一种高特异高敏感检测沙门氏菌的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高特异高敏感检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤：步骤1）制备反应液；步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;步骤3）使用临床分离沙门氏菌，临床分离金黄色葡萄球菌以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，进行反应，观察它们的阴阳性。本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测沙门氏菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。
【专利说明】一种高特异高敏感检测沙门氏菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及疾病检测【技术领域】，具体的说，是一种高特异高敏感检测沙门氏菌的方法。
【背景技术】
[0002]沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它们除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。中国内陆地区也以沙门氏菌为首位。急需特异性和敏感度高的快速诊断试剂。
[0003]环介导等温扩增技术是由日本荣研(EIKEN)株式会社开发的高特异性敏感度的核酸检测系统，无须昂贵的设备，已经成为核酸快速检测法的良好手段，本发明结合环介导等温扩增技术，设计针对沙门氏菌特异性基因序列的一对外引物(SAL-F3和SAL-B3)和一对内引物(SAL-FIP和SAL-BIP)进行环介导等温扩增。
【发明内容】
[0004]本发明公开了一种高特异高敏感检测沙门氏菌的方法，提高了沙门氏菌的检测和诊断效率。
[0005]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种高特异高敏感检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤:
步骤I)制备反应液 反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
10X耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM
4M甜菜碱IM
10mM d-NTP 混合液400 μ M
内引物
SAL-FIP40umol
SAL-BIP40umol
外引物
SAL-F35umol
SAL-B35umol
标本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul ；
步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性；步骤3)使用临床分离沙门氏菌，临床分离金黄色葡萄球菌以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，进行反应，观察它们的阴阳性。
[0006]进一步的，所述外引物SalF3的序列为GCTTGTGATTACTGCGAC。
[0007]进一步的，所述外引物SalB3的序列为ACGATTGAACGGAGCAAC。
进一步的，所述内引物SalFIP的序列为 CCTGACTTATAGAGTGTAAGCGGAT-AGGTGCAATAAAGATAACCCGo
[0008]进一步的，所述内引物SalBIP 的序列为 GATGGGGATGTTTGGCCAAGT-TGAATGCCAATTTGTCGG。
[0009]进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
[0010]本发明的有益效果是:
本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测沙门氏菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。
【具体实施方式】
[0011]下面将结合实施例，来详细说明本发明。
[0012]一种高特异高敏感检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤:
步骤I)制备反应液`
反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM
4M甜菜碱IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
内引物
SAL-FIP40umol
SAL-BIP40umol
外引物
SAL-F35umol
SAL-B35umol
标本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul。
[0013]选取沙门氏菌特异性基因基因(基因序列来源美国国立生物技术信息中心-NCBI)，设计引物序列，所述外引物SalF3的序列为GCTTGTGATTACTGCGAC，所述外引物SalB3的序列为ACGATTGAACGGAGCAAC，所述内引物SalFIP的序列为
CCTGACTTATAGAGTGTAAGCGGAT-AGGTGCAATAAAGATAACCCG,所述内引物 SalBIP 的序列为GATGGGGATGTTTGGCCAAGT-TGAATGCCAATTTGTCGGo
[0014]进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
[0015]步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性；
步骤3)使用临床分离沙门氏菌3株核酸(由苏州疾病控制中心和苏州第五人民医院提供)，临床分离金黄色葡萄球菌以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，进行反应，观察它们的阴阳性。结果显示:3株沙门氏菌核酸均为阳性，其余菌种为阴性。
[0016]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含`在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种高特异高敏感检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤I)制备反应液 反应液组成及含量为 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM4M甜菜碱IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 内引物 SAL-FIP40umol SAL-BIP 40umol 外引物 SAL-F35umol SAL-B35umol标本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul ； 步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性； 步骤3)使用临床分离沙门氏菌，临床分离金黄色葡萄球菌以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，进行反应，观察它们的阴阳性。
2.根据权利要求1所述的高特异高敏感检测沙门氏菌的方法，其特征在于:所述外引物 SalF3 的序列为 GCTTGTGATTACTGCGAC。
3.根据权利要求2所述的高特异高敏感检测沙门氏菌的方法，其特征在于:所述外引物 SalB3 的序列为 ACGATTGAACGGAGCAAC。
4.根据权利要求3所述的高特异高敏感检测沙门氏菌的方法，其特征在于:所述内引物SalFIP的序列为
CCTGACTTATAGAGTGTAAGCGGAT-AGGTGCAATAAAGATAACCCGo
5.根据权利要求4所述的高特异高敏感检测沙门氏菌的方法，其特征在于:所述内引物 SalBIP 的序列为 GATGGGGATGTTTGGCCAAGT-TGAATGCCAAITTGTCGG。
6.根据权利要求5所述的高特异高敏感检测沙门氏菌的方法，其特征在于:所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
【文档编号】C12Q1/68GK103725755SQ201210380666
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月10日 优先权日:2012年10月10日
【发明者】金京勋, 沈强, 黄政新, 沈永林, 贾宇玲, 赵静, 薛婧, 横山英树, 大木裕信 申请人:苏州四同医药科技有限公司