,核黄素O. 05mg,尼克酸O. 5mg,抗坏血酸14mg,所含胡萝卜素高于瓜菜类和豆菜类蔬菜。另外，大葱还含有挥发性的硫化丙烯等芳香物质，既可作为蔬菜和调味品，也具有良好的药用效果。大葱的管状叶和假茎(葱白)均可食用，生食或熟食皆宜。大葱是非常重要的香辛类蔬菜，其味辛，性温，食用可开胃消食、杀菌防病等。据明代李时珍《本草纲目》记载，葱之茎白、根须、叶、汁、花均可入药，对大葱不同部位的性质和治病作用已进行了详细阐述，记有54个药方，可治10余种疾病。主治伤寒寒热，除肝邪气，治霍乱转筋，利大小便，解耳鸣。现代医学认为大葱具有刺激血液循环等功效。对痢疾杆菌、葡萄球菌等有杀灭作用。因为大葱生长周期较长，开花期较短，单果结籽数较少，自交衰退较明显等特点，所以开展大葱育种难度较大，从而限制了大葱育种研究工作的开展，国内外从事大葱育种研究的人员较少，因此，大葱育种研究相对滞后。长期以来，我国大葱育种一直以选种为主，各地栽培的大葱名产品种和推广的新品种，主要是采用选种方法育成。自上世纪70年代日本和我国才陆续开展了大葱雄性不育系及其利用研究，开始了大葱一代杂种选育，但是，一代杂种选育进展缓慢，至今在生产上没有得到较大面积推广。山东农业大学、山东省农业科学院蔬菜研究所、章丘市农业局、辽宁省农科院园艺系等单位，利用自然群体中的不育株，通过4-5代回交，先后育成大葱雄性不育系和相应保持系。陈立东、王景峰等育成了超早熟大葱雄性不育系603A、626A ;张启沛、魏佑营等育成了大葱不育系4A、5A、225A、237A ;佟成富、唐成英等育成了大葱不育系244A[佟成富，唐成英，崔连伟.大葱雄性不育系244A及其杂交种辽葱二号(9746F1)的选育及利用.全国蔬菜遗传育种学术讨论会论文集，2002. 301-307];陈运起、高莉敏等育成了大葱雄性不育系9801A、9802A 等。
为加快大葱雄性不育系选育进程，盖树鹏、孟祥栋等(2004)利用RAPD标记和SCAR标记初步建立了大葱不育系、保持系分子标记辅助选择的技术体系[盖树鹏，孟祥栋等.大葱雄性不育分子标记辅助选择的研究.分子植物育种，2004，2 (2) :223-228]。可以减少工作量，缩短部分大葱品种的育种年限，但是不能在广泛的育种材料中实现苗期选择。加强生物技术与常规育种的结合生物技术的发展给园艺植物遗传育种带来了巨大的变化，分子标记技术已成为育种研究的重要组成部分。但是，要使分子标记成为育种的一种常规手段，尚有许多问题有待解决。如重要性状基因的精细定位，检测过程的自动化，饱和遗传图谱的构建等。生物技术与常规育种相结合，将有力的推动大葱遗传育种学的发展。加快雄性不育系与一代杂种选育优良雄性不育系选育是选育一代杂种、利用杂种优势的重要前提，从大葱制种田发现不育株后，通过回交或体细胞杂交、细胞器转移、细胞质基因工程等技术转育成更多的优良雄性不育系，进而培育出优势明显的一代杂种。随着 大葱育种研究的不断深入，大葱一代杂种选育与利用将进一步加快，大葱一代杂种的推广覆盖率将迅速提高。日本的马上武彦等(1985)，用大葱雄性不育材料连续三次回交与7个品种杂交，观察植株花粉和种子的育性，判定大葱雄性不育的遗传模式，研究结果认为大葱雄性不育是受胞质与核基因互作控制，雄性不育与保持系分别由两对基因S(mSlmSlmS2mS2)和N(mslmslms2ms2)支配,雄性不育性可用于大葱杂交育种。近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。DNA分子标记研究与应用的迅速发展为植物遗传育种注入新的活力，并使传统育种技术发生了深刻的变化。DNA分子标记的研究始于1980年，现已有数十种标记技术。与传统的遗传标记相比，DNA分子标记有很多优点。以PCR为基础的DNA指纹技术大大加快了 DNA分子标记的研究和利用，广泛应用于植物遗传育种、高密度遗传图谱的构建、基因定位和克隆、植物亲缘关系鉴别及遗传多样性研究、分子标记辅助选择育种等领域。植物育种中分子标记辅助选择是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在的。通过不同分子标记技术的分析可筛选出与目标基因性状紧密连锁的DNA片段，这样可以作为辅助育种的分子标记。应用这些分子标记进行间接选择，将得到事半功倍的作用，因为分子标记辅助选择不受植物生长发育的时期及环境的影响，不存在表达与否的问题。无论是与细胞质位点还是与核基因连锁的标记的辅助选择都可减少工作量，提高育种效率。利用与细胞质位点连锁的标记可鉴别出单株的细胞质类型，淘汰可育材料中S型细胞质，只能从N型细胞质类型的单株中选择保持系，从而减少测交组合数和自交株数，减少工作量，避免盲目性，提高选择效果。原有报道的通过提取大葱线粒体DNA进行PCR扩增，得到2800bp片段的分子标记不能在广泛的大葱材料中应用，应用范围较窄。
发明内容
本发明涉及一种大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒及其应用。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案本发明一方面涉及一种用于大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒，其特征在于包括如下的SCAR (Sequence-characterized Amplified Region序列特异性扩增区)标记引物正向引物WMS607L:5' CATAAGACTTGCCCTGAG3'；反向引物WMS607R:5' TTCGCTATGTTCTATGTGAG3'。在本发明的一个优选实施方式中，所述的试剂盒包括CTAB法提取DNA所需要的试剂。在本发明的另一个 优选实施方式中，所述的试剂盒包括PCR扩增所需要的试剂。在本发明的另一个优选实施方式中，所述的试剂盒包括对扩增产物进行凝胶电泳的试剂盒以及DNA Maker。本发明另一方面还涉及上述试剂盒在大葱分子标记辅助选择育种中的应用。在本发明的一个优选实施方式中，所述应用包括用CTAB法提取大葱总DNA，然后使用所述的SCAR标记引物对所提取的DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳以确定扩增产物的片段长度，根据检测结果判断所检测的植株是否是细胞质不育类型。本发明的试剂盒可以广泛应用于我国辽宁大葱、河南大葱、山东大葱以及日本大葱等细胞质的育性鉴定。本发明通过提取大葱总DNA即可，避免了提取线粒体DNA的复杂操作，使操作过程更简单有效。分子标记辅助选择操作简单，节约成本和时间，为大葱分子标记辅助选择育种体系奠定了基础。
具体实施例方式实施例I合成大葱细胞质雄性不育SCAR标记的引物正向引物WMS607L:5' CATAAGACTTGCCCTGAG3'；反向引物WMS607R:5' TTCGCTATGTTCTATGTGAG3'。选择已知基因型的个体材料共220份，对大葱DNA提取采用北京天根生产的植物基因组CTAB法提取试剂盒(也可以使用其它常规的CTAB法提取试剂盒进行提取)以及试剂盒中所述方法进行提取；PCR扩增在美国伯乐TC-XP-D型基因扩增仪上进行，20 μ L体系，其中 2x Taq MasterMixlO μ L, Primerl、2 (10umol/L)各 I. O μ L，样品 DNAl μ L，反应程序为94°C预变性2min，94°C变性30sec，53°C退火lmin，72°C延伸lmin，35个循环，72°C延伸5min，4°C保存；PCR产物在I. 2 %琼脂糖凝胶进行电泳分离分析，溴化乙啶染色，凝胶成像系统自动成像；特异条带回收纯化，按照Gel Extract ion Kit使用说明；连接、转化、鉴定按照PGM-T克隆试剂盒说明；DNA序列测定委托北京博尚生物技术有限公司完成。对已知育性的220份材料进行PCR验证(见表I)，按照本发明实施例中的方法，所有的不育系中均扩增出大小为607bp的片段，而保持系中没有扩增产物，PCR结果与田间判断相吻合。说明应用这对引物完全可以鉴别大葱细胞质雄性不育类型，据此得知扩增出的607bp片段与雄性不育有一定的联系。对以上大葱细胞质雄性不育系980238A、200501A中扩增出的特异片段经过回收、转化、克隆和测序，得到的结果一致，序列全长607bp，核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，两端含有引物序列，其碱基组成为A+T = 55%,C+G = 45%。表I大葱不育系和保持系单株验证结果
权利要求
1.一种用于大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒，其特征在于包括如下的SCAR标记引物 正向引物WMS607L :5' -CATAAGACTTGCCCTGAG-3'； 反向引物WMS607R :5' -TTCGCTATGTTCTATGTGAG-3'。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，所述的试剂盒包括CTAB法提取DNA所需要的试剂，所述的试剂优选的是北京天根生产的的植物基因组提取试剂盒中的试剂。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，所述的试剂盒包括PCR扩增所需要的试剂。
4.根据权利要求I所述的试剂盒，所述的试剂盒包括对扩增产物进行凝胶电泳的试剂盒以及DNA Maker。
5.权利要求1-4任意一项所述的试剂盒在大葱分子标记辅助选择育种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述应用包括用CTAB法提取大葱总DNA，然后使用所述的SCAR标记引物对所提取的DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳以确定有无扩增产物以及扩增产物的片段长度，根据检测结果判断所使用的大葱是否属于细胞质不育系O
全文摘要
本发明公开了一种大葱细胞质雄性不育的检测试剂盒及其大葱辅助选择育种中的应用，所述的试剂盒包括SCAR标记引物正向引物WMS607L5′CATAAGACTTGCCCTGAG 3′；反向引物WMS607R5′TTCGCTATGTTCTATGTGAG 3′。本发明的试剂盒可以广泛应用于我国辽宁大葱、河南大葱、山东大葱以及日本大葱等细胞质的育性鉴定。本发明通过提取大葱总DNA即可，避免了提取线粒体DNA的复杂操作，使操作过程更简单有效。分子标记辅助选择操作简单，节约成本和时间，为大葱分子标记辅助选择育种体系奠定了基础。
文档编号C12Q1/68GK102851379SQ20121034897
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者高莉敏, 陈运起, 董飞, 孔素萍 申请人:山东省农业科学院蔬菜研究所