高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，包括以下步骤：步骤1）制备反应液；步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;步骤3）使用大肠杆菌ETEC-STa+菌株，核酸STp+菌株，以及临床分离金黄色葡萄球菌以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，进行反应，观察它们的阴阳性。本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测肠产毒性大肠杆菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。
【专利说明】高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及疾病检测【技术领域】，具体的说，是一种高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法。
【背景技术】
[0002]肠产毒性大肠杆菌(ETEC)性肠炎主要通过污染的水源、食品、牛奶、饮料等传播，产毒性大肠杆菌(ETEC)产生的毒素分为不耐热肠毒素(LT)和耐热肠毒素(ST)，根据其来源不同，耐热肠毒素又可分为猪源性(STp)和人源性(STa)，它们分别由位于质粒上的三种毒力基因编码，产毒性大肠杆菌(ETEC) —般含有三个毒力基因中的一个或几个基因。肠产毒性大肠杆菌(ETEC)检测以LT检测为主，但是约有5~10%肠产毒性大肠杆菌不具有LT基因，容易漏检，本发明提供高特异性检测STa基因的引物序列和方法，以提高肠产毒性大肠杆菌的检测率。
[0003]环介导等温扩增技术是由日本荣研(EIKEN)株式会社开发的高特异性敏感度的核酸检测系统，无须昂贵的设备，已经成为核酸快速检测法的良好手段，本发明结合环介导等温扩增技术，设计针对大肠杆菌0157特异性基因序列的一对外引物(ETEC-F3和ETEC-B3)和一对内引物(ETEC-FIP和ETEC-BIP)进行环介导等温扩增。
【发明内容】
[0004]本发明公开了一种高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，提高了肠产毒性大肠杆菌的检测和诊断效率。
[0005]为实现上述技术目的`，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，包括以下步骤:
步骤I)制备反应液 反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM
4M甜菜碱IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
内引物
ETEC-FIP40umol
ETEC-BIP40umol
外引物
ETEC-F35umol
ETEC-B35umol
标本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul ；步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性；
步骤3)使用大肠杆菌ETEC-STa+菌株，核酸STp+菌株，以及临床分离金黄色葡萄球菌以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，进行反应，观察它们的阴阳性。
[0006]进一步的，所述外引物ETEC-F3的序列为TTTGTCATGCAGCCCATC。
[0007]进一步的，所述外引物ETEC-B3的序列为TAGGTAGGTAGGTAGGTAGG。
进一步的，所述内引物ETEC-FIP的序列为 CGACTGGATGACGTGATAAGTG-CTACATCTCACCTTTTTTAGACC。
[0008]进一步的，所述内引物ETEC-BIP 的序列为 TCAAAGGCTTTAAGACGTAGACTTT-GGTAGGTAACAACTCTCATTG。
[0009]进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
[0010]本发明的有益效果是:
本发明通过配制反应液， 设计引物序列，能快速、准确的检测肠产毒性大肠杆菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。
【具体实施方式】
[0011]下面将结合实施例，来详细说明本发明。
[0012]高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，包括以下步骤:
步骤I)制备反应液
反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM
4M甜菜碱IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
内引物
ETEC-FIP40umol
ETEC-BIP40umol
外引物
ETEC-F35umol
ETEC-B35umol
标本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul。
[0013]选取肠出血性大肠杆菌特异性基因基因(基因序列来源美国国立生物技术信息中心-NCBI)，设计引物序列，所述外引物ETEC-F3的序列为TTTGTCATGCAGCCCATC，所述外引物ETEC-B3的序列为TAGGTAGGTAGGTAGGTAGG，所述内引物ETEC-FIP的序列为CGACTGGATGACGTGATAAGTG-CTACATCTCACCTTTTTTAGACC，所述内引物 ETEC-BIP 的序列为 TCAAAGGCTTTAAGACGTAGACTTT-GGTAGGTAACAACTCTCATTGo
[0014]进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
[0015]步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性；步骤3)使用大肠杆菌ETEC-STa+菌株3株，核酸STp+菌株2株，以及临床分离金黄色葡萄球菌以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，进行反应，观察它们的阴阳性。结果显示:3株STa菌株核酸均为阳性，其余菌种为阴性。
[0016]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤I)制备反应液 反应液组成及含量为 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐热聚合酶反应缓冲液IX，MgS04 2mM4M甜菜碱IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 内引物 ETEC-FIP40umol ETEC-BIP40umol 外引物 ETEC-F35umol` ETEC-B35umol标本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul ； 步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性； 步骤3)使用大肠杆菌ETEC-STa+菌株，核酸STp+菌株，以及临床分离金黄色葡萄球菌以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，进行反应，观察它们的阴阳性。
2.根据权利要求1所述的高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，其特征在于:所述外引物ETEC-F3的序列为TTTGTCATGCAGCCCATC。
3.根据权利要求2所述的高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，其特征在于:所述外引物ETEC-B3的序列为TAGGTAGGTAGGTAGGTAGG。
4.根据权利要求3所述的高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，其特征在于:所述内引物ETEC-FIP的序列为
CGACTGGATGACGTGATAAGTG-CTACATCTCACCTTTTTTAGACC。
5.根据权利要求4所述的高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，其特征在于:所述内引物 ETEC-BIP 的序列为 TCAAAGGCTTTAAGACGTAGACTTT-GGTAGGTAACAACTCTCATTG。
6.根据权利要求5所述的高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，其特征在于:所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
【文档编号】C12Q1/68GK103725754SQ201210380630
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月10日 优先权日:2012年10月10日
【发明者】金京勋, 沈强, 吕少波 申请人:苏州四同医药科技有限公司