新型抗狂犬病毒糖蛋白人源基因工程抗体的制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及抗狂犬病毒的单链抗体及其表达载体和表达细胞，以及所述单链抗体在制备狂犬病毒抗原诊断剂、狂犬病预防剂和/或治疗剂中的用途。优选地，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示。
【专利说明】新型抗狂犬病毒糖蛋白人源基因工程抗体的制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗狂犬病毒糖蛋白人源基因工程抗体的制备与应用。具体地，本发明涉及抗狂犬病毒糖蛋白G的单链抗体的制备与应用。
【背景技术】
[0002]狂犬病，是由狂犬病毒感染引起的人畜共患急性传染病。狂犬病潜伏期可以从几天至数年，病情极为凶险，病死率高达100%。人类狂犬病主要是通过患狂犬病动物的咬伤、抓伤或被动物舔了破损的黏膜引起的感染，传染源极为广泛，主要传染源为犬，其次为猫，因此预防控制难度大。目前，全球狂犬病病例接近5万，主要分布在亚洲。我国几乎各省都有狂犬病的病例发生。上个世纪从70年代至80年代初，由于我国对犬的控制措施不力和疫苗供应严重不足，造成狂犬病病例每年持续高达5000-7000人之多。此后全国各地加大了对犬的管理力度，且细胞疫苗大量生产确保供应，使狂犬病的疫情逐年下降，到1996年降至159例。但是，1997年开始回升到222例，此后每年以高比例的速度快速回升。其主要原因是进入90年代中期后，我国城市居民喜欢将犬、猫作为宠物引入家庭，加之对家养动物的许多管理制度和措施不够完善，使狂犬病疫情逐年回升，居高不下，2008年2373人死于狂犬病、2009年2131人死于狂犬病，至今全国狂犬病病死率仍居法定传染病前列。
[0003]到目前为止，疫苗和抗体仍然是预防与治疗狂犬病的最有效的手段。而在暴露后治疗中，在疫苗刺激肌体产生有效的保护之前，被动免疫血清或抗体显得尤为重要。狂犬病暴露后预防，WHO推荐的处理方法是全程注射狂犬病疫苗，同时注射抗狂犬病马血清(ERIG)或抗狂犬病人血清(HRIG)。国外的代表性产品是法国巴斯德的ERIG PMC和MOGAMRABIES-HT ；Bayer公司 生产的BayRab (HRIG)。在国内有国药成都生物制品研究所与武汉生物制品研究所生产的ERIG，血液制品生产企业有一定量的HRIG。
[0004]但是，抗狂犬病人血清的生产因为血源受限制价格昂贵，产量有限，并且人免疫球蛋白也存在潜在血源携带病原体的可能性。马血清制品比较容易发生严重的超敏反应，虽然巴斯德在降低马血清的过敏原性方面做了一些工作，包括在制备过程中加入纯化与病毒灭活步骤，但是超敏反应也还时有发生。
[0005]国际国内的研究表明，有必要用单克隆抗体取代狂犬病毒暴露后使用的血源抗体。1990年,B.Dietzschold利用细胞融合技术制备多株人单克隆抗体,发现一株能特异结合狂犬病毒G蛋白的抗体Mab57，其能高效广泛地中和狂犬病毒并且对狂犬病毒攻击的实验室啮齿类动物有保护作用(J Virol.，1990，64(6):3087-3090)，针对的是狂犬病毒蛋白G的226-231位氨基酸序列。另外，马萨诸塞大学与美国疾病预防控制中心共有的美国授权专利7，727，532(对应中国专利申请CN101133158A)还公开了人抗狂犬病单克隆抗体17C7株，其在印度已经进入II期临床。17C7株单抗是针对狂犬病毒蛋白基因的336-342位氨基酸序列。
[0006]为了大量制得单克隆抗体，B.Dietzschold等将Mab57基因转入SPBN重组病毒表达系统，在BSR细胞中制备了 S057 抗体(J ImmunolMethods, 2001, 252 (1-2) =199-206)。但该方法的稳定性差，操作烦琐，难以实现产业化。因此需要大规模生产单克隆抗体。
[0007]另外，用哺乳动物细胞生产单克隆抗体的生产过程染菌风险大、难以形成大规模生产。培养过程添加的血清也是潜在的污染源，无血清培养基价格昂贵。尽管人源单克隆抗体相对比较安全，但是由于不同人群的抗体有同种型的差异而且是150KD的分子量相对较大的蛋白，有针对单克隆抗体产生免疫反应的可能，从而降低单抗的治疗效果(JMAbs.2009 =332-338)。再者，单克隆抗体的全抗体有Fe片段，作检测试剂有非特异性吸附，产生的本底高。
[0008]因此，需要开发一种能大规模生成、经济实惠且安全有效的狂犬病治疗制剂。
【发明内容】
[0009]本发明人意外地发现，通过用原核细胞例如大肠杆菌表达人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体，可以实现该单链抗体的高效表达，表达产物具有很高的中和狂犬病毒糖蛋白的活性，从而为大规模、经济且安全地生产狂犬病毒诊断剂、狂犬病治疗剂和/或预防剂提供了另一种途径。
[0010]因此，在本发明第一方面，提供了一种抗狂犬病毒的单链抗体，其特征在于包含由连接肽序列连接的(I)SEQ ID NO:1所示重链可变区氨基酸序列或与其具有至少90%同源性且能够结合狂犬病毒G蛋白抗原的序列，以及(2)SEQ ID NO:2所示轻链可变区氨基酸序列或与其具有至少90%同源性且能够结合狂犬病毒G蛋白抗原的序列，或者由上述序列组成。
[0011]在一个实施方案中，(I)的序列连接于所述连接肽的N端或者C端，而(2)的序列连接于所述连接肽的另一端。本发明单链抗体中的连接肽通常为长度为至少12个氨基酸残基的序列，且存在于该抗体中的连接肽序列不会降低该抗体中重链可变区和轻链可变区部分的活性。在本发明的一个实施方案中，所述连接肽的氨基酸序列为(Gly4Ser)n，其中η为合适的整数，优选地，η为选自3-5的整数，特别优选地，η为4。所述连接肽也可以为其他氨基酸序列，作为一个实例，所述连`接肽的氨基酸序列为AKTTAPSVYPLA。同样，对于上述连接肽的氨基酸序列，可以对其中的一个或多个氨基酸残基进行置换、缺失、添加和/或修饰的改造，改造后的氨基酸序列仍可作为连接肽用于本发明的单链抗体中。在这个意义上，例如(Gly4Ser)3或(Gly4Ser)5可以认为是(Gly4Ser)4经氨基酸残基改造后获得的连接肽序列。
[0012]在优选的实施方案中，与SEQ ID NO:1所示重链可变区氨基酸序列的同源性可以为例如至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。
[0013]在优选的实施方案中，与SEQ ID NO:2所示轻链可变区氨基酸序列的同源性可以为例如至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。
[0014]在一个优选的实施方案中，上述单链抗体包含由连接肽连接的SEQ ID N0:1所示重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:2所示轻链可变区氨基酸序列，或者仅由所述序列组成。
[0015]在一个具体的实施方案中，所述单链抗体包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成。
[0016]在本发明第二方面，提供了一种核酸分子，其编码本发明第一方面的单链抗体。[0017]在一个优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:5-10所示核酸序列或者由所述序列组成。在一个更优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:7或8所示核酸序列或者由所述序列组成。
[0018]在本发明第三方面，提供了一种载体，其包含本发明第二方面的的核酸分子。
[0019]在这一方面，所述载体可以是例如pET20b、pET26b、pBV220、pRSET B等，但优选为质粒载体pET20b。
[0020]在本发明第四方面，提供了一种表达细胞，其包含本发明第三方面的载体。
[0021]所述表达细胞优选为原核细胞，例如大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞。优选地，所述表达细胞为大肠杆菌细胞。
[0022]在本发明第五方面，提供了本发明第一方面的单链抗体在制备狂犬病毒抗原诊断剂中的用途。优选地，所述单链抗体为SEQ ID NO:3所示的单链抗体。
[0023]在本发明第六方面，提供了本发明第一方面的单链抗体在制备狂犬病毒抗原预防剂中的用途。优选地，所述单链抗体为SEQ ID NO:3所示的单链抗体。
[0024]在本发明第七方面，提供了本发明第一方面的单链抗体在制备狂犬病毒抗原治疗剂中的用途。优选地，所述单链抗体为SEQ ID NO:3所示的单链抗体。
[0025]通过用原核细胞例如大肠杆菌来进行表达，可以实现本发明抗体的成功表达。另外，通过对其抗原结合特异性以及中和活性的研究，发现所表达的抗狂犬病毒单链抗体能够特异性地结合狂犬病毒抗原并且实现对抗原的中和作用。
[0026]根据大肠杆菌偏 爱的密码子对抗体基因的重链可变区，轻链可变区的抗体基因序列进行优化，发现优化后的基因序列克隆后能高效表达，单链抗体结构比较稳定、且体外中和活性和体内保护性接近现有人抗狂犬病毒免疫球蛋白水平。
[0027]本发明的抗狂犬病毒单链抗体是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段，大小为完整抗体的六分之一，易渗透肌体组织，增加药物治疗浓度，没有Fe片段，不易发生超敏反应。
[0028]本发明的抗狂犬病毒单链抗体本身也是单克隆抗体，且没有Fe片段，可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，作为检测试剂可以降低本底。
[0029]本发明的抗狂犬病毒单链抗体易于基因操作和基因工程大量生产。具体地，本发明的抗体在原核细胞例如大肠杆菌中大量表达常会形成大量的无活性的聚集体，即为包含体，易与可溶杂蛋白分离；与可溶性的蛋白质相比，有产物浓度高，不易被宿主蛋白酶降解，对宿主细胞毒性低等优势。
[0030]本发明涉及的包含体复性率较高，与狂犬病毒糖蛋白结合能力强，对狂犬病毒中和能力强，因此可以用于狂犬病的预防和治疗。
[0031]最后，本发明的人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体与其它抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体可以联合使用。具体地，本发明涉及一种组合物，其包含本发明的人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体与FV 57，用于预防或治疗狂犬病。本发明还涉及所述组合物在制备狂犬病毒抗原诊断剂、狂犬病预防剂或狂犬病治疗剂中的用途。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为FV KW 01基因的扩增模式图。[0033]图2为质粒pET20b的图谱。
[0034]图3为质粒pET20b_FV Kff 01的酶切鉴定图。
[0035]图4为经IPTG诱导和未经IPTG诱导的FV KffOl蛋白表达的电泳图。
[0036]图5为FV KW 01蛋白在变性条件下的亲和层析图。
[0037]图6为流穿液和各洗脱级分的电泳图。
[0038]图7示出人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体FV KffOl⑶的特异性抗原结合活性。其中，纵坐标为OD45tl值。
[0039]图8示出本发明人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体FV KffOl中和病毒的活性。
[0040]图9示出FV KffOl与0.2,0.4,0.6和0.8IU/ml的灭活狂犬病毒抗原反应的相关
性图谱。
[0041]图10示出人源狂犬病毒糖蛋白单链抗体FV KffOl在动物水平中和活性的研究结
果O
[0042]图11示出人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体FV KffOl与FV57联合使用在动物水平中和活性的研究结果。
[0043]图12示出人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体FV KffOl的暴露后免疫即治疗效果的研究结果。序列说明·
[0044]SEQ ID NO:1为单链抗体FV KffOl的重链可变区氨基酸序列。
[0045]SEQ ID NO:2为单链抗体FV KffOl的轻链可变区氨基酸序列。
[0046]SEQ ID NO:3为单链抗体FV KffOl的氨基酸序列。
[0047]SEQ ID NO:4为单链抗体FV KffOl(R)的氨基酸序列。
[0048]SEQ ID NO:5为一个编码单链抗体FV KffOl的重链可变区的核酸序列。
[0049]SEQ ID NO:6为一个编码单链抗体FV KffOl的轻链可变区的核酸序列。
[0050]SEQ ID NO:7为一个编码单链抗体FV KffOl的核酸序列。
[0051]SEQ ID NO:8为一个编码单链抗体FV KffOl(R)的核酸序列。
[0052]SEQ ID NO:9为一个单链抗体FV KffOl中连接肽部分的氨基酸序列。
[0053]SEQ ID NO:10为一个编码单链抗体FV KffOl中连接肽部分的核酸序列。
[0054]SEQ ID NO: 11-15分别为寡核苷酸引物FF1-5的序列。
[0055]SEQ ID NO: 16-20分别为寡核苷酸引物SF1-5的序列。
[0056]SEQ ID NO:21~25分别为寡核苷酸引物FR1-5的序列。
[0057]SEQ ID NO:26_30分别为寡核苷酸引物SR1-5的序列。
【具体实施方式】
[0058]下面参照附图通过实施例对本发明进行具体详细地说明。应理解，下文给出的具体实施例仅为示例之目的，无意于以任何方式对本发明的范围进行限定。本发明的范围由随附权利要求限定。
[0059]在本申请中，对于未具体述及的实验方案，均参照《分子克隆实验指南》(第3版，黄培堂译)、《现代免疫学实验技术》(第2版，裘法祖)或者依照厂商提供的说明书进行。
[0060]实施例
[0061]实施例1:人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体FV KffOl基因的密码子优化及合成[0062]1.FV KffOl基因的密码子优化
[0063]根据Kramer 等(Kramer R A, Marissen W E, Goudsmit J, et al.The humanantibody repertoire specific for rabies virus glycoproteinas selected fromimmune libraries [J].European Journal of Immunology, 2005, 35 (7):2131-2145)文献中所述的CR4098抗体序列，获得其重链可变区(SEQ ID NO:1)和轻链可变区(SEQ ID NO:2)氨基酸序列，两段可变区序列之间以连接肽(Gly4S)4(SEQ ID NO:7)连接。选择大肠杆菌偏爱的密码子对编码该氨基酸序列的核酸序列进行优化，优化后的核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0064]2.利用SOE-PCR法合成人源化单链抗体基因FV KffOl
[0065]本发明利用SOE-PCR法合成人源化单链抗体基因FV KffOl0合成的基因全长738bp。设计20条寡核苷酸引物，上游引物含EcoR V、EcoR I，下游引物包含Hind IIKBamHI和Xho I等几个酶切位点，方便基因克隆到原核表达载体pET20b或PBV220，且在下游酶切位点前设终止密码子。其中FF1-5、SF1_5寡核苷酸引物依次为与目的基因同向部分的引物，FR1-5、SR1_5寡核苷酸引物依次为与目的基因互补部分的引物，且后一引物与前一引物有13至24bp的重叠区。所有引物G+C含量控制在50%左右。将738bp的基因分成两段，分别经过5轮S0E-PCR，最后再经过一轮PCR对这两段序列进行拼接，最后合成完整的目的基因序列(见图1)。
[0066]第I轮PCR:将上述合成的引物FF1/FR1和SF1/SR1这两对引物分别进行链延伸反应(此轮PCR无模板)，反应条件为:94°C5min ;94°C 30s、56°C 30s、72°C 40s，30个循环；72°C IOmin0扩增获得的2条片段分别命名为Fl (FF1/FR1)和SI (SF1/SR1)。PCR体系:10X 反应缓冲液 5 μ 1、一对引物各 2 μ I (IOOpM)、dNTP I μ I (20mM)、0.5 μ IDNA 聚合酶 pfu酶(2.5U/μ I)，总体积 50 μ I。
`[0067]第2轮PCR:分别以Fl和SI为模板，FF2/FR2、SF2/SR2为引物进行PCR，反应条件同上；其PCR产物作为下一轮的模板，以同样方法进行第三、四、五轮PCR。
[0068]其中，第五轮PCR由于GC含量过高，未能扩增出目的片段。因此，把反应体系中的DNA聚合酶由pfu酶换成LA-taq酶。为了消除PCR产物末端的“A”，以此PCR产物作为模板，Pfu酶为DNA聚合酶，再进行一轮PCR，其产物分别命名为F5和S5，最后一轮为连接反应，以FF5和SR5为引物，F5、S5作为模板，采用LA_taq酶作为DNA聚合酶，进行PCR反应。除了所使用的DNA聚合酶外，其他反应条件和反应体系同第I轮PCR。
[0069]3.拼接产物的克隆、添加蛋白纯化标签及序列分析
[0070]将六轮SOE-PCR的扩增产物与T载体(pGEM_T Easy, Promega)连接，转化大肠杆菌(E.coli toplO,购自Invitrogen),小提质粒,并将酶切鉴定结果正确的克隆送测序,挑选与目的序列一致的克隆。对测序正确的克隆设计突变引物，在基因序列的C末端加上6个组氨酸(6XHis)标签，便于目的蛋白的纯化(下文中，将带有His标签的克隆称为FVKffOl⑶，将不带His标签的克隆称为FVKW01 (N)，轻链可变区在N端，重链可变区在C端不带His标签的克隆称为FV KffOl (R))。
[0071]PCR体系:10X反应缓冲液5μ 1、1μ l(5_50ng)质粒模板DNA、一对突变引物各 2 μ I (IOOpM)、dNTP I μ I (200 μ Μ)、0.5 μ IPfu TurboDNA 聚合酶(2.5U/ μ I)，总体积50 μ I。[0072]突变PCR 条件:95°C预热 5min ；95°C lmin、55°C lmin、68°C 6min，共 18 个循环。
[0073]PCR反应结束，在50 μ I体系中加入I μ IDpn I (含10U)消化2-3小时，取I μ I转化大肠杆菌toplO，提取质粒，测序，挑选正确突变的克隆。
[0074]小结:通过以上操作，成功地合成了单链抗体基因(FV KffOl)序列，为克隆、表达做准备。
[0075]实施例2:人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体FV KffOl的表达、复性和纯化
[0076]1.抗体基因表达载体的构建
[0077]对于测序正确的突变克隆，以EcoR V和Hind III双酶切质粒和载体pET20b (图2)，从而构建质粒pET20b-FV KW01(IPTG诱导型表达载体)并进行酶切鉴定，鉴定结果如图3所示。
[0078]2.pET20b-FV KffOl (FV KffOl(H)或 FV KffOl(N))的诱导表达
[0079]用测序正确的重组质粒pET20b_FV KWOl转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞。用含氨苄青霉素的LB琼脂平板筛选。挑取新鲜单菌落接种于5ml LB培养基(含氨苄青霉素50μ g/ml)中，37°C振荡培养过夜。次日接种50 μ I过夜培养物于5ml含氨苄青霉素的LB培养液中。37°C振荡培养约3h，至0D600 ^ 0.4-0.6时，按1: 1000比例加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG)使其终浓度为 Immol/L，并设对照组，诱导表达5-6小时，离心收集细菌。电泳鉴定目的蛋白的表达。结果见图4。从这幅图中可以看出，经IPTG诱导后，有分子量介于25-35kb之间的蛋白强烈表达，该蛋白对应目标蛋白即单链抗体FV KWOI。
[0080]小结:单链抗体基·因(FV KffOl)已经构建与表达成功，表达蛋白的分子量大小正确，目的蛋白所占比例大，表达量闻。
[0081]3.目的表达产物FV KWOl的分离纯化
[0082]将细胞沉淀重悬于细菌裂解液(50mmol/L Tris-HCl, ImmoI/LEDTA, pH8.0)中，并于冰浴下超声破碎15min。在4°C以1000Orpm离心30min。将所得沉淀用8mol/L尿素，IOOmmoI/L Tris-HCl (pH 8.0)溶解，搅拌 2 小时左右。
[0083]然后，在4°C以15000Xg离心30min。取上清，以0.45 μ m微孔滤膜过滤，之后用5ml柱体积的N1-NTA柱(GE公司)进行变性条件下的亲和层析。
[0084]首先以30ml的缓冲液(8mol/L尿素，IOOmmoI/L Tris_HClpH8.0)平衡镍柱，然后上样，上样结束后，在此缓冲液基础上加50mmol/L咪唑洗涤30ml，再以500mmol/L咪唑浓度洗脱，收集洗脱液，电泳分析纯化情况，结果见图6。从图6以看出，在以500mmol/L咪唑浓度进行洗脱时，可以从镍柱上洗脱出大部分的目标蛋白即FVKW01。
[0085]小结:在变性条件下，用N1-NTA柱能去除大部分杂蛋白，得到较高纯度的目的蛋白。
[0086]4.目的表达产物FV KWOl的复性
[0087]对纯化后的变性蛋白进行复性:收集500mmol/L咪唑梯度洗脱液，取少量样品行SDS-PAGE电泳，估计其蛋白浓度，控制复性蛋白的浓度在50-100 μ g/ml左右。
[0088]用复性液G+(50mmol/L Tris-HCl (pH = 8.0), 10% (v/v)甘油，1% (m/v)甘氨酸，
0.5mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl))和复性液 G-(50mmol/L Tris-HCl(pH = 8.0),10% (v/V)甘油，0.5mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl))分别透析(复性液与蛋白体积比为4: I);每4小时更换一次透析液，以复性液G+和G-各透析3次。透析完成，将复性后的蛋白离心，在40C以15000Xg离心30min。取上清，以0.45 μ m的微孔滤膜过滤后分装保存。
[0089]实施例3:人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体FV KffOl的特异性抗原结合活性检测
[0090]用0.lIU/ml的灭活狂犬病毒(aG株，吉林迈丰生物药业有限公司惠赠)包被96孔板，每孔加100 μ I。用3% BSA-PBS进行封闭，37°C下孵育lh。加入用PBS稀释的实施例2制备的抗体、作为阳性(P)对照的抗狂犬病毒人免疫球蛋白(hRIG，购自吉林省疾控中心)、作为阴性(N)对照的一个带有组氨酸标签的无关蛋白r Ade k、或者作为空白对照的PBS，每孔100μ 1，37°C孵育I小时。随后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体(鼎国)，每孔100μ 1，37°C下孵育I小时。再用四甲基联苯胺(TMB)显色液(购自天根生化科技有限公司)显色，用2M H2SO4终止反应后，在450nm波长下测定OD值，结果见图7。结果表明，人源抗体FV KffOl(H)可以特异性地与狂犬病毒结合，而无关蛋白r Ade k不能与狂犬病毒结合，表明此抗体是特异性针对狂犬病毒糖蛋白的人源化抗体。FV KffOl(N)7FV KffOl(R)的结果与FV KffOl(H)类似，结果见图7。
[0091]小结:以上结果表明，FV KffOl⑶，FV KffOl (N)，FV KffOl (R)只能与狂犬病毒特异
性结合，并且有着很好的特异性。
[0092]实施例4:人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体KWOl (H)在细胞水平的中和活性
[0093]采用快速荧光灶抑制试验(RFFIT法)进行检测，标准血清(购自中国药品生物制品检定所)先经56°C灭活30分钟。然后，将样品或标准血清经三倍稀释后与感染量为80%荧光灶的CVS病毒(CVS-11，购自中国药品生物制品检定所)在37°C中和I小时，每孔中再加入5 X IO4个BSR细胞(106/ml，于含10%灭活小牛血清的DMEM中)，37°C培养24小时后，倾出培养液。用含Ca2+、Mg2+的PBS浸洗I遍，加入预冷至_20°C的80%冷丙酮，50 μ I/孔，-20°C固定7分钟(或室温30分钟)。稍干后加入0.02mg/ml的抗狂犬病毒核蛋白的荧光抗体(40μ I/孔，invitr0gen)，`37°C避光孵育60分钟后，倾出液体，PBS浸洗2遍。滴甘油于孔中(每孔一滴)，镜检观察荧光阳性率，并计算半数有效量(ED50)。样品的单位含量=标准品的单位含量X样品的ED50+标准品的ED50。由此计算出FV KffOl(H)效价为958IU/ml (531.7IU/mg)，FV KffOl (N)效价为 380IU/ml, FVKffOl (R)效价为 420IU/ml。如图8B所示，人源抗体FV KffOl(H)和市售的人源抗狂犬病毒血清(hRIG，购自吉林省疾控中心)一样可以完全中和狂犬CVS病毒，抑制其感染细胞，且抑制程度与抗体片段的浓度成正比(即与稀释倍数成反比)，而阴性对照无关蛋白(牛血清白蛋白)对狂犬病毒的感染无抑制作用。这说明所制备的抗狂犬病毒G蛋白人源抗体FV KWOl能特异地中和狂犬病毒，阻止狂犬病毒对BSR细胞的吸附，抑制狂犬病毒对靶细胞的感染，充分说明此抗体具有较高的中和病毒的活性，结果见图8。
[0094]小结:以上结果表明，FV KffOl⑶，FV KffOl (N)，FV KffOl (R)能够中和狂犬病毒；而且 FV KffOl(N)与 FV KffOl(R)中和效价相当，FV KWOl (H)，FV KWOl (N)，FV KffOl(R)都具
有预防与治疗狂犬病的前景。
[0095]实施例5:人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体FV KffOl (H)在检测中的应用
[0096]人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体FV KWOl(H)可用于研制狂犬病毒抗原的定量与定性检测试剂盒，从而高灵敏度地捕获或检测狂犬病毒。
[0097]以100 μ I 的 0.01mg/ml 的 FV KffOl (H)包被 96 孔板，用 200 μ I 的 3 % BSA-PBS封闭，加入0.2、0.4、0.6和0.8IU/ml的狂犬病毒抗原，每孔lOOul，于37°C孵育I小时，然后以0.01M PBSl/10000TWeen-20将板洗涤3-5次。加入HRP标记的多抗(抗狂犬病毒的马血清，或自行制备的抗狂犬病毒的兔血清)，每孔100μ 1，37°C下孵育I小时。用TMB显色液(购自天根生化科技有限公司)显色，用H2SO4终止反应后，在450nm波长下测定OD45tl值，以检测抗原的浓度。结果示于图9，该图表明抗体狂犬病毒抗原浓度和OD45tl值之间有很高的相关性(R2 = 0.9852)。由上可知，以FV KffOl(H)作为捕获抗体，由于成本低，蛋白包被浓度可以比较大，从而提高了抗原检测范围。FV KffOl (N)也具有类似的结果(结果未给出)。
[0098]小结:以上结果表明，FV KffOl (H)或FV KffOl (N)可以用做捕获或检测抗体，具有作为诊断试剂的前景。
[0099]实施例6:人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体FV KffOl (H)、FVKW01 (N)在动物水平中和活性的研究
[0100]本发明单链抗体FV KffOl (H)，FV KffOl (N)在动物水平的中和效果通过对CVS的中和效果进行评价。用80%致死量的病毒与抗体混合。选用16-18g/只雌性昆明小鼠(η =10)，于腿部肌肉注射100 μ I的病毒与抗体的混合液。具体处理见下表:
[0101]
【权利要求】
1.一种抗狂犬病毒的单链抗体，其特征在于包含由连接肽序列连接的(I)SEQ ID NO:1所示重链可变区氨基酸序列或与其具有至少90%同源性且能够结合狂犬病毒G蛋白抗原的序列，以及(2)SEQ ID NO:2所示轻链可变区氨基酸序列或与其具有至少90%同源性且能够结合狂犬病毒G蛋白抗原的序列，或者由上述序列组成。
2.权利要求1的单链抗体，其特征在于(I)的序列连接于所述连接肽的N端或者C端，而(2)的序列连接于所述连接肽的另一端。
3.权利要求1或2的单链抗体,其特征在于所述连接肽的氨基酸序列为(Gly4Ser)n,其中η为合适的整数，优选地，η为选自3-5的整数，特别优选地，η为4 ;或者为AKTTAPSVYPLA。
4.权利要求1的单链抗体，其特征在于所述单链抗体的氨基酸序列如SEQID NO:3-4所示。
5.一种核酸分子，其编码权利要求1至4任一项的单链抗体。优选地，其包含SEQ IDNO:5-10所示核酸序列或者由所述序列构成。更优选地,其为SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的核酸序列。
6.—种载体,包含权利要求5的核酸分子,优选地,所述载体为载体pET20b。
7.一种表达细胞，包含权利要求3的载体，优选地，所述表达细胞为大肠杆菌细胞。
8.权利要求1至4任一项的单链抗体在制备狂犬病毒抗原诊断剂、狂犬病预防剂或狂犬病治疗剂中的用途。
9.一种组合物，其包含权利要求1至4任一项的单链抗体与FV 57，用于预防或治疗狂犬病。·
10.权利要求9的组合物在制备狂犬病毒抗原诊断剂、狂犬病预防剂或狂犬病治疗剂中的用途。
【文档编号】C12N15/63GK103848915SQ201210509801
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月3日 优先权日:2012年12月3日
【发明者】孔维, 吴永革, 袁若森, 朱昌林, 姜春来, 谷铁军, 张喆, 陈晓旭, 段冶 申请人:长春百克生物科技股份公司, 吉林大学