饮料及其制造方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种安全和新型的饮料，所述安全和新型的饮料用于通过日常摄取来预防和治疗各种骨疾病如骨质疏松症、骨折、风湿症和关节炎。所述饮料包含大于0.8mg/100ml且150mg/100ml以下的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和以抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.006～1.7的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。通过摄取饮料可强化骨，并预防和治疗各种骨疾病如骨质疏松症、骨折、风湿症和关节炎。
【专利说明】饮料及其制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种饮料及其制造方法。所述饮料包含特定的乳成分，可用于预防和 治疗各种骨疾病如骨质疏松症、骨折、风湿症和关节炎。
【背景技术】
[0002] 近年来，各种骨疾病如骨质疏松症、骨折和腰痛在世界范围内随着社会老龄化等 增多，已成为严重的社会问题。这些疾病由钙摄入不足、钙吸收能力下降、闭经后激素失衡 等引起。据认为，从生命早期通过活化成骨细胞和骨形成尽可能地增加体内骨量，并且增加 最大骨量和骨强度（骨密度+骨质），在预防各种骨疾病，例如骨质疏松、骨折和腰痛方面是 有效的。注意术语"骨质"涉及骨显微结构、代谢更新（metabolicturnover)、微小骨折和 钙化。据称各种骨疾病，例如骨质疏松、骨折和腰痛可通过抑制破骨细胞的骨吸收来预防。 骨始终以平衡的方式反复吸收和形成（重塑）。然而，当由于闭经期后激素平衡变化等引起 骨吸收超过骨形成时，可发生各种骨疾病，例如骨质疏松、骨折和腰痛。因此，通过抑制破骨 细胞的骨吸收和维持骨强度在恒定水平可使骨得到强化。
[0003] 考虑到上述情形，为了强化骨，已摄取单独添加钙盐例如碳酸钙、磷酸钙或乳酸钙 的钙盐或者天然钙产品例如乳清钙、牛骨粉或鸡蛋壳的药物、饮食品或饲料等。包含此类 钙产品以及具有钙吸收促进效果的物质，例如酪蛋白磷肽或寡聚多糖的药物、饮食品或饲 料等也已经用于强化骨。然而，当摄取包含钙盐或天然钙产品的饮食品时钙吸收率为50% 以下，并且摄取的大部分钙可能排出体外而没有被吸收。另外，即使钙被吸收入体内，由 于对骨的亲和性可根据其形式或同时摄取的营养成分的类型而不同，也未必显示骨代谢 改善效果或骨强化效果。已知雌激素产品、活性维生素〇 3制品、维生素1(2制品、双膦酸盐 (bisphosphonate)制品和降钙素制品等作为用于治疗骨质疏松或强化骨的药物，并且还开 发了新型药物例如抗RANKL抗体。然而，这些药物可具有副作用例如耳鸣、头痛或食欲不 振。另外，从安全和成本等观点，目前上述物质处于不能添加到食品或饮品的状况。因此， 已需要根据各种骨疾病例如骨质疏松、骨折和腰痛的性质来开发可长期经口摄取，通过促 进骨形成和抑制骨吸收增加骨强度，并且可期望具有预防或治疗各种骨疾病的效果的此类 饮食品。
[0004] 现有技术文献
[0005] 专利文献
[0006] [专利文献 1]JP-A-H〇8_l5l33l
[0007] [专利文献 2]JP-A-H10_7585
[0008] [专利文献 3]JP-A-2〇00_28l587
【发明内容】
[0009] 发明要解决的问题
[0010] 本发明目的是提供一种饮料，其可用于各种骨疾病如骨质疏松症、骨折、风湿症和 关节炎的预防和治疗。
[0011] 用于解决问题的方案
[0012] 本发明人已发现通过摄取包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物，并相对 于血管生成素和/或血管生成素的水解产物以特定的质量比包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白 (cystatin)和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的饮料可有效地增加骨密度。该发现 导致发明的完成。
[0013] 具体地，本发明包括以下方面：
[0014] (1) 一种饮料，所述饮料包含大于0? 8mg/100ml且150mg/100ml以下的血管生成素 和/或血管生成素的水解产物，和以与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比 为0. 006?1. 7的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
[0015] (2) -种预防骨疾病的方法，其包括以200ml/天以上的量摄取根据（1)所述的饮 料。
[0016] (3)根据（1)所述的饮料的制造方法，其包括将血管生成素和/或血管生成素的水 解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与饮料原料 混合，并将所得的混合物灭菌。
[0017] (4)根据权利（1)所述的饮料的制造方法，其包括添加血管生成素和/或血管生成 素的水解产物和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物至灭菌 的饮料原料。
[0018] 发明的效果
[0019] 本发明的饮料显示骨强化效果，并且可用于预防和治疗各种骨疾病例如骨质疏 松、骨折、风湿症和关节炎。
【具体实施方式】
[0020] 本发明的饮料的特征在于饮料以特定量包含血管生成素和/或血管生成素的水 解产物，并且相对于血管生成素和/或血管生成素的水解产物以特定质量比进一步包含抑 半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白酶抑制剂的水解产物。
[0021] 牛乳通常包含约0. 2?0. 8mg/100ml的血管生成素和/或血管生成素的水解产 物，和包含约0.4?lmg/100ml的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的 水解产物。
[0022] 相反，本发明的饮料添加有血管生成素和/或血管生成素的水解产物和抑半 胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物，并且所述饮料包含大于 0. 8mg/100ml且150mg/100ml以下的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和相对于血 管生成素和/或血管生成素的水解产物以0. 006?1. 7的质量比的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白 和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
[0023] 作为本发明的饮料中包含的血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半 胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物，可使用由哺乳动物，例如人、 奶牛（cow)、水牛（buffalo)、山羊或绵羊的乳制备的包含血管生成素和/或血管生成素的 水解产物的级分；由哺乳动物，例如人、奶牛、水牛、山羊或绵羊的乳制备的包含抑半胱氨酸 蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的级分；由基因工程生产的包含血管 生成素和/或血管生成素的水解产物的级分；从血液或器官纯化的血管生成素和/或血管 生成素的水解产物；或从血液或器官纯化的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白 酶蛋白的水解产物等。还可使用商购可得的纯化的血管生成素或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白试 剂。
[0024] 本发明的饮料可包含通过使用一种或多种蛋白酶消化包含血管生成素的级分、血 管生成素试剂，或包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的级分、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白试剂等获得 的血管生成素的水解产物或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
[0025] 本发明的饮料可包含通过直接从乳或来源于乳的材料，例如脱脂乳或乳清提取包 含血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸 蛋白酶蛋白的水解产物的级分制备的蛋白材料。例如，该蛋白材料可如下制备。具体地，使 乳或来源于乳的材料与阳离子交换树脂接触，并以〇. 1至2. 0M的盐浓度洗脱吸附到树脂 的乳来源的蛋白，使用反渗透膜、电渗析膜、超滤膜或微滤膜等脱盐和浓缩，并任选地使用 蛋白酶，例如胰蛋白酶、胰酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、激肽释放酶、组织蛋白 酶、嗜热菌蛋白酶或V8蛋白酶进行蛋白水解至分子量为8000以下。当使用蛋白酶进行蛋 白水解时，分子量的下限优选为500以上。由此获得的蛋白材料可通过冷冻干燥或喷雾干 燥等干燥，并且干燥产物可并入饮料中。
[0026] 本发明的饮料通过将血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸 蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物、或包含血管生成素和/或血管生成 素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的蛋 白材料等添加到乳原料，以使饮料包含大于0. 8mg/100ml且150mg/100ml以下的血管生成 素和/或血管生成素的水解产物，和相对于血管生成素和/或血管生成素的水解产物以 0. 006?1. 7的质量比的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
[0027] 如下述试验例中所示，当如上所述饮料包含血管生成素和/或血管生成素的水解 产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物时，与单独摄取 血管生成素和/或血管生成素的水解产物或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白 酶蛋白的水解产物的情况相比可更加有效地获得骨强化效果。
[0028] 本发明的饮料可以常规方式来生产，只要饮料包含各自特定量的血管生成素和/ 或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水 解产物即可。例如，本发明的饮料通过将血管生成素和/或血管生成素的水解产物添加到 乳原料例如乳来源的材料，以使饮料包含特定量的血管生成素和/或血管生成素的水解产 物，并且通过将抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物添加到混 合物以使抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素 和/或血管生成素的水解产物的质量比在上述特定范围内。注意作为乳来源材料等的饮料 原料，可给出例如牛乳、脱脂浓缩乳、脱脂奶粉、乳清、黄油、奶油、发酵乳、乳制品乳酸菌饮 料或乳酸菌饮料等，此外还可给出例如它们适当混合的乳饮料、加工乳、成分调整乳、低脂 肪乳或无脂肪乳等。
[0029] 当添加血管生成素和/或血管生成素的水解产物和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或 抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物至饮料原料如乳来源的材料时，可将血管生成素和/或 血管生成素的水解产物和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产 物添加至未灭菌的饮料原料或灭菌的饮料原料。当添加至未灭菌的饮料原料时，灭菌可在 添加后进行。在该情形下，优选加热灭菌。例如，将饮料原料本身，或者添加有血管生成素和 /或血管生成素的水解产物和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解 产物的饮料原料加热至70°C，使用均质器在15MPa压力下均质化，在130°C下灭菌2秒钟， 并冷却至5°C。当对通过添加血管生成素和/或血管生成素的水解产物和抑半胱氨酸蛋白 酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物至饮料原料而制备的混合物灭菌时，优选 在130°C下灭菌2秒钟以下。
[0030] 本发明的饮料可以添加饮食品中通常使用的原料等，如糖类、脂质、蛋白质、维生 素、矿物质或香料，除了血管生成素和/或血管生成素的水解产物、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白 和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物、上述饮料原料以外，还可添加其他骨强化成分， 如钙、维生素D、维生素K或异黄酮。
[0031] 如下述动物试验中所示，当以每kg体重200ml以上的量经口摄取时，本发明的饮 料可强化骨。由于实验动物的摄入相当于根据血中药物浓度的成人摄入（参见Mitsuyoshi Nakajima(1993)，"YakkouHyokaVol.8"，Hirokawa-ShotenLtd?，第 2-18 页），所以期望 可强化骨，并且特别地可通过以每个成人200ml/天以上的量摄取本发明的饮料可预防或 治疗各种骨疾病，例如骨质疏松、骨折、风湿症和关节炎。
[0032] 以下通过参考例、实施例和试验例进一步更详细地描述本发明。注意以下实施例 仅用于说明性目的，不应解释为限制本发明。
[0033] 参考例1
[0034] 血管牛成素级分的制各（1)
[0035] 用去离子水彻底洗绦填充有30kg阳离子交换树脂（磺化Chitopearl;由Fuji SpinningCo.，Ltd.制造）的柱，然后将1000升未灭菌的脱脂乳（pH6. 7)施加到柱。在 用去离子水彻底洗涤柱之后，用0. 1至2. 0M线性梯度的氯化钠洗脱吸附的蛋白。使用 S-Sepharose阳离子交换色谱（由AmershamBioscientific制造）分级包含血管生成素的 洗脱级分，并在90°C下热处理所得包含血管生成素的级分10分钟，并离心除去沉淀物。将 包含血管生成素的级分进一步进行凝胶过滤色谱（柱：Superose12)。使用反渗透膜使获 得的洗脱物脱盐，并冷冻干燥脱盐的洗脱物以获得16. 5g血管生成素级分，其血管生成素 纯度为90%。重复这些连续操作30次。
[0036] 参考例2
[0037] 血管牛成素级分的制各（2)
[0038] 用去离子水彻底洗绦填充有10kg肝素Sepharose(由GEHealthcare制造）的 柱，然后将500升未灭菌的脱脂乳（pH6. 7)施加到柱。在用0. 5M氯化钠溶液彻底洗涤柱 之后，用1.5M氯化钠溶液洗脱柱。使用反渗透膜使洗脱物脱盐，并冷冻干燥脱盐的洗脱物 以获得18g血管生成素级分，其血管生成素纯度为5%。重复上述连续操作50次。
[0039] 参考例3
[0040] 抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分的制各
[0041] 在90°C下热处理100, 000升5 %乳清蛋白溶液，并通过离心除去沉淀物。用通过将 羧甲基化的木瓜蛋白酶结合至Tresyl-Toyopearl(由Tosoh Corporation制造）制备的载 体填充柱。用〇. 5M氯化钠溶液平衡化后，将上述乳清蛋白溶液施加到柱。然后用0. 5M氯化 钠溶液和包含吐温20 (0. 1 % )的0. 5M氯化钠溶液连续洗涤柱。之后，用20mM乙酸-0. 5M氯化钠溶液洗脱包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的级分。用1M氢氧化钠溶液立即中和洗脱的 级分。然后使用反渗透膜使获得的洗脱物脱盐，并冷冻干燥脱盐的洗脱物以获得9. 6g抑半 胱氨酸蛋白酶蛋白级分，其抑半胱氨酸蛋白酶蛋白纯度为90%。重复上述连续操作20次。
[0042] 包含于饮料中的血管牛成素和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的测量
[0043] 根据修正的JP-A-2008-164511中所述的方法测量饮料中的血管生成素、血管生 成素的水解产物、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的含量。具 体地，将106y1饮料添加到5ml超纯水，并将1/1000当量的甲酸添加到混合物以制备样品 溶液。干燥十微升（l〇y1)样品溶液，并溶解于20y1含8M脲和ImM三（羧乙基）膦（TCEP) 的0. 1M碳酸氢铵中。在56 °C下加热溶液30分钟。在溶液回到室温后，将5y1 100mM碘乙 酰胺溶液添加到该溶液，并在暗处使混合物反应30分钟。在添加54y1超纯水后，将10y1 的0. 1yg/ml胰蛋白酶和10y1的0. 1yg/ml赖氨酰基肽链内切酶添加到混合物。在37°C 下使混合物反应16小时。然后通过添加3y1甲酸终止反应，并用作测量用的样品肽溶液。 用包含0. 1%甲酸、0.02%三氟乙酸（TFA)和2%乙腈的10fm〇l/y1内标肽溶液稀释样品 溶液6倍，并将2. 5y1稀释的溶液进行LC/MS/MS分析。
[0044] 通过使用HPLC系统梯度洗脱分离肽。更具体地，使用在MAGIC2002HPLC系统上的 配备有5y1肽trap的柱（MAGICC18, 0? 2_(ID)X50mm)以2y1/分钟的流速分离肽。使 用溶液A(2%乙腈-0.05%甲酸）和溶液B(90%乙腈-0.05%甲酸）作为HPLC洗脱液。在 2至65%使用溶液B的洗脱条件下经20分钟实施梯度洗脱。
[0045] 作为测量抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的对象离子，母体离子（parention)为 NH2-QWSGMNYFLDVELGR-COOH(m/z914.4)，和MS/MS靶离子为NH2-FLDVELGR-COOH(m/ z948. 7)。作为测量血管生成素的对象离子，母体离子为NH2-YIHFLTQHYDAK-COOH (m/ z768. 8)，和MS/MS靶离子为NH2-FLTQHYDAK-COOH(m/z1122. 8)。关于内标肽，母体离 子为NH2-EITVFENLPEK-COOH(其中，P标记有13C和15N) (m/z656. 9)，和MS/MS靶离子为 NH2-FENLPEK-C00H(其中，P标记有13C和15N) (m/z882. 4)。
[0046] 将系统"LCQ Advantage"用于MS。各蛋白的峰面积由所得色谱计算，并且由相对 于内标肽的比计算浓度。
[0047] 实施例1
[0048] 将三百三十毫克（330mg)参考例1中得到的血管生成素级分和lmg参考例3中得 到的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分与200ml牛乳混合。将混合物在130°C下灭菌2秒钟，并冷 却至10°C以获得饮料（实施例制品1)。所得饮料包含150mg/100ml的血管生成素和/或 血管生成素的水解产物，和饮料中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的 水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为〇. 006。
[0049] 实施例2
[0050] 将二十四毫克（24mg)参考例2中得到的血管生成素级分和2mg参考例3中得到 的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分与200ml牛乳混合。将混合物在130°C下灭菌2秒钟，并冷却 至10°C以获得饮料（实施例制品2)。所得饮料包含0. 81mg/100ml的血管生成素和/或血 管生成素的水解产物，和饮料中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水 解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为1. 7。
[0051] 实施例3
[0052] 将二十四毫克（24mg)参考例1中得到的血管生成素级分和2mg参考例3中得到 的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分与200ml牛乳混合。将混合物在130°C下灭菌2秒钟，并冷却 至l〇°C以获得饮料（实施例制品3)。所得饮料包含llmg/100ml的血管生成素和/或血管 生成素的水解产物，和饮料中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解 产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0. 12。
[0053] 比较例1
[0054] 将二十二毫克（22mg)参考例2中得到的血管生成素级分和4mg参考例3中得到 的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分与200ml牛乳混合。将混合物在130°C下灭菌2秒钟，并冷却 至l〇°C以获得饮料（比较例制品1)。所得饮料包含0. 75mg/100ml的血管生成素和/或血 管生成素的水解产物，和饮料中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水 解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为3. 0。
[0055] 比较例2
[0056] 将三百三十毫克（330mg)参考例1中得到的血管生成素级分和0.25mg参考例3 中得到的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分与200ml牛乳混合。将混合物在130°C下灭菌2秒钟， 并冷却至10°C以获得饮料（比较例制品2)。所得饮料包含150mg/100ml的血管生成素和/ 或血管生成素的水解产物，和饮料中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白 的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为3. 0。
[0057] 试验例1
[0058] 通过动物试验测定实施例制品1至3以及比较例制品1和2的骨强化效果。将 C3H/HeJ小鼠（5周大，雄性）用于动物试验。1周驯化后，将小鼠分为六组（10只小鼠/ 组）。使用管以每lkg小鼠重量200ml/天的量、一天一次2周向小鼠经口投与实施例制品 1至3以及比较例制品1和2的各产品。对照组不投与任何实施例制品1至3以及比较例 制品1和2。投与完成后（第二周），使用micro-CT(由RigakuCorporation制造）测量 各小鼠右胫骨的骨密度。结果示于表1中。如表1所示，经口投与实施例制品1至3的组 与对照组和投与比较例制品1或2的比较例组相比显示骨密度显著增加。
[0059]表1
【权利要求】
1. 一种饮料，所述饮料包含大于0. 8mg/100ml且150mg/100ml以下的血管生成素和 /或血管生成素的水解产物，和以与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为 0. 006?1. 7的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
2. -种预防骨疾病的方法，其包括以200ml/天以上的量摄取根据权利要求1所述的饮 料。
3. 根据权利要求1所述的饮料的制造方法，其包括将血管生成素和/或血管生成素的 水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与饮料原 料混合，并将所得的混合物灭菌。
4. 根据权利要求1所述的饮料的制造方法，其包括添加血管生成素和/或血管生成素 的水解产物和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物至灭菌的 饮料原料。
【文档编号】A23L2/52GK104507336SQ201280074989
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2012年7月31日 优先权日:2012年7月31日
【发明者】大町爱子, 松山博昭, 森田如一, 石田祐子, 奈良贵幸, 加藤健, 芹泽笃, 上野宏, 浦园浩司 申请人:雪印惠乳业株式会社