一种高效培养含油微生物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效培养含油微生物的方法，包括：（1）培养含油酵母种子液；（2）培养自养微藻种子液；（3）将含油酵母种子液和自养微藻种子液接入具有内置膜分离装置的封闭式光生物反应器内进行半混合培养，含油酵母在膜分离装置内部培养，自养微藻在膜分离装置以外的光生物反应器内进行光合作用生长，两个反应器内培养基组成和培养条件一致，培养过程中补充含油酵母细胞生长代谢所需的有机碳源。该法将自养微藻与含油酵母在封闭式光生物反应器中进行半混合培养，具有提高自养微藻和含油酵母细胞收获量，提高无机碳源（CO2）的利用率，提高微生物油脂含量，简化培养装置等优点。
【专利说明】一种高效培养含油微生物的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种高效培养含油微生物的方法，具体地说涉及半混合培养自养微藻和含油酵母来获取高微生物细胞收获量，同时提高微生物细胞油脂含量的方法。
【背景技术】
[0002]随着经济发展，石油资源的日益紧缺、油品供需矛盾的日渐突出，相应环境污染问题也更加突出，多渠道开发可再生资源成为必然。以微生物油脂等可再生资源为来源的柴油具有能量密度高、含硫量低、燃烧充分、润滑性好等性能，还具有可再生、环境友好、易生物降解、储运安全、抗爆性能好等特点，可作为石化能源的替代品。
[0003]文献表明，在适宜的条件下，某些微生物生产并贮存的油脂占其生物总量的20%以上，这类微生物被称为含油微生物，已知细菌、酵母、霉菌、藻类中都有生产油脂的微生物。微生物油脂又称单细胞油脂，其脂肪酸组成与一般的植物油脂相似，以C16、C18系脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸等饱和与不饱和的脂肪酸为主。微生物发酵利用底物范围较广，可直接利用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉和纤维素水解液等，不但可以提供新的油脂生产方法，而且可以利用廉价废弃生物质，降低油脂生产成本，保护环境。因此，微生物油脂是潜在的动植物油脂替代资源，具有广阔的应用前景。
[0004]微生物油脂的制备一般采用酵母菌为发酵菌种，首先经过常规的微生物培养进行生物量积累，得到含油微生物菌体，进而处理该菌体，得到微生物油脂。CN200610113582.X公开了一种利用微生物发酵油脂制备生物柴油的方法，即以酵母菌为微生物产油脂菌种，通过在产油脂菌种培养基中接入该酵母菌微生物，在一定的培养条件下进行微生物发酵制备油脂，然后经离心、分离、提取得到微生物发酵油脂，以该微生物油脂为原料，在催化剂作用下进行转酯化反应，得到生物柴油，副产物为甘油。该技术过程采用单一微生物发酵培养过程，其生物油脂积累在细胞`内，细胞收获量是制约油脂收获量的关键因素。
[0005]除了含油酵母外，微藻是另外一类含油微生物，微藻富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸等营养成分(如螺旋藻)，可用于食品、医药和能源方面；可以大量积累脂肪酸，有些微藻如小球藻，其体内脂肪酸含量可占干重的30%~60%。利用培养微藻来积累油脂资源，已经成为目前利用太阳能开发可再生资源最热门的研究领域，不仅具有强大的市场潜力，而且具有非凡的社会价值。
[0006]微藻细胞的生长方式一般为光自养和碳源异养两种，光自养过程要消耗CO2, CO2的有效利用吸收，是实现理想培养效果的关键，同时存在补充CO2与光合作用产生O2的解吸、排出的问题。CN200410020978.0和CN03128138.9均采用在光生物反应器系统中加入一种装置方法，来实现CO2的补给，同时也能实现一定的氧的解析效果。碳源异养过程是利用有机碳源为底物替代自养过程中的CO2来进行微藻生物质的积累，细胞生长速度较快，但细胞内油脂积累水平却比较低下。
[0007]现有技术虽然对含油酵母和自养微藻生产微生物油脂都有所涉及，但都是含油微生物各自进行单独培养，对于不同类型的含油微生物之间的混合协同培养方式来实现高效油脂收获等方面的研究较少。在培养过程中普遍存在着成本高、微生物细胞累积慢、油脂含量低等不足。CN200910237936.5公开了一种混合培养酵母和藻类生产油脂的方法，该方法利用工业废水为培养基，混合培养酵母和藻类，生产微生物油脂。但是，由于酵母和藻类的混合培养均是异养培养，细胞内油脂积累水平较低；并且两种细胞一起收获和提取油脂，由于油脂提取的方法不同，破壁要求不同，混在一块效果不佳。
【发明内容】
[0008]针对现有技术的不足，本发明提供一种高效培养含油微生物的方法。该法将自养微藻与含油酵母在封闭式光生物反应器中进行半混合培养，具有提高自养微藻和含油酵母细胞收获量，提高无机碳源(CO2)的利用率，提高微生物油脂含量，简化培养装置等优点。
[0009]本发明高效培养含油微生物的方法，包括如下内容:
(1)培养含油酵母种子液；
(2)培养自养微藻种子液；
(3)将含油酵母种子液和自养微藻种子液接入具有内置膜分离装置的封闭式光生物反应器内进行半混合培养，含油酵母在膜分离装置内部培养，自养微藻在膜分离装置以外的光生物反应器内进行光合作用生长，两个反应器内培养基组成和培养条件一致，培养过程中补充含油酵母细胞生长代谢所需的有机碳源。
[0010]本发明中，所述的光生 物反应器还包括导流筒，膜分离装置内置于光生物反应器导流筒内，出口与光生物反应器出口平齐。膜分离装置可以采用各种具有膜分离功能的膜装置，优选采用陶瓷膜分离装置，膜孔直径为0.05 μ m~0.5 μ m，将含油酵母细胞与自养微藻细胞分隔开来。
[0011]本发明中，含油酵母包括酿酒酵母(5: cererisiae)、粘红酵母(TP.glutinis、、故状丝孢酵母(rricAospoma cu taneum)等,有机碳源为葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素水解液等。含油酵母种子液培养是本领域技术人员熟知的方法，如采用搅拌式生物反应器，加入培养基和含油酵母，在适宜的条件下进行培养。
[0012]本发明中，自养微藻包括小球藻、葡萄藻、小环藻、娃藻等，自养微藻种子液培养是本领域技术人员熟知的方法，如采用常规的气升式光生物反应器进行种子液培养。
[0013]本发明中，半混合培养过程中，含油酵母种子液与自养微藻种子液的初始接入体积比为1:1~1:10。半混合培养的初始培养基采用含油酵母所需的培养基，同时添加自养微藻生长所需的无机盐和微量元素(如按SE培养基的组成添加相关物质)等。半混合培养过程中，以批次或连续等方式补充含油酵母生长过程所需的有机碳源。
[0014]本发明中，半混合培养条件一般采用与含油酵母生长过程的条件相似的条件，如温度一般为20°C~37°C，pH值一般为6~9，优选为6.5~7.5等。
[0015]本发明方法将含油酵母和自养微藻进行半混合培养，含油酵母与自养微藻的生长条件和所需碳源不同，互相补充和促进。自养微藻利用含油酵母发酵后废弃碳源(0)2)为自身生长碳源，同时维持系统较平稳的渗透压条件(pH值)，通过补充有机碳源保证含油酵母不断生长。含油酵母与自养微藻通过膜分离装置实现各自单独的生长空间，培养基组成则是实现共混与互通，微藻对发酵过程使用的碳源具有耐受性，不影响微藻的生长和油脂的积累，并对含油酵母的发酵过程不存在影响，可以同时获得所需的含油酵母细胞，从而实现含油酵母与自养微藻的半混合培养过程。
[0016]本发明方法选择适宜种类的含油酵母和适宜种类的自养微藻，通过控制含油酵母和自养微藻的培养过程，使两者形成稳定的半混合培养体系，并建立起不同细胞间共同利用环境营养条件而细胞间不互相干扰的生长关系，实现了含油微生物的高效生长过程，提高了油脂的累积效果，并提高了单一含油微生物培养过程中单位发酵体系内的油脂收获量，从而为微生物油脂的制备奠定了基础。并且，由于油脂提取的方法不同，破壁要求不同，两种细胞分别收获和提取油脂，效果更佳。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是本发明一种具体工艺流程示意图。
[0018]其中:1_含油酵母种子，2-自养微藻种子，3-含油酵母种子液培养反应器，4-自养微藻种子液培养反应器，5-含油酵母种子液接种管线，6-自养微藻种子液接种管线，7-膜分离装置，8-封闭式光生物反应器，9-混合培养基及酸碱中和剂进入管线，10-导流筒，11-进气口，12-尾气出口。
【具体实施方式】
[0019]本发明高效培养含油微生物的方法，具体包括如下内容:半混合培养之前，两种含油微生物单独进行种子液培养，采用搅拌式生物反应器进行含油酵母种子液培养，采用光生物反应器进行自养微藻种子液培养，搅拌式生物反应器内包括含油酵母和含油酵母发酵培养基，光生物反应器内包括自养微藻和自养SE培养基。种子液培养合格后，分别经过各自的接种管线转移到培养含油酵母的内置膜分离装置中和培养自养微藻的封闭式光生物反应器中，并加入经过无菌处理的混合培养基营养成分和酸碱中和剂调节至半混合培养所需生长条件。其中混合培养基中的有机碳源用于含油酵母生长，而含油酵母生长所产生的CO2用于自养微藻生长。含油酵母种子液与自养微藻种子液接种体积比例为1:1~1:10。接种后半混合培养体系通过正常PH控制、温度控制和通气量等控制培养过程。其中半混合培养时有机碳源优选采用流加方式进行，其被含油酵母利用生长，含油酵母生长后产生较多的CO2，排出细胞外进入培养系统中。由于含油酵母排出的CO2处于溶解状态，因此可以立即通过膜孔隙传递到光生物反应器内被混合培养基系统中的自养微藻利用，作为微藻生长的碳源供应。
[0020]下面通过附图进一步说明本发明的详细工艺过程。如图1所示，含油酵母种子I经含油酵母种子液培养反应器3培养生长达生物量OD值为5.0~15.0 ；自养微藻种子2经自养微藻种子液培养反应器4培养生长达生物量OD值为2.0~10.0。将培养好的含油酵母种子液由接种管线5、自养微藻种子液由接种管线6分别转接到内置的膜分离装置7和封闭式光生物反应器8中进行半混合培养，并将混合培养基及酸碱中和剂9加入膜分离装置和光生物反应器中进行混合，同时经过检测分析混合后培养系统中PH值来调节混合培养液的pH至6.5~7.5 。气体由进气口 11进入反应体系内，利用三通分别通入膜分离装置7和导流筒10内侧，从而实现向膜分离装置和光生物反应器内的供气需要，通入的气体统一由尾气出口 12排出整个反应体系。[0021]本发明中，含油酵母在有机碳源条件下实现快速生长，含油酵母消耗有机碳源，生成细胞生物质和各种代谢产物，细胞生物质由于体形较大而被膜截留在膜分离装置内部，同时发酵产生CO2气体排出细胞外后经过膜孔隙传递到整个混合培养基系统中，使培养体系内无机碳源含量增加，自养微藻利用这些无机碳源进行光合作用，获得微藻自身的生长。同时，含油酵母发酵使系统的PH值下降，而随着微藻的生长，利用溶解的C02，使系统的pH值上升，两者互为作用，调节系统的PH处于适宜范围。
[0022]本发明中，光生物反应器可以是板式、管式、气升搅拌式等封闭式反应器，可以通入的氮气或含二氧化碳气体和导流筒作用形成返混状态。光生物反应器的其它操作条件按常规的酵母和微藻培养条件控制。可以设置培养体系二氧化碳和溶解氧量的测定装置，根据需要调整通气量，以获得良好的效果。同时提供PH电极检测，以便通过外源加入酸、碱来实现系统PH的控制。
[0023]本发明中，pH控制酸中和剂为此1為504、順03等常用的无机酸，碱中和剂为NaOH、NaHC03、KOH、Ca (OH) 2、氨水等常用的无机碱。
[0024]本发明中，半混合培养过程温度控制为内部盘管加热方式。
[0025]本发明中，半混合培养中，向膜分离装置和光生物反应器内可以通入氮气或含二氧化碳的气体。通气管线进入光生物反应器后以三通形式存在，其中一条支路通入膜分离装置中，出口引出整个反应器；其余两条支路分别通入两侧的导流筒内侧区域，实现通气导流作用，使膜分离装置之外的光生物反应器内反应液可以进行混合均匀。通入气体量随培养液体积变化而变化，通入气体体积速率与培养系统装液体积比例为0.1vvm~1.0vvm(单位液体体积每分钟通入的单位气体量)。
[0026]本发明中,所用的光生物反应器内培养基为含油酵母和自养微藻所需的混合培养基，可以提供含油酵母生长所需营养物质，也提供自养微藻光合生长所需营养成份，两种细胞通过膜分离装置被分隔开来，实现各自单独的生长空间，减弱不同细胞间生态影响，同时也为各自细胞的收获提供了方便。含油酵母利用其适宜的培养基，其中碳源为有机碳源，进行生长，获得生物量的增长，部分有机碳源通过发酵过程呼吸生成CO2,含油酵母所生成的CO2在培养体系中作为自养微藻进行光合作用的碳源，从而获得微藻细胞的生长。
[0027]本发明中，含油酵母所需的有机碳源可以是葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素水解液等，该有机碳源的加入采用流加补充方式进行，根据培养液样品成份分析，随时检测系统的有机碳源浓度水平，将配制好的有机碳源母液按消耗速度进行流加。
[0028]本发明中，半混合培养过程培养基的初始有机碳源浓度(以有机物质量浓度计，下同)为1.0%~5.0%，培养过程中通过含油酵母生长消耗，有机碳源经过补加泵进行不断补加，维持有机碳源浓度在1.0%~2.0%。
[0029]本发明中，含油酵母种子液的培养基采用其适用的含油酵母培养基，自养微藻种子液的培养基采用微藻SE培养基。半混合培养过程采用含油酵母培养基和微藻SE培养基相结合，包括有机碳源、无机盐和微量元素等成份，成为混合培养基。优选的培养条件为:种子液接种量(占光生物反应器的体积):5%~20%，温度:25°C~30°C，通气量:0.1vvm~1.0vvm,揽拌转速:1OOrpm ~400rpm,时间:24h ~120h。
[0030]方案1(比较例)
将粘红酵母(中国微生物菌种保藏中心提供)在300mL摇瓶中进行培养，所用培养基为粘红酵母PDA培养基，培养20h后得到所需种子液，OD值为12.0左右。将培养的含油酵母种子液接入含混合培养基的20L封闭式光生物反应器中内置的IOL陶瓷膜分离装置内，膜孔直径为0.1 μ m。光生物反应器为气升搅拌式，可以实现培养液的返混；反应器为玻璃体，反应器内有温度控制盘管，以及pH、O2和CO2传感器。
[0031]含油酵母所需的PDA培养基配方(以每升计):葡萄糖20.0g，马铃薯液lOOOmL，pH自然。其中马铃薯营养液的制作:将200g马铃薯切成小块后煮沸20~40分钟，多层纱布过滤，定容至lOOOmL。
[0032]自养微藻所需的SE培养基配方(以每升计):
【权利要求】
1.一种高效培养含油微生物的方法，包括如下内容: (1)培养含油酵母种子液； (2)培养自养微藻种子液； (3)将含油酵母种子液和自养微藻种子液接入具有内置膜分离装置的封闭式光生物反应器内进行半混合培养，含油酵母在膜分离装置内部培养，自养微藻在膜分离装置以外的光生物反应器内进行光合作用生长，两个反应器内培养基组成和培养条件一致，培养过程中补充含油酵母细胞生长代谢所需有机碳源。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的光生物反应器还包括导流筒，膜分离装置内置于光生物反应器导流筒内，出口与光生物反应器出口平齐。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于:膜分离装置采用陶瓷膜分离装置，膜孔直径为0.05 μ m~0.5 μ m。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:含油酵母包括酿酒酵母(5:cerevisiae),粘红酵母iR.glutinis )或皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum ),有机碳源为葡萄糖、果糖、淀粉或纤维素水解液。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:自养微藻包括小球藻、葡萄藻、小环藻或娃藻。
6.按照权利要 求1、4或5所述的方法，其特征在于:半混合培养过程中，含油酵母种子液与自养微藻种子液的初始接入体积比为1:1~1:10。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:半混合培养的初始培养基采用含油酵母所需的培养基，同时添加自养微藻生长所需的无机盐和微量元素。
8.按照权利要求1、4或7所述的方法，其特征在于:半混合培养过程中，以批次或连续方式补充含油酵母生长过程所需的有机碳源。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:半混合培养条件为:温度为20°C~37°C，pH值为6~9。
10.按照权利要求8所述的方法，其特征在于:培养基的初始有机碳源浓度(以有机物质量浓度计，下同)为1.0%~5.0%，培养过程中维持有机碳源浓度在1.0%~2.0%。
【文档编号】C12N1/18GK103773694SQ201210404186
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月23日 优先权日:2012年10月23日
【发明者】王领民, 金平, 廖莎, 吴丹, 李晓姝, 师文静, 张霖, 高大成, 乔凯, 程国香 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院