专利名称：谷氨酸棒杆菌突变株及其在发酵法生产l-亮氨酸中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种谷氨酸棒杆菌突变株，还涉及所述谷氨酸棒杆菌突变株在发酵法生产L-亮氨酸中的应用。
背景技术：
L-亮氨酸是人体八大必需氨基酸(EAA)之一，同时又属于三种支链氨基酸(BCAA)的一种，因其特殊的结构和功能而在人类生命代谢中具有特别重要的地位，广泛应用于医药、食品、饲料、化妆品等领域。L-亮氨酸的生产方法有蛋白质水解提取法(目前国内的主要生产方法)和植物源发酵法(目前国外的主要生产方法)。国内主要采用水解提取法，即从毛发水解提取L-胱氨酸的废母液中以邻二甲苯-4-磺酸作沉淀剂提取L-亮氨酸，不但生产环境恶劣，污染严重，而且产品中残留有毒沉淀剂，安全性差，尤其是近年来因疯牛病及禽流感事件，国际上特别是欧美发达国家对动物源产品的抵制日趋严厉，由此推动了发酵法生产L-亮氨酸的开发。T. Takayasu et. al 从乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869出发，经亚硝基胍诱变处理，选育获得了 No. 218菌(Ile_ Met^ 2_TAr)，摇瓶产酸达到28g/L (Agr1. Biol. Chem .，39(15),1149 1153,1975)。张素珍等选育得到的钝齿棒状杆菌突变株L_421(Ile_，2-TAD，在2000升罐上发酵40小时，产L-亮氨酸20g/L (微生物学通报，1990，6，264 267 )。
刘党生等从天津短杆菌T6 - 13出发经紫外诱变选育得到的AHVlrRiflr突变株L145，摇瓶产酸32. lg/L，16L罐发酵产酸达21. 8g/L (沈阳药学院学报，1994，11 (2)，119 123)。天津科技大学选育获得的黄色短杆菌突变株TK0303 (Met— + IleL+ 2~TAr +a -ABr+ β -HLr+ Rifr+ SGr),在 IOL 罐上发酵产酸达到 30g/L (CN200610013399. 2)，在《L-亮氨酸的发酵中试生产》一文中记载了该菌在5M3发酵罐上中试产酸最高达到26. 5g/L (现代食品科技，2010，26 (12)，1367 1369)。蔡立明等选育得到的谷氨酸棒杆菌突变株JH — 27 (Leuhxr + 2~TAr + a -ABr+β -HLr+ SC)，是以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌种，分别经硫酸二乙酯、亚硝基胍和紫外诱变处理筛选得到的一株抗磺胺胍和支链氨基酸结构类似物的L-亮氨酸高产菌，摇瓶产酸 30 32g/L，5L 发酵罐产酸 40g/L (CN200510040431.1)。
谢希贤等报道的谷氨酸棒杆菌突变株TG8207 (Met- + IleL + 2-TAr + Leuhxr + NVr+SGr),摇瓶产酸27. 2g/L，IOL罐补料发酵产酸达到44. 5g/L (中国食品学报，2009，9 (2)，29-33)。尽管目前国内报道的L-亮氨酸菌种小试产酸水平逐年提高，但实际上我国发酵法工业化生产L-亮氨酸产量甚少，市场上销售的L-亮氨酸绝大部分是水解法产品，原因就在于缺乏遗传标记简单、培养工艺粗放、适合大规模工业化生产的L-亮氨酸优良菌种。因此，加快选育适合中国国情的粗放型L-亮氨酸优良生产菌，对于早日实现我国发酵法L-亮氨酸生产的稳定化和规模化，意义十分重大。
发明内容
为了解决以上适合大规模工业化的粗放型L-亮氨酸优良生产菌缺乏的问题，本发明提供了一种具有很高的L-亮氨酸生产能力，遗传标记为L-亮氨酸缺陷回复及α-氨基-β -轻基戍酸抗性的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变株SL-0193(Leu+AHVr),保藏编号为 CGMCC No. 7033。本发明还提供了所述的谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193在发酵法生产L-亮氨酸中的应用。所述应用包括以下步骤
(O将谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193接种于摇瓶种子培养基中，在往复式摇床上，3rC，96rpm振荡培养18小时，得到摇瓶种子液；
(2)将摇瓶种子液以10%比例接入摇瓶发酵培养基中，在往复式摇床上，31°C，96rpm振荡培养48小时即得；或将摇瓶种子液以10%比例接入5L罐发酵培养基中，控制发酵温度30 32°C，pH7. O 7· 2，搅拌500 700rpm，通风2 3L/min，当残糖彡2%时，流加55%葡萄糖溶液，发酵60小时即得。所述的应用，摇瓶种子培养基中含有葡萄糖30g/L，硫酸铵5g/L，玉米浆40mL/L，KH2PO4·3Η20 lg/L, MgSO4·7Η20 O. 5g/L，FeS04.7H20 0. Olg/L, MnSO4^H2O 0. Olg/L, Vh100 μ g/L，Vbi 200 μ g/L，尿素 2g/L，pH 为 7. 0 7. 2。
所述的应用，摇瓶发酵培养基中含有葡萄糖135g/L，硫酸铵35g/L，玉米浆25mL/L，KH2PO4·3Η20 lg/L, MgSO4·7Η20 O. 5g/L，FeS04.7H20 0. Olg/L, MnSO4^H2O 0. Olg/L, Vh100 μ g/L, Vbi 200 μ g/L, CaCO3 40g/L, pH 为 7. 0 7. 2。所述的应用，5L罐发酵培养基中含有葡萄糖120g/L，硫酸铵20g/L，玉米浆25mL/L，KH2PO4.3H20 lg/L, MgSO4·7Η20 O. 5g/L，FeS04.7H20 0. Olg/L, MnS04*H20 0. Olg/L, Vh100 μ g/L, Vbi 200 μ g/L,泡敌 0. 05g/L。本发明的有益效果从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) CGMCC1.495 (LeiT)出发，经DES—步诱变筛选得到L-亮氨酸缺陷回复及0-氨基-0-羟基戊酸抗性突变株SL-0193 (Leu+AHVr),有效解除了目的产物L-亮氨酸对L-亮氨酸生物合成酶系的反馈调节，从而大幅度提高了 L-亮氨酸的生产能力。从L-亮氨酸缺陷型(Leu_)的回复突变株(Leu+)中选育L-亮氨酸生产菌至今尚未见报道。生物材料样品保藏信息
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变株SL-0193,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 7033,保藏日期为2012年12月 24日。
具体实施例方式实施例1 :谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193 (Leu+ AHVr)的获得
以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) CGMCC1. 495 (LeiT)为出发菌株，经硫酸二乙酯(DES)—步诱变处理，定向筛选出一株L-亮氨酸缺陷回复及^-氨基-@-羟基戊酸抗性突变株SL-0193 (Leu+AHVr)0诱变处理和定向筛选培养基组成如下完全培养基(CM):葡萄糖5g,牛肉膏IOg,蛋白胨IOg,酵母膏5g,氯化钠5g,琼脂20g,用纯水定容至1L，pH7. O 7. 2。基本培养基(MM):葡萄糖20g，硫酸铵 L 5g，尿素 L 5g，ΚΗ2Ρ04·3Η20 IgjK2HPO4 3g，MgSO4*7H20 0. lg，FeSO4*7H20 0. Olg, MnS04.H20 0. Olg, Vh 20 μ g，Vbi 100 μ g，琼脂 20g，用纯水定容至1L，pH7. 0 7. 2。筛选培养基(SM):在基本培养基(丽)中加入3mg/mLa-氨基-β-羟基戊酸(AHV)。摇瓶发酵培养基葡萄糖135g/L，硫酸铵35g/L，玉米浆25mL/L，KH2PO4-3H20 lg/L, MgSO4·7Η20 O. 5g/L, FeSO4·7Η20 0. Olg/L, MnS04.H20 0. Olg/L, Vh 100 μ g/L, Vbi 200 μ g/L, CaCO3 40g/L, pH7. 0 7. 2。具体选育过程如下
(I)诱变初筛
在出发菌株菌悬液中加入O. 5%硫酸二乙酯(DES)，31°C振荡处理30min，中止处理后涂布于筛选培养基SM平板上，31°C静止培养4 6天，挑选在SM上生长的突变株单菌落转接至CM平板上，31 °C静止培养24小时后进入摇瓶复筛。(2)摇瓶复筛
在CM平板上生长的突变株菌苔接一环于摇瓶发酵培养基中，31 °C，96rpm振荡培养48小时，然后用常规纸层析法检测突变株发酵液中积累的L-亮氨酸。在所有突变株中 ，产L-亮氨酸最高的菌株为SL_0193，48小时摇瓶产酸达到32. Og/L。实施例2 :谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193在发酵法生产L-亮氨酸中的应用 发酵法生产L-亮氨酸的培养基组成为
摇瓶种子培养基葡萄糖30g/L,硫酸铵5g/L，玉米浆40mL/L, KH2PO4-3H20 lg/L,MgSO4*7H20 0. 5g/L, FeS04*7H20 0. Olg/L, MnS04*H20 0. Olg/L, Vh 100 μ g/L，Vbi 200 μ g/L,尿素 2g/L，pH7.0 7.2。5L罐发酵培养基葡萄糖120g/L，硫酸铵20g/L，玉米浆25mL/L，KH2PO4·3Η20 lg/L, MgSO4·7Η20 O. 5g/L, FeSO4·7Η20 O. 01g/L, MnS04.H20 0. Olg/L, Vh 100 μ g/L, Vbi 200 μ g/L，泡敌 0. 05g/L, pH7. 0 7. 2。将谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193的CM斜面菌苔接一环于摇瓶种子培养基中，31 °C，96rpm振荡培养18小时后，得到摇瓶种子液，以10%比例接入5L罐发酵培养基中通风培养，控制发酵温度30 32°C，pH7. O 7. 2 (流加氨水控制)，转速500 700rpm，通风量2 3L/min，待残糖下降至2%以下时，流加55%葡萄糖液，发酵时间为60小时，产L-亮氨酸 41.3g/L。所使用的摇瓶种子培养基、摇瓶发酵培养基、5L罐发酵培养基并不仅仅限于上述实施例中所提到的，只要是能够达到培养的目的，本领域普通技术人员根据菌种培养常识所能够进行的培养基成分的变换，都是可以用于上述实施例中的，都是在本发明所要保护的范围之内。
权利要求
1.一种谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193,其特征在于 其遗传标记为L-亮氨酸缺陷回复及a-氨基-￠-羟基戊酸抗性(Leu+ AHVr),保藏编号为 CGMCC No. 7033。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193在发酵法生产L-亮氨酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用包括以下步骤 (1)将谷氨酸棒杆菌突变株SL-0193接种于摇瓶种子培养基中，在往复式摇床上，3rC，96rpm振荡培养18小时，得到摇瓶种子液； (2)将摇瓶种子液以10%比例接入摇瓶发酵培养基中，在往复式摇床上，31°C，96rpm振荡培养48小时即得；或将摇瓶种子液以10%比例接入5L罐发酵培养基中，控制发酵温度30 32°C，pH7. 0 7. 2，搅拌500 700rpm，通风2 3L/min，当残糖彡2%时，流加55%葡萄糖溶液，发酵60小时即得。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是摇瓶种子培养基中含有葡萄糖30g/L，硫酸铵 5g/L，玉米浆 40mL/L，KH2P04*3H20 lg/L, MgSO4*7H20 0. 5g/L，FeS04.7H20 0. Olg/L,MnS04.H20 0. Olg/L, Vh 100 u g/L, Vbi 200ii g/L，尿素 2g/L，pH 为 7. 0 7. 2。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征是摇瓶发酵培养基中含有葡萄糖135g/L，硫酸铵 35g/L，玉米浆 25mL/L，KH2P04*3H20 lg/L, MgSO4*7H20 0. 5g/L，FeS04.7H20 0. Olg/L,MnS04.H20 0. Olg/L, Vh 100 u g/L, Vbi 200 u g/L, CaCO3 40g/L, pH 为 7. 0 7. 2。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征是5L罐发酵培养基中含有葡萄糖120g/L，硫酸铵 20g/L，玉米浆 25mL/L，KH2P04*3H20 lg/L, MgSO4*7H20 0. 5g/L，FeS04.7H20 0. Olg/L,MnS04.H20 0. Olg/L, Vh 100 u g/L, Vbi 200 u g/L,泡敌 0. 05g/L。
全文摘要
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种谷氨酸棒杆菌突变株及其在发酵法生产L-亮氨酸中的应用。所述的谷氨酸棒杆菌突变株是从谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC1.495(Leu-)出发，经DES一步诱变筛选得到的L--亮氨酸缺陷回复及α-氨基-β-羟基戊酸抗性突变株SL-0193(Leu+AHVr)，保藏编号为CGMCCNo.7033，有效解除了目的产物L-亮氨酸对L-亮氨酸生物合成酶系的反馈调节，具有很高的L-亮氨酸生产能力，在适宜的培养条件下，摇瓶发酵48小时产L-亮氨酸32.0g/L，5L自控发酵罐发酵60小时产L-亮氨酸41.3g/L。
文档编号C12R1/15GK103031265SQ20131001046
公开日2013年4月10日 申请日期2013年1月11日 优先权日2013年1月11日
发明者张炳荣, 周群 申请人:新泰市佳禾生物科技有限公司