脂肪酶稳定剂的制作方法

脂肪酶稳定剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种脂肪酶稳定剂，该脂肪酶稳定剂包括Na2SO4和山梨醇。使用本发明提供的脂肪酶稳定剂能使米黑根毛霉脂肪酶达到很好的稳定效果，为保藏和进一步的应用提供了基础。
【专利说明】脂肪酶稳定剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及酶制剂领域，具体来说，本发明涉及一种脂肪酶稳定剂。
【背景技术】
[0002]脂肪酶是一种广泛存在于动物、植物及微生物中的酶，因为微生物具有培养简单、周期短产量大等特点，因此工业用途的酶制剂基本上都来源于微生物。
[0003]米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(RML)具有较高sn_l, 3选择性,广泛用于结构脂质(Structured lipids)的酶法合成,如SOS、0P0、DAG的合成。就目前工业化应用前景来看，天然的米黑根毛霉产RML的单位产量较低，且成分不稳定，提取纯化工艺复杂，生产成本高，使得其应用受到限制。因此利用基因工程技术，在合适的生产宿主菌中异源表达米黑根毛霉脂肪酶基因已经成为主流方向。诺维信公司最早报道了用米曲霉为生产宿主表达米黑根毛霉脂肪酶基因，并获得工业化生产。尽管真菌米曲霉不失为一种优良的表达载体，但其自身会分泌各种非目标蛋白，如:Νονο的Lipozyme RM酶液中非目的蛋白淀粉酶的含量远高于目的蛋白RML脂肪酶，另外，还有很多其他杂蛋白如:蛋白酶等，导致其提取困难，应用受限。
[0004]毕赤酵母作为能够实现外源蛋白高效表达的优秀宿主菌近年来得到了越来越广泛的应用。RML在毕赤酵母中的表达研究也比较多，如CN101481695A利用酵母表面展示系统将改良的RML基因在毕赤酵母中表达，并将RML分泌到酵母表面，经离心，冷冻干燥获得菌体冻干粉，利用橄榄油测定RML水解活力为468.8U/g酵母干细胞。CN 102080092A利用7L发酵罐甲醇诱导毕赤酵母表达米黑根毛霉脂肪酶84h，用对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)法测得发酵液的脂肪酶最`高水解活力为7062.5U/ml。
[0005]毕赤酵母发酵液经提取处理后得到的RM液体脂肪酶，该液体脂肪酶在具体应用的过程中会出现保存期短，酶活降低的现象，限制了米黑根毛霉脂肪酶的进一步开发利用和研究。目前，关于提高液体酶稳定性的方法有较多的研究和报道。
[0006]郝秋娟等对淀粉液化芽孢杆菌产β -葡聚糖酶稳定剂进行了研究。在β -葡聚糖酶溶液中添加大分子亲水型多糖黄原胶、动物蛋白明胶、甘油、氯化钠可明显提高β_葡聚糖酶的热稳定性。将添加甘油120g/L、黄原胶5g/L复合稳定剂的葡聚糖酶溶液60°C处理2h，酶液的残余酶活比未经处理的酶活提高了 55.3% (郝秋娟等，淀粉液化芽孢杆菌产β-葡聚糖酶培养基优化以及酶稳定剂的研究[J]，中国酿造，2006，(4):18-22)。李品周对扩展青霉碱性脂肪酶的稳定性进行了研究，研究发现液体脂肪酶的最佳组合配方为4mM的Ca2+、0.0313M的四硼酸钠和4M的丙三醇，在40°C下可提高脂肪酶热稳定性半衰期84h，35°C下提高酶半衰期为790h (李品周，扩展青霉碱性脂肪酶稳定性研究[D]，福建师范大学硕士学位论文，2007)。薛正莲等用大分子亲水性多糖黄原胶，明显提高了糖化酶的耐热性及储存稳定性。在含有黄原胶、NaCl、甘油的缓冲体系中，糖化酶液于室温放置6个月，其酶活只损失15.2%，而对照的却损失了 39.8% (薛正莲等，糖化酶稳定性的研究[J].食品与发酵工业，1999，25 (4):38-40)0陈小泉等对青霉脂肪酶的稳定剂进行了研究，青霉脂肪酶在一定浓度的钙离子存在下，显示出高的活性，当钙离子浓度为2X10-2M时，酶的相对活性达180%。乙酸钠和多羟基化合物可以作为洗涤剂的稳定剂，其中多羟基高分子化合物对青霉脂肪酶有优良的稳定和激活效果(陈小泉等，洗涤剂用碱性脂肪酶稳定剂研究[J]，南华大学学报(理工版)，2001，15 (2):17-19)。
[0007]Kaushik J K等用核糖核酸酶、α -胰凝乳蛋白酶原、溶菌酶、细胞色素C和胰蛋白酶抑制剂来研究一些有代表性的低分子量的多元醇添加剂的稳定效果，表明肌醇效果最好，甘露醇和山梨醇居中，木糖醇最差(KaushikJ K, Bhat R.Thermal stability ofprotein in aqueous polyol solution[J].J PhyChem B, 1998，102:7058-7066)。Costa等研究了多种添加剂对来自杆菌的过氧化氢酶的影响，发现在4°C和30°C，甘油和聚乙烯乙二醇能增加其储存稳定性(Costa S A, Tzanov T, Carneiro A F, Paar A, Gubitz GM, CavacoPaulo A.Studies of stabilization of native catalase using additives[J].EnzymeMicrob Techno I, 2002, 30:387-391 )。Noel 研究了多羟基醇(山梨醇，木糖醇，赤藻糖醇，甘油以及乙二醇)以及盐类化合物(NaCl，KCl, KBr, NaBr, LiBr以及LiCl)对脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase)稳定性和催化活性的影响,发现多羟基醇比盐类化合物对脂肪酶热变性的保护更加有效，且多羟基醇对该酶热变性或压力变性的保护作用随着多羟基醇浓度以及碳链增加而提高，而盐类化合物对酶热变性的保护效果主要取决于盐的浓度、特性以及酶的种类(Noel M, Combes D.Rhizomucor miehei lipase:differetialscanningcalorimetry and pressure/temperature stability studies in presence ofsolubleadditives[J].Enzyme and Microbial Technology, 2003，33:299-308)。
[0008]CN 101297025A公开了一种浓缩的液体酶添加剂，其中包括酶和苯基硼酸或其衍生物和表面活性剂，其中酶以多于1.5g/L的量存在。另外，该专利还公开了用于制备浓缩的液体酶添加剂的方法。CN 101981049A公开了一些肽醛或酮衍生物对于在水性组合物，如液体洗涤剂中稳定枯草杆菌蛋白酶类型的蛋白酶特别有效，该组合物包括具有OH-取代的苯丙氨酸作为C-末端残基的肽化合物。CN 100519745C公开了一种提高、改进臭曲霉ZU-Gl液体发酵生产的α -半乳糖苷酶稳定性的保护剂，重量份组成为:甘露醇18-36 ;棉籽糖76-126 ;海藻糖38-95。使用时向每100ml臭曲霉的粗酶液中加入保护剂130_260mg，采用该保护剂，使得臭曲霉ZU-Gl液体发酵生产的α -半乳糖苷酶在30°C -60°C酶活保留率提高11.6%-21.7%，耐酸性从pH 4.0下降到pH 3.0，在pH 3.0的环境中仍保留52%的活性。CN100384993C公开了一种提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶稳定性的方法，在该弹性蛋白酶的粗酶液中添加牛血清白蛋白、明胶和水合氯化钙；牛血清白蛋白与粗酶液的重量体积比为l-3g/100ml，明胶与粗酶液的重量体积比为l_3g/100ml，水合氯化钙与粗酶液的投料比为l-3mmol/L。采用该方法，能提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶的热稳定性和pH耐受性。
[0009] 然而对于不同的酶，其稳定剂的组成和含量千差万别，同一种稳定剂用于不同的酶时，其效果也会存在巨大差异。
[0010]因此，开发经济、有效的稳定剂对于米黑根毛霉脂肪酶的产业化应用有着重要的研究意义和市场价值。

【发明内容】
[0011]本发明的发明人针对上述问题进行了深入研究，在研发过程中发现，将Na2SO4和山梨醇进行复配，能获得用于脂肪酶长期保藏的稳定剂，其稳定效果良好。
[0012]因此，本发明的第一个目的在于，提供一种毕赤酵母发酵生产的液体脂肪酶的稳定剂。
[0013]本发明提供的脂肪酶稳定剂包含=Na2SOjP山梨醇，优选的，在所述稳定剂中，Na2SO4和山梨醇的重量比为1-5:30-50。
[0014]在本发明的一个优选实施例中，所述脂肪酶稳定剂为脂肪酶溶液稳定剂。
[0015]在本发明的一个优选实施例中，所述脂肪酶稳定剂用于稳定脂肪酶溶液时，所述Na2SO4浓度为l_5wt%，所述山梨醇浓度为30-50wt% ;优选的，所述山梨醇浓度为40_50wt%，和/或所述Na2SO4浓度为3-5wt%。 [0016]在本发明的一个更优选的实施例中，所述脂肪酶稳定剂中还包括:(册14)2504、蔗糖、海藻糖、Dextran-ΙΟ、甘油中的一种或多种。优选的，所述脂肪酶稳定剂用于稳定脂肪酶溶液时，
[0017]所述(NH4)2S04 的浓度为 0.5-5wt% ;和 / 或
[0018]所述蔗糖的浓度为25_50wt% ;和/或
[0019]所述海藻糖的浓度为25_50wt% ;和/或
[0020]所述Dextran-1O 的浓度为 10_30wt% ;和 / 或
[0021]所述甘油的浓度为25_50wt%。
[0022]在本发明的一个优选实施例中，所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶。
[0023]在本发明的一个优选实施例中，优选的米黑根毛霉脂肪酶的序列如SEQ ID N0:1所示。
[0024]本发明还有一个目的在于，提供一种稳定的脂肪酶溶液。
[0025]本发明提供的稳定的脂肪酶溶液中包含Na2SO4和山梨醇。
[0026]在本发明的一个优选实施例中，所述Na2SO4浓度为l_5wt%，所述山梨醇浓度为30-50wt%o优选的，所述山梨醇的浓度为40-50wt%，和/或所述Na2SO4浓度为3_5wt%。
[0027]在本发明的一个优选实施例中，所述溶液中还包括:(NH4)2SO4、蔗糖、海藻糖、Dextran-ΙΟ、甘油中的一种或多种；优选的，
[0028]所述(NH4)2S04 浓度为 0.5-5wt% ;和 / 或
[0029]所述蔗糖的浓度为25_50wt% ;和/或
[0030]所述海藻糖的浓度为25_50wt% ;和/或
[0031]所述Dextran-ΙΟ 的浓度为 10_30wt% ;和 / 或
[0032]所述甘油的浓度为25_50wt%。
[0033]在本发明的一个优选实施例中，所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶。
[0034]在本发明的一个优选实施例中，优选的米黑根毛霉脂肪酶的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0035]本发明还有一个目的在于提供一种稳定脂肪酶的方法。
[0036]本发明提供的稳定脂肪酶的方法为，在所述脂肪酶中加入本发明提供的上述稳定剂。
[0037]本发明还有一个目的在于，提供一种脂肪酶稳定剂的用途。[0038]本发明提供的脂肪酶稳定剂可用于长期保藏脂肪酶。
[0039]使用本发明提供的稳定剂，在脂肪酶，特别是米黑根毛霉脂肪酶的长时间保藏中，能达到很好的稳定效果，为脂肪酶，特别是米黑根毛霉脂肪酶的保藏和进一步的应用提供了良好的基础。
【具体实施方式】
[0040]本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了 60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值I和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到:1-3、1-4、1-5、2-3、2-4和2_5。
[0041]在本发明中，除非有其他说明，组合物的各组分的含量范围以及其优选范围之间可以相互组合形成新的技术方案。
[0042]在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。
[0043]在本发明中，除非有其他说明，所有“份”和百分数(％)都指重量百分数。
[0044]在本发明中，除非有其他说明，所有组合物中各组分的百分数之和为100%。
[0045]在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a_b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了 “0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。
[0046]如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。
[0047]如果没有特别指出，本发明所述的百分数(包括重量百分数)的基准都是所述组合物的总重量。
[0048]在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。
[0049]在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
[0050]在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
[0051]在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行，但是优选是顺序进行的。例如，所述方法包括步骤(a )和(b )，表示所述方法可包括顺序进行的步骤(a)和(b)，也可以包括顺序进行的步骤(b)和(a)。例如，所述提到所述方法还可包括步骤(C)，表示步骤(C)可以任意顺序加入到所述方法，例如，所述方法可以包括步骤(a)、(b)和(c),也可包括步骤(a)、(C)和(b),也可以包括步骤(C)、(a)和(b)等。
[0052]在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的“包括”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”可以表示还可以包含没有列出的其他元件，也可以仅包括列出的元件。
[0053]在本发明中，如果没有特别的说明，本文实施例中的具体数值以及具体物质可与本文描述部分的其他特征结合。例如，本文描述部分提到反应的温度为10-100°c，而实施例提到的反应温度为20°C，那么可以认为本文已经具体公开了 10-20°C的范围，或者20-100°C的范围，且该范围可以描述部分的其他特征结合起来形成新的技术方案。又例如，本文描述部分提到一类化合物醇，而实施例提到的具体的醇为乙醇，那么乙醇可以与描述部分的其他特征结合起来形成新的技术方案。
[0054]在本发明中，除非有相反的说明，所有的比例均为重量比，所有的百分数均为重量百分数，温度的单位为。C，压力的单位为帕。室温指实验室内常规的环境温度，随季节和位置变化，通常为25°C。另外，本发明描述的所有数值范围均包括端值并且可以包括将公开的范围的上限和下限互相任意组合得到的新的数值范围。例如，如果公开了某种组分的重量百分含量为10-30重量％，优选15~25重量％，更优选20-23重量％，则相当于同时公开了以下的数值范围:10~15重量％、10~25重量％、10^20重量％、10~23重量％、15~30重量％、15~20重量％、15~23重量％、20~25重量％、23~25重量％。
[0055]本发明的发明人在研发过程中发现，将Na2SO4和山梨醇进行复配，能获得用于脂肪酶长期保藏的稳定剂，利于脂肪酶的保藏，特别是长期保藏。
[0056]脂肪酶稳定剂
[0057]本发明提供的脂肪酶稳定剂包含=Na2SO4和山梨醇，优选的，所述Na2SO4和山梨醇的重量比为1-5:30_50。
[0058]在本发明中，“稳定剂”指的是:能稳定酶的特定物质(化合物或组合物)，特别是指在酶中加入特定化合物或组合物，(在保藏，特别是长期保藏后)酶的活性能得到很好的保持的物质。“酶的活性能得到很好的保持”指的是:与初始时的酶活相比，(在保藏，特别是长期保藏后)该酶的酶活能维持在80%以上，优选85%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，特别优选98%以上。
[0059]在本发明中，Na`2SO4和山梨醇的重量比，例如可以为但不限于:1:30，1:35，1:40，1:45，1: 50，2: 30，2: 32，2:34，2: 36，2: 38，2:40，2:42，2:44，2:46，2:48，2: 50，3: 31，3: 33，3: 35，3:37，3: 39，3:41，3:43，3:45，3:47，3:49，4:30，4: 34，4: 38，4:42，4:46，4: 50，5: 30，5:32，5:35，5:37，5:39，5:42，5:45，5:47，5:50。
[0060]在本发明的一个优选实施例中，所述脂肪酶稳定剂包含:l-5wt%Na2S04和30-50wt%山梨醇。
[0061]在本发明的一个优选实施例中，所述脂肪酶稳定剂包含:40-50被％山梨醇。优选的，所述脂肪酶稳定剂包含:3-5wt% Na2SO4和40_50wt%山梨醇。
[0062]在本发明的一个优选实施例中，使用的Na2SO4的浓度为1.0wt%, 1.lwt%, 1.2wt%,
1.3wt%，1.4wt%，1.5wt%，1.6wt%，1.7wt%，1.8wt%，1.9wt%，2.0wt%，2.lwt%，2.2wt%，2.3wt%，
2.4wt%，2.5wt%，2.6wt%，2.7wt%，2.8wt%，2.9wt%，3.0wt%，3.lwt%，3.2wt%，3.3wt%，3.4wt%，
3.5wt%，3.6wt%，3.7wt%，3.8wt%，4.9wt%，4.0wt%，4.lwt%，4.2wt%，4.3wt%，4.4wt%，4.5wt%，
4.6wt%，4.7wt%，4.8wt%，4.9wt%，5.0wt%。
[0063]在本发明的一个优选实施例中，使用的山梨醇的浓度为30wt%，3 lwt%，32wt%,33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%，41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，50wt%o
[0064]对于本领域的技术人员而言，在本发明公开的内容的基础上，对脂肪酶稳定剂中Na2SO4和山梨醇的浓度做进一步的调整，以获得合适的脂肪酶稳定剂也是可能的。如将 Na2SO4 的浓度调整为 0.1-0.9wt%，如 0.lwt%, 0.2wt%, 0.3wt%, 0.4wt%，0.5wt%，0.6wt%，
0.7wt%，0.8wt%，0.9wt%，或调整为 6_10wt%，如 6.0wt%，6.lwt%，6.2wt%，6.3wt%，6.4wt%，
6.5wt%，6.6wt%，6.7wt%，6.8wt%，6.9wt%，7.0wt%，7.lwt%，7.2wt%，7.3wt%，7.4wt%，7.5wt%，
7.6wt%，7.7wt%，7.8wt%，7.9wt%，8.0wt%，8.lwt%，8.2wt%，8.3wt%，8.4wt%，8.5wt%，8.6wt%，
8.7wt%，8.8wt%，8.9wt%，9.0wt%，9.lwt%，9.2wt%，9.3wt%，9.4wt%，9.5wt%，9.6wt%，9.7wt%，
9.8wt%，9.9wt%，10.0wt% ;或将山梨醇的浓度调整为 10_29wt%，如 10wt%，llwt%，12wt%，13wt%，14wt%，15wt%，16wt%，17wt%，18wt%，19wt%，20wt%，21wt%，22wt%，23wt%，24wt%，25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，29wt%，或调整为 51_70wt%，如 51wt%，52wt%，53wt%，54wt%，55wt%，56wt%，57wt%，58wt%，59wt%，60wt%，61wt%，62wt%，63wt%，64wt%，65wt%，66wt%，67wt%，68wt%，69wt%，70wt%o
[0065]在本发明的一个优选实施例中，所述脂肪酶稳定剂还包括:(NH4)2SO4、蔗糖、海藻糖、Dextran-ΙΟ、甘油中的一种或多种；优选的，所述(NH4)2SO4浓度为0.5_5wt%，蔗糖浓度为 25-50wt%，海藻糖浓度为 25-50wt%，Dextran-ΙΟ 浓度为 10_30wt%，甘油浓度为 25_50wt%。
[0066]在本发明的一些优选实施例中，脂肪酶稳定剂中加入了(NH4)2SO4，其加入的浓度为 0.5wt %，0.6wt %，0.7wt %，0.8wt %，0.9wt %，1.0wt %，1.1wt %，1.2wt%，1.3wt%，
1.4wt%，1.5wt%，1.6wt%，1.7wt%，1.8wt%，1.9wt%，2.0wt%，2.lwt%，2.2wt%，2.3wt%，2.4wt%，
2.5wt%，2.6wt%，2.7wt%，2.8wt%，2.9wt%，3.0wt%，3.lwt%，3.2wt%，3.3wt%，3.4wt%，3.5wt%，
3.6wt%，3.7wt%，3.8wt%，4.9wt%，4.0wt%，4.lwt%，4.2wt%，4.3wt%，4.4wt%，4.5wt%，4.6wt%，
4.7wt%，4.8wt%，4.9wt% 或 5.0wt%。
[0067]在本发明的一些优选实施例中，脂肪酶稳定剂中加入了蔗糖，其加入的浓度为 25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，29wt%，30wt%，31wt%，32wt%，33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%，41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，50wt%o
[0068]在本发明的一些优选实施例中，脂肪酶稳定剂中加入了海藻糖，其加入的浓度为 25wt%，26wt%，27wt%，28wt%,29wt%，30wt%，31wt%，32wt%，33wt%,34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%，41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，50wt%o
[0069]在本发明的一些优选实施例中，脂肪酶稳定剂中加入了 Dextran-lO，其加入的浓度为 10wt%，llwt%，12wt%，13wt%，14wt%，15wt%，16wt%，17wt%，18wt%，19wt%，20wt%，21wt%，22wt%，23wt%,24wt%,25wt%,26wt%，27wt%,28wt%，29wt%，30wt%o
[0070]在本发明的一些优选实施例中，脂肪酶稳定剂中加入了甘油，其加入的浓度为25wt %，26wt %，27wt %，28wt %，29wt %，30wt %，3 Iwt %，32wt %，33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%，41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，50wt%o
[0071]在本发明的另一些更优选的实施例中，加入了上述浓度的=(NH4)2SO4、蔗糖、海藻糖、Dextran-ΙΟ、甘油中的一种或多种。
[0072]在本发明的一个优选实施例中，用于脂肪酶溶液时，所述脂肪酶稳定剂由Na2SO4和山梨醇组成，所述溶液中，Na2SO4浓度为1_5被％和山梨醇浓度为30-50wt%。
[0073]在本发明的一个优选实施例中 ，所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶，优选的米黑根毛霉脂肪酶的序列如SEQ ID N0:1所示。
[0074]稳定的脂肪酶溶液
[0075]本发明提供的稳定的脂肪酶溶液中包含Na2SO4和山梨醇。
[0076]在本发明中，“稳定的脂肪酶溶液”指的是:将该脂肪酶溶液进行保藏，特别是长期保藏后，脂肪酶的活性能得到很好的保持。“脂肪酶的活性能得到很好的保持”指的是:与初始时的脂肪酶的酶活相比，(在保藏，特别是长期保藏后)该脂肪酶的酶活能维持在80%以上，优选85%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，特别优选98%以上。
[0077]在本发明的一个优选实施例中，所述溶液中，Na2SO4浓度为l_5wt%，所述山梨醇浓度为30-50wt%。优选的，所述山梨醇的浓度为40-50wt%，和/或所述Na2SO4浓度为3_5wt%。
[0078]在本发明的一个优选实施例中，使用的Na2SO4的浓度为1.0wt%, 1.lwt%, 1.2wt%,
1.3wt%，1.4wt%，1.5wt%，1.6wt%，1.7wt%，1.8wt%，1.9wt%，2.0wt%，2.lwt%，2.2wt%，2.3wt%，
2.4wt%，2.5wt%，2.6wt%，2.7wt%，2.8wt%，2.9wt%，3.0wt%，3.lwt%，3.2wt%，3.3wt%，3.4wt%，
3.5wt%，3.6wt%，3.7wt%，3.8wt%，4.9wt%，4.0wt%，4.lwt%，4.2wt%，4.3wt%，4.4wt%，4.5wt%，
4.6wt%，4.7wt%，4.8wt%，4.9wt%，或 5.0wt%。
[0079]在本发明的一个优选实施例中，使用的山梨醇的浓度为30wt%，3 lwt%，32wt%,33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%，41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，或 5Qwt%。
[0080]对于本领域的技术人员而言，在本发明公开的内容的基础上，对溶液中Na2SO4和山梨醇的浓度做进一步的调整，以获得合适的稳定的脂肪酶溶液也是可能的。如将Na2SO4的浓度调整为 0.1-0.9wt%，如 0.lwt%，0.2wt%，0.3wt%，0.4wt%，0.5wt%，0.6wt%，0.7wt%，0.8wt%，或 0.9wt%，或调整为 6_10wt%，如 6.0wt%，6.lwt%，6.2wt%，6.3wt%，6.4wt%，6.5wt%，
6.6wt%，6.7wt%，6.8wt%，6.9wt%，7.0wt%，7.lwt%，7.2wt%，7.3wt%，7.4wt%，7.5wt%，7.6wt%，
7.7wt%, 7.8wt%, 7.9wt%, 8.0wt%, 8.lwt%，8.2wt%, 8.3wt%, 8.4wt%, 8.5wt%, 8.6wt%, 8.7wt%,
8.8wt%，8.9wt%，9.0wt%，9.lwt%，9.2wt%，9.3wt%，9.4wt%，9.5wt%，9.6wt%，9.7wt%，9.8wt%，
9.9wt%，或 10.0wt% ;或将山梨醇的浓度调整为 10-29wt%，如 10wt%，llwt%，12wt%，13wt%，14wt%，15wt%，16wt%，17wt%，18wt%，19wt%，20wt%，21wt%，22wt%，23wt%，24wt%，25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，或 29wt%，或调整为 51_70wt%，如 51wt%，52wt%，53wt%，54wt%，55wt%，56wt%，57wt%，58wt%，59wt%，60wt%，61wt%，62wt%，63wt%，64wt%，65wt%，66wt%，67wt%，68wt%，69wt%，或 70wt%。
[0081]在本发明的一个优选实施例中，所述溶液还包括:(NH4)2SO4、蔗糖、海藻糖、Dextran-ΙΟ、甘油中的一种或多种；优选的，所述(NH4)2SO4浓度为0.5_5wt%，蔗糖浓度为25-50wt%，海藻糖浓度为 25-50wt%，Dextran-ΙΟ 浓度为 10_30wt%，甘油浓度为 25_50wt%。
[0082]在本发明的一些优选实施例中，脂肪酶溶液中可加入了(NH4)2SO4,其浓度为
0.5wt%, 0.6wt%, 0.7wt%, 0.8wt%，0.9wt%，1.0wt%，1.lwt%，1.2wt%，1.3wt%，1.4wt%，1.5wt%，
1.6wt%，1.7wt%，1.8wt%，1.9wt%，2.0wt%，2.lwt%，2.2wt%，2.3wt%，2.4wt%，2.5wt%，2.6wt%，
2.7wt%, 2.8wt%, 2.9wt%, 3.0wt%, 3.lwt%，3.2wt%, 3.3wt%, 3.4wt%, 3.5wt%, 3.6wt%, 3.7wt%,
3.8wt%，4.9wt%，4.0wt%，4.lwt%，4.2wt%，4.3wt%，4.4wt%，4.5wt%，4.6wt%，4.7wt%，4.8wt%，
4.9wt%，或 5.0wt%o
[0083]在本发明的一些优选实施例中，脂肪酶溶液中可加入蔗糖，其浓度为25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，29wt%，30wt%，31wt%，32wt%，33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%, 41wt%, 42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，或50wt%o
[0084]在本发明的一些优选实施例中，脂肪酶溶液中可加入海藻糖，其浓度为25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，29wt%，30wt%，31wt%，32wt%，33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%, 41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，或50wt%o
[0085]在本发明的一些优选实施例中，脂肪酶溶液中加入了 Dextran-10，其浓度为10wt%，11wt%,12wt%，13wt%，14wt%，15wt%，16wt%，17wt%，18wt%，19wt%，20wt%，21wt%，22wt%，23wt%，24wt%，25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，29wt%，或 30wt%。
[0086]在本发明的一些优选实施例中，脂肪酶溶液中加入了甘油，其浓度为25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，29wt%，30wt%，31wt%，32wt%，33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%, 41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，或50wt%o
[0087]在本发明的另一些更优选的实施例中，加入了上述浓度的(NH4)2SO4、蔗糖、海藻糖、Dextran-10、甘油中的一种或多种。
[0088]在本发明的一个优选实施例中，所述脂肪酶溶液的稳定剂由l_5wt%Na2S04和30-50wt%山梨醇组成。
[0089]在本发明的一个优选实施例中，所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶，优选的米黑根毛霉脂肪酶的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0090]用途
[0091]本发明提供的脂肪酶稳定剂可用于保藏脂肪酶，优选的，该脂肪酶稳定剂可用于脂肪酶的长期保藏。
[0092]对于本领域的技术人员而言，本发明提供的脂肪酶稳定剂既然可用于长期保藏脂肪酶，那么在用于脂肪酶的短期保藏中能对脂肪酶起到很好的稳定作用则是必然的。
[0093]在本发明中，“长期保藏”指的是在较低温度下保藏一段较长的时间，如在4°C条件下保藏时间6个月以上，优选I年以上，更优选18个月以上，更优选2年以上。对于本领域的技术人员，“长期保藏”后酶活的保存效果，可以通过加速试验，如高温加速试验，进行确定，如根据在40°C条件下保藏18天的酶活保存的效果，可以预测在4°C条件下，将酶(如本发明中的脂肪酶)保藏I年，甚至更长时间后，酶活的保存效果。
[0094]优点
[0095]使用本发明提供的稳定剂，在脂肪酶，特别是米黑根毛霉脂肪酶的长时间保藏中，能达到很好的稳定效果，为脂肪酶，特别是米黑根毛霉脂肪酶的保藏和进一步的应用提供了良好的基础。
[0096]在阅读了以上说明书之后，本领域技术人员可以在本领域所涵盖的范围之内对以上所述实施方式进行一定程度的改良、替代和组合，从而实施本发明并获得类似的技术效果。所有这些改良、替代和组合也都包括在本发明范围之内。
[0097]下面结合具体实施例对本发明的优选实施方式进行进一步的详细论述，以便于人们更深刻而准确地理解本发明。但是需要指出的是，以下的具体实施例仅仅是用于举例说明的目的，不会对本发明的保护范围构成任何限制，本发明的范围仅仅由权利要求书限定。
[0098]菌株
[0099]在本发明的下述实施例中，作为生产菌株使用的工程菌WILMAR-RML的构建方法如下:
[0100]按照毕赤酵母表达手册(Pichia Expression Kit, Invitrogen),在毕赤酵母GS115 (购自Invitrogen)中，转入米黑根毛霉脂肪酶基因RML (序列如SEQ IDN0:1所示)。
[0101]原料
[0102]在本发明的下述实施例中，使用的试剂均购自BBI。
[0103]设备
[0104]在本发明的下述实施例中，微滤和超滤步骤在切向流超滤系统中进行，该切向流超滤系统购自美国PALL公司。
[0105]检测方法
[0106]在本发明的下述实施例中，
[0107] 酶活力的定义为:40°C，每分钟催化底物释放出Iymol脂肪酸所需的酶量，定义为一个酶活单位。
[0108]酶活计算公式:
[0109]
【权利要求】
1.一种脂肪酶稳定剂，其特征在于，所述脂肪酶稳定剂包含=Na2SO4和山梨醇，优选的，所述Na2SO4和山梨醇的重量比为1-5:30-50。
2.如权利要求1所述的脂肪酶稳定剂，其特征在于，所述脂肪酶稳定剂为脂肪酶溶液稳定剂。
3.如权利要求1所述的脂肪酶稳定剂，其特征在于，用于脂肪酶溶液时，所述Na2SO4浓度为l_5wt%，所述山梨醇浓度为30-50wt%。
4.如权利要求3所述的脂肪酶稳定剂，其特征在于，所述山梨醇浓度为40-50wt%。
5.如权利要求3所述的脂肪酶稳定剂，其特征在于，所述Na2SO4浓度为3-5wt%。
6.如权利要求1所述的脂肪酶稳定剂，其特征在于，所述脂肪酶稳定剂中还包括:(NH4)2S04、鹿糖、海藻糖、Dextran-10、甘油中的一种或多种。
7.如权利要求6所述的脂肪酶稳定剂，其特征在于，用于脂肪酶溶液时， 所述(NH4)2SO4的浓度为0.5-5wt% ;和/或 所述蔗糖的浓度为25-50wt% ;和/或 所述海藻糖的浓度为25-50wt% ;和/或 所述Dextran-1O的浓度为10_30wt% ;和/或 所述甘油的浓度为25-50wt%。
8.如权利要求1-7中任一项所述的脂肪酶稳定剂，其特征在于，所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶。
9.如权利要求8所述的脂肪酶稳定剂，其特征在于，所述米黑根毛霉脂肪酶的序列如SEQ ID NO:1 所示。
10.一种稳定的脂肪酶溶液，其特征在于，所述溶液中包含Na2SO4和山梨醇。
11.如权利要求10所述的溶液，其特征在于，所述Na2SO4浓度为l_5wt%，所述山梨醇浓度为 30_50wt%。
12.如权利要求11所述的溶液，其特征在于，所述山梨醇的浓度为40-50wt%。
13.如权利要求11所述的溶液，其特征在于，所述Na2SO4浓度为3_5wt%。
14.如权利要求10所述的溶液，其特征在于，所述溶液中还包括:(NH4)2SO4、蔗糖、海藻糖、Dextran-10、甘油中的一种或多种；优选的， 所述(NH4)2SO4浓度为0.5-5wt% ;和/或 所述蔗糖的浓度为25-50wt% ;和/或 所述海藻糖的浓度为25-50wt% ;和/或 所述Dextran-1O的浓度为10_30wt% ;和/或 所述甘油的浓度为25-50wt%。
15.如权利要求10-14中任一项所述的溶液，其特征在于，所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶。
16.如权利要求15所述的溶液，其特征在于，所述米黑根毛霉脂肪酶的序列如SEQIDNO:1所示。
17.一种稳定脂肪酶的方法，其特征在于，在所述脂肪酶中加入权利要求1-9中任一项所述的稳定剂。
18.权利要求1-9中任一项所述的脂肪酶稳定剂用于保藏脂肪酶的用途，优选的，所述保藏 为长期保藏。
【文档编号】C12N9/96GK103773751SQ201210405053
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月22日 优先权日:2012年10月22日
【发明者】顾思天, 关惠琴, 高霓思, 常桂芳 申请人:丰益(上海)生物技术研发中心有限公司