专利名称：一种l-叔亮氨酸的生产方法
技术领域：
本发明适用于生物制药和生物化工技术领域，尤其涉及一种L-叔亮氨酸的生产方法。
背景技术：
非天然氨基酸及其衍生物是重要的化工中间体。其中，L-叔亮氨酸是一种重要的非天然氨基酸。它可以用于合成医药中间体，及作为不对称合成的手性诱导剂和不对称拆分的拆分试剂，是合成多种抗艾滋病药物和肝炎病毒抑制剂等药物的手性前体。随着我国社会经济的发展和环境保护意识的增强，医药化工行业不但需要提高L-叔亮氨酸的生产能力，而且需要创造绿色无污染的生产工艺。因此，利用酶法进行生物转化生产L-叔亮氨酸正越来越受到相关机构的重视。从生产路线上划分，生产L-叔亮氨酸的方法主要有化学试剂拆分法，手性源合成法，化学合成法和生物转化法。其中拆分法受到得率限制，手性源法受到天然产物产能的限制，化学合成法成本较高，因此其它合成方法并无成功大规模应用的实例，生物转化法目前已经成为生产L-叔亮氨酸的主要方法。生物转化法中，利用脂肪酶拆分消旋体DL-叔亮氨酸的相关工艺研究较多，如中国专利CN201010210770. 0等，但是该路线存在着与化学拆分法同样的缺陷，即收率难以超过50%。因此，目前生物法的主要研究方向均集中于利用L-亮氨酸脱氢酶从三甲基丙酮酸还原为L-叔亮氨酸的路线，并利用甲酸脱氢酶原位再生辅酶NADH，利用甲酸铵提供氨分子和氢原子。早在上世纪九十年代德国的Degussa公司就利用该路线与超滤膜反应器结合，生产L-叔亮氨酸。该路线已经有数个专利申请公开，如中国专利CN201110116253. 1，CN201110277030. 3等，其存在的主要问题如下1.目前公开的专利中，反应起始底物浓度为10-15%。事实上，学术界公认的L-叔亮氨酸脱氢酶在底物浓度过高时会受到显著的底物抑制，反应速率急剧下降(Enzyme Catalysis in Organic Synthesis Edition
I,Wiley, 1186)，在高氨浓度的条件下，过量的底物和生成的产物累积都会形成副产物(Biocatalysis 1994，10: 37-47; J. Mol. Catal: B 1998，5: 1-11) 可见，以上专利的方法是低效率的，或是难以重复的；2.酶投料量过多。显而易见的，这是问题I的必然结果。例如专利CN201110116253. I中，昂贵的辅酶NAD投料量达到底物的l%(w/w)，经济性差，专利CN201110277030. 3中整细胞催化剂占反应体系的浓度为80%(4g/5 mL) ；3.无明确的后提取工艺。同样由于问题I的存在，其得率和收率均不能满足工业化生产的需要。基于以上三点，目前尚未见利用该方法规模化生产L-叔亮氨酸的报道。
发明内容
为解决以上问题，本发明的目的在于提供一种酶法合成L-叔亮氨酸的方法。该方法制备条件温和，环境友好，收率高，成本低，适用于工业化生产。为实现上述目的，本发明提供的技术方案是一种L-叔亮氨酸的生产方法，所述方法利用L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶生产L-叔亮氨酸，其制备反应方程式为
权利要求
1.一种L-叔亮氨酸的生产方法，其特征在于，所述方法利用L-亮氨酸脱 氢酶和甲酸脱氢酶酶法合成L-叔亮氨酸。
2.根据权利要求I所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)称量一定量L-亮氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶，NAD于2000mL三口瓶中，加入200 mL5.0 mol/L甲酸铵水溶液，430 mL去离子水，150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液包含底物40 g，装置搭建完成，温度达到预定值后，启动机械搅拌，开始反应计时，维持反应体系在一定温度; (2)补料流程反应开始后，2小时补加150mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液包括底物40g，4小时补加70 mL包括底物20 g ； (3)反应过程利用HPLC-MS和HPLC监测反应，至24小时底物完全转化为产物，加热反应液至60°C，1-2小时后加入硅藻土过滤，得到产物溶液，旋转蒸发去除水得到固体粗产品; (4)加入200mL甲醇洗涤两次，取甲醇洗涤液蒸干，得到精制产品。
3.根据权利要求2所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(I)中，L-亮氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶的总投料量不超过底物质量的4%，辅酶NAD投料量不超过底物质量的O. 2%ο
4.根据权利要求2所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(I)中，温度达到预定值具体为36°C，反应过程维持反应体系温度为35°C -37°C。
5.根据权利要求2所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(I)、⑵中，所述底物分子结构式为
6.根据权利要求2所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(3)中反应过程用HPLC-MS和HPLC监测反应进度，具体通过监测底物
全文摘要
本发明涉及生物制药和生物化工领域，具体涉及一种L-叔亮氨酸的生产方法，所述方法由L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶酶法合成L-叔亮氨酸。酶催化步骤中酶投料量为底物的4%(w/w)，辅酶投料量为底物的0.2%(w/w)，时空产率为100g/d/L，产品纯度>98%，光学纯度>99%。本发明与传统的制备工艺相比，有效减少了催化剂酶的用量，产品纯度高、产率高，工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产，产品可广泛应用于化工中间体和医药中间体。
文档编号C12P13/04GK102978251SQ20121050808
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者王海艳, 鞠鑫, 李斌, 唐圆圆, 张超 申请人:苏州汉酶生物技术有限公司