专利名称：一种用固定化酶生产糖基化葛根素的方法
技术领域：
本发明涉及糖基化葛根素的制备，具体地说是一种用固定化酶生产糖基化葛根素的方法。
背景技术：
葛根素(puerarin),8-C- β -D-葡萄糖基-7，4' 二轻基-异黄酮(8-C- β -D-Glucopyranosyl-7, 4' -hydroxy-1soflavone)。葛根素毒性小、安全范围广、疗效好，具有广泛的 药理作用，临床上主要应用于心脑血管系统疾病、糖尿病、眼底疾病、突发性耳聋、急性酒精中毒、拟菊酯类农药中毒及肿瘤的治疗。但是临床使用中葛根素存在如下缺点(1)体内消除速率快，临床使用剂量较大，口服生物利用度低；(2)葛根素水溶解度低，仅为6. 24g/L，因此临床使用的注射剂中需加入助溶剂，以提高溶解度。因此对葛根素进行修饰改造，改善其水溶性和脂溶性，提高其生物利用度及选择性，最终增强其药理活性，是一种行之有效的开发新药途径，也是当前葛根素研究的热点。研究表明，氧化微杆菌(Microbacterium oxydans CGMCC 1788)通过静息细胞转化或细胞粗酶提取液转化，可以将葛根素转化为葛根素-7-0-葡萄糖苷。与葛根素相比，葛根素-7-0-葡萄糖苷水溶解度提高18倍，有较长的半衰期及平均滞留时间，能在血液中维持较高的血药浓度，舒张血管作用也略优于天然葛根素。同时，采用TritonX-100处理氧化微杆菌，破坏其细胞膜结构，增加细胞渗透性，可以将葛根素转化为葛根素-7-0-果糖苷。但是由于细胞膜的屏障作用，静息细胞转化积累产物耗费的时间较长，副产物较多；细胞反复回收利用，细胞逐渐自溶，转化活性降低，不利于规模化生产；细胞粗酶提取液在反应过程中极易受pH、温度等外界环境影响而变性失活；粗酶提取液不能回收再利用，也不易长期保存；酶纯化过程异常复杂繁琐，耗时长、得率低；因此细胞转化和细胞粗酶提取液转化效率低，周期长，不利于工业化生产。固定化酶将为工业化生产糖基化葛根素提供新技术。固定化酶是指固定在适合载体上并在一定空间范围内能连续进行催化反应的酶。固定化酶不仅保持了酶的催化特性，而且克服了游离酶的不足，具有增加酶的稳定性，酶可反复或连续使用以及酶和反应产物易于分离的优点，因而效率高、成本低。自从20世纪60年代日本首次固定化氨基酰化酶工业化连续生产L-氨基酸以来，固定化酶技术为酶的工业化运用开辟了广阔的发展空间。但至今，固定化酶在生产糖基化葛根素方面的应用尚未见相关专利和报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶可以回收并重复利用的用固定化酶转化葛根素生产糖基化葛根素的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为用固定化酶生产糖基化葛根素包括如下操作步骤(I)粗酶液的制备
将氧化微杆菌(Microbacteriumoxydans CGMCC 1788)培养至 OD6tltlL O—3. O,离心收集菌体，加预冷PH8. O的磷酸缓冲液重悬，破碎两次，离心得粗酶液。测定粗酶液蛋白浓度。
所述菌种培养过程为将菌种划线于LB平板，30°C培养至出现单菌落，用牙签挑取单菌落于种子培养基(20mL LB/100mL锥形瓶)，30°C、220rpm振荡培养24h，以1%的接种量接入扩大培养基(IL LB/3L锥形瓶)，30°C、220rpm培养12h ；
所述菌液离心条件为8000rpm，4°C，离心lOmin。菌体破碎后离心条件为 8000-12000rpm，O-1OO，离心 10_30min ；
所述蛋白浓度测定方法为bradford法(1970)。
(2)固定化酶的制备
称取一定量纤维素，预处理后与粗酶液于磷酸缓冲液中进行反应，使酶固定在纤维素表面，制备得到固定化酶，测定其活力。
所述纤维素为DEAE—纤维素、CM—纤维素或DEAE—纤维素与戊二醛交联载体。预处理方法分别为=DEAE-纤维素预处理，加入适量去离子水浸泡搅拌过夜后，经布氏漏斗抽滤掉去离子水。加入适量0. 5mol/L HCl处理Ih后，抽滤掉多余HC1，去 离子水反复清洗至中性。随后加入适量0. 5mol/LNa0H处理Ih后，抽滤掉多余NaOH，去离子水反复清洗至中性； CM-纤维素预处理，加入适量去离子水浸泡搅拌过夜后，经布氏漏斗抽滤掉去离子水。加入适量0. 5mol/L NaOH处理Ih后，抽滤掉多余NaOH，去离子水反复清洗至中性。随后加入适量 0. 5mol/L HCl处理Ih后，抽滤掉多余HC1，去离子水反复清洗至中性；称取0. 5g DEAE-纤维素，加入25ml戊二醛(浓度分别为1%、3%、6%)，于30°C、220rpm下交联6h。离心去除上清， 并用去离子水反复清洗至无戊二醛残留，去除多余去离子水，制得交联载体；
所述反应条件为ρΗ3·0-8·0，反应温度0-25°C，反应时间2_12h，酶的量为2_15mg 酶/g湿重纤维素；
所述酶活力测定方法如下
游离酶活力测定5ml游离酶中加入5ml浓度为8mg/ml葛根素转化液(ρΗ8· 0)，于 30°C、220rpm下反应12h，HPLC分析测定酶活。
固定化酶活力测定固定化酶中加入IOml浓度为4mg/ml葛根素转化液(pH8. 0), 于30°C、220rpm下反应12h，HPLC分析测定酶活。
+ 粗_活力-上清中酶活力-洗液中酶活力 W 疋化率=-1! *-X100
,丁固定化_总活力ιηΛ活力_收牟=加入酶总活力1X100
固定化酶相对活力是指在同组试验中以活性最高的为100，其余固定化酶之比值，以百分数表示。酶活力定义每小时催化产生Iumol糖基化葛根素所需酶量定义为一个酶活力单位(IU)。
(3)糖基化葛根素的制备
在搅拌条件下，将葛根素溶于缓冲液中，与步骤(2)制备的固定化酶进行转化反应，处理转化液。
所述转化反应体系的条件为pH3. 0-8. 0，温度5_50°C，时间1_24小时；所述转化液处理方法为转化液于8000rpm下离心lOmin，取上清，100°C恒温加热IOmin后，于12000rpm下离心IOmin,取上清。(4)糖基化葛根素的纯化 采用普通湿法装柱，将预处理好大孔树脂填充至层析柱。将步骤(3)制备的转化液经层析系统分离，洗脱液经HPLC检测，将糖基化葛根素检测纯度大于95%的洗脱液经旋转蒸发仪浓缩，再经冷冻干燥获得高纯度的糖基化葛根素。所述大孔树脂预处理过程为层析柱内加入相当于装填树脂体积O. Γ0. 5倍的乙醇或甲醇，然后将新树脂投入层析柱中。使其液面高于树脂层约O. 3m处，并浸泡24h。用两倍体积的乙醇或甲醇，以2倍体积/小时的流速通过树脂层，并浸泡4 5h。用乙醇或甲醇，以2倍体积/小时的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色混浊止。并以水以同样流速洗净乙醇或甲醇。用2倍体积的5%HC1溶液，以4 6倍体积/小时的流速通过树脂层，并浸泡2 4小时，而后用水以同样流速洗至出水pH中性。用2倍体积的2%NaOH溶液，以4飞倍体积/小时的流速通过树脂层，并浸泡2 4小时，而后用水以同样流速洗至出水pH中性；所述HPLC检测条件采用Agilent 1100高效液相色谱仪，色谱柱为AgilentHC-C18柱(250X4. 6 μ m，5 μ m)，柱温为室温；进样体积为20 μ L ;检测器为AgilentG1314A紫外检测器，波长为254nm，；流动相A :经O. 22 μ m微孔滤膜过滤的双蒸水，加入O. 1% (v/v)色谱级乙酸，B :色谱级甲醇，A:B=70:30 ;流速lmL/min ;数据处理在AgilentChemStation 上完成。本发明同菌体静息细胞转化或游离酶转化生产糖基化葛根素相比较，具有如下优
占-
^ \\\ ·1.采用本发明的固定化技术，酶的固定化率和活力回收率高，固定化酶稳定性好。2.固定化酶可以重复使用，降低糖基化葛根素生产成本。3.固定化酶反应过程中，副产物少，产品易于分离。4.固定化酶反应过程操作简便，可选择多种反应方式，有利于实现工业化生产。
具体实施例方式下面通过实例对本发明作进一步说明。实施例1:DEAE—纤维素固定葛根素糖基化酶生产糖基化葛根素步骤1:粗酶液的制备将氧化微杆菌(Microbacteriumoxydans)CGMCC 1788 (购于 CGMCC):将菌种划线于LB平板，30°C培养至出现单菌落；用牙签挑取单菌落于种子培养基(20mL LB/100mL锥形瓶)，30°C、220rpm振荡培养24h ;以1%的接种量接入扩大培养基(IL LB/3L锥形瓶)，30°C、220rpm培养12h,测OD600L O一3. O ;离心收集菌体，离心条件为8000rpm, 4°C,离心IOmin ；加预冷pH8. O的磷酸缓冲液重悬，破碎两次，离心得粗酶液，离心条件为8000-12000rpm，0_10°C,离心10_30min ；bradford (1970)法测定粗酶液蛋白浓度。步骤2 :DEAE—纤维素固定葛根素糖基化酶称取一定量DEAE—纤维素，加入适量去离子水浸泡搅拌过夜后，经布氏漏斗抽滤掉去离子水。加入适量0. 5mol/L HCl处理Ih后，抽滤掉多余HC1，去离子水反复清洗至中性。随后加入适量O. 5mol/LNa0H处理Ih后，抽滤掉多余NaOH，去离子水反复清洗至中性； 将预处理的DEAE—纤维素与粗酶液于磷酸缓冲液中进行反应，反应条件为pH3. 0-8. O,反应温度0-25°C，反应时间2-12h，酶的量为2-15mg酶/g湿重纤维素，使酶固定在纤维素表面，制备得到固定化酶。固定化率91. 25%，酶活力回收率54. 8%。
步骤3 :糖基化葛根素的制备
在搅拌条件下，将12g葛根素溶于3LpH7. O磷酸缓冲液中，与步骤(2)制备的50g 固定化酶在5L发酵罐中进行转化反应，反应体系的条件为pH3. 0-8. 0，温度5-50°C，时间 1-24小时；转化液于8000rpm下离心lOmin，取上清，100°C恒温加热IOmin后，于12000rpm 下离心IOmin,取上清。
转化反应完成后,过滤,用pH7. O磷酸缓冲液清洗固定化酶2次,重新将该固定化酶投入发酵罐中进行上述反应，共重复进行15次反应，固定化酶活性仍保留70%以上。
步骤4 :糖基化葛根素的纯化
层析柱内加入相当于装填树脂体积O. Γ0. 5倍的乙醇或甲醇，然后将AB-8型树脂投入层析柱中。使其液面高于树脂层约O. 3m处，并浸泡24h。用两倍体积的乙醇或甲醇，以 2倍体积/小时的流速通过树脂层，并浸泡4 5h。用乙醇或甲醇，以2倍体积/小时的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色混浊止。并以水以同样流速洗净乙醇或甲醇。用2 倍体积的5%HC1溶液，以4飞倍体积/小时的流速通过树脂层，并浸泡2 4小时，而后用水以同样流速洗至出水pH中性。用2倍体积的2%Na0H溶液，以4飞倍体积/小时的流速通过树脂层，并浸泡2 4小时，而后用水以同样流速洗至出水pH中性。
将步骤(3)制备的转化液经层析系统分离，洗脱液经HPLC检测，HPLC检测条件 采用AgilentllOO高效液相色谱仪,色谱柱为Agilent HC-C18柱(250X4. 6μηι,5μηι),柱温为室温；进样体积为20 μ L ;检测器为AgilentG1314A紫外检测器，波长为254nm，；流动相A :经O. 22 μ m微孔滤膜过滤的双蒸水，加入O. 1%0 (v/v)色谱级乙酸，B :色谱级甲醇， A:B=70:30 ;流速lmL/min ;数据处理在Agilent ChemS tation上完成；将糖基化葛根素检测纯度大于95%的洗脱液经减压真空浓缩，再经冷冻干燥获得纯度97. 67%的糖基化葛根素 5. 12g。
实施例2 :CM—纤维素固定葛根素糖基化酶生产糖基化葛根素
称取一定量CM-纤维素，加入适量去离子水浸泡搅拌过夜后，经布氏漏斗抽滤掉去离子水。加入适量O. 5mol/LNa0H处理Ih后，抽滤掉多余NaOH，去离子水反复清洗至中性。随后加入适量O. 5mol/LHCl处理Ih后，抽滤掉多余HC1，去离子水反复清洗至中性。
其它步骤同实施例1。
CM—纤维素固定化酶的固定化率为88. 39%，酶活力回收率45. 26%。
实施例3 =DEAE-纤维素与戊二醛交联载体固定葛根素糖基化酶生产糖基化葛根素
称取O. 5g DEAE-纤维素,加入25ml 6%戍二醒，于30°C、220rpm下交联6h。离心去除上清，并用去离子水反复清洗至无戊二醛残留，去除多余去离子水，制得交联载体。
其它步骤同实施例1。
DEAE-纤维素与戊二醛交联载体固定化酶的固定化率为85. 33%，酶活力回收率 40. 83%。
权利要求
1.一种用固定化酶生产糖基化葛根素的方法，其特征在于包括如下步骤(1)粗酶液的制备将氧化微杆菌(IicroAacieri應 oxydans ) CGMCC 1788 培养至 0D_1. O一3. O,离心收集菌体，加预冷PH8. O的磷酸缓冲液重悬，破碎两次，离心得粗酶液；(2)固定化酶的制备称取一定量纤维素，预处理后与粗酶液于磷酸缓冲液中进行反应，使酶固定在纤维素表面，制备得到固定化酶；(3)糖基化葛根素的制备在搅拌条件下，将葛根素溶于缓冲液中，与步骤(2)制备的固定化酶进行转化反应，反应体系的pH为3. 0-8. 0，温度5-50°C，时间1-24小时，即制得含糖基化葛根素的转化液；(4)糖基化葛根素的纯化采用湿法装柱，将预处理好大孔树脂填充至层析柱，将步骤(3 )制备的转化液经层析系统分离，洗脱液经HPLC分析测定，将糖基化葛根素纯度大于95%的洗脱液浓缩，再经冷冻干燥获得高纯度的糖基化葛根素。
2.根据权利要求1所述的用固定化酶生产糖基化葛根素的方法，其特征在于所述步骤(2)是称取一定量纤维素，加入去离子水浸泡过夜，抽滤掉去离子水，加入O. 5mol/ LHCl处理后，抽滤掉多余HC1，去离子水反复清洗至中性；随后加入O. 5mol/L NaOH处理Ih 后，抽滤掉多余NaOH，去离子水反复清洗至中性；将粗酶与预处理的纤维素于磷酸缓冲液中进行反应，使酶固定在纤维素表面，反应体系的PH为3. 0-8. O,反应温度0-25°C，反应时间2-12h，酶的量为2-15mg酶/g湿重纤维素。
3.根据权利要求1所述的用固定化酶生产糖基化葛根素的方法，其特征在于所述纤维素为CM—纤维素、DEAE一纤维素或DEAE—纤维素与戍二醒交联载体。
4.根据权利要求1所述的用固定化酶生产糖基化葛根素的方法，其特征在于所述固定化酶转化反应为在发酵罐中进行间隙或连续搅拌反应。
5.根据权利要求1所述的用固定化酶生产糖基化葛根素的方法，其特征在于所述糖基化葛根素为葛根素-7-0-果糖苷或葛根素-7-0-葡萄糖苷。
6.根据权利要求1所述的用固定化酶生产糖基化葛根素的方法，其特征在于所述步骤(3)缓冲液为磷酸缓冲液或Tris缓冲液。
7.根据权利要求1所述的用固定化酶生产糖基化葛根素的方法，其特征在于所述大孔树脂为AB - 8型、DM - 130型、LSA - 10型或LSA - 20型。
8.根据权利要求1所述的用固定化酶生产糖基化葛根素的方法，其特征在于所述层析系统为双柱串联层析系统或超长两段层析柱分离系统。
9.根据权利要求1所述的用固定化酶生产糖基化葛根素的方法，其特征在于所述浓缩方法为旋转蒸发仪浓缩或减压真空浓缩。
全文摘要
本发明涉及一种用固定化酶生产糖基化葛根素的方法，步骤如下1)粗酶的制备将菌体经高压破碎，离心得粗酶液；2)固定化酶的制备将粗酶与预处理的纤维素于磷酸缓冲液中反应，使酶固定在纤维素表面，酶的量为2-15mg酶/g湿重纤维素；3)糖基化葛根素的制备在搅拌条件下，将溶于反应介质中的葛根素与固定化酶进行转化反应，反应体系的ph为3.0-8.0，温度5-50℃，时间1-24小时；4)糖基化葛根素的纯化将转化液经双柱串联层析分离，旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥，制得糖基化葛根素；反应结束后，过滤回收固定化酶。本发明的优点为成本低，转化副产物少，固定化酶可重复利用，适应于规模化生产。
文档编号C12R1/01GK102994594SQ201210512348
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年12月4日
发明者刘贵友, 袁生, 孙磊, 封建树, 黄国栋, 崔沂, 陆舟, 沈娇娇, 武秀秀 申请人:南京师范大学, 江苏教育学院