一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用的制作方法

专利名称：一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1) Tat蛋白突变体序列，及其在制备HIV免疫原中、在制备预防和治疗性HIV疫苗中、在制备HIV检测试剂盒中的应用。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)主要经血液、性接触及母婴垂直途径等传播，可引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，即艾滋病。据联合国艾滋病规划署2012年的统计，全球HIV感染者约3400万，我国现存HIV感染者和艾滋病病人约38万，艾滋病已经成为我国及全球所面临的重大公共卫生问题。目前采用高效抗逆转录病毒疗法(HAART)虽能延缓艾滋病病情的发展，但不能完全清除病毒；行为干预也仅减缓HIV感染传播速度而无法终止其流行。因此，迫切需要开发研制新的有效的药物以控制HIV的传播和感染。感染人类的HIV有HIV-1和HIV-2两型，两者核苷酸序列相差可超过40%。世界各地主要流行的是HIV-1，HIV-2则主要流行在非洲西部地区。HIV-1 转录反式激活因子(trans-activator of transcription, Tat)是 HIV-1感染早期产生的重要调控蛋白。根据HIV-1毒株的不同，Tat蛋白由86-101个氨基酸残基组成，由两个独立的外显子编码:第I个外显子编码1-72位氨基酸(aa)，具有完全的转录激活活性 ’第2外显子编码Tat C末端区(73-101aa)。试验证实Tat在HIV-1复制、扩散及致病中起重要作用。研究表明，在感染细胞内，Tat可反式激活HIV基因组转录的起始和延长，从而启动和促进病毒的复制；而分泌和释放至细胞外的Tat还具有多样的胞外活性，如参与免疫抑制、神经系统损伤 及Kaposi肉瘤形成等致病过程，被称为“病毒毒素”(参见文献:Silvers JM, Aksenova MV, Aksenov MY, Mactutus CF, Booze RM.NeurotoxicityofHIV-1Tat protein:1nvolvement of Dldopamine receptor.Neurotoxicology.2007;28(6):1184-1190.)。Tat上述生物学特性及致病效应已使其成为HIV预防性及治疗性疫苗的候选抗原之一。HIV-1Tat分子为天然非折叠蛋白，属于无规卷曲类型的分子。虽然Tat序列在HIV-1不同亚型间具有高度保守性，但其缺乏稳定二级结构和高级结构，使其分子构象极不稳定，处于快速动态的变化之中。天然Tat作为HIV疫苗的候选抗原尚存在诱发免疫保护性抗体滴度低、交叉反应性差等不足。因此通过分子生物学手段，对HIV-1天然Tat分子结构进行改造，是获得分子构象相对稳定的新型Tat免疫原的一条有效途径，具有潜在的HIV疫苗开发价值。本申请人已于2011年3月25日申请了中国发明专利，涉及三种人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列:Tat突变体抗原I (Tatl-37)由37个氨基酸组成；Tat突变体抗原2 (Tatl-61)由61个氨基酸组成；Tat突变体抗原3 (Tat22-101)由80个氨基酸组成(参见中国专利申请CN201110074185.7，发明名称为“人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用”，申请公布号为CN102206255A，申请公布日为2011年10月5日)。

发明内容
本发明的目的在于进一步深入地对HIV-1天然Tat分子结构进行改造，寻找分子构象稳定的新的Tat蛋白突变体序列，并提供该Tat蛋白突变体序列在制备HIV免疫原中、在制备预防和治疗性HIV疫苗中、在制备HIV检测试剂盒中的应用。本申请人通过对Tat蛋白进行疏水性分析发现，Tat第31-45位氨基酸具有较强的疏水性，其余部分均有较强的亲水性(图1)。鉴于Tat31-45肽段的疏水性对于Tat蛋白的表达有较大的影响，申请人设想通过分子生物学手段，对HIV-1天然Tat分子结构进行改造，截去Tat蛋白中疏水区段，有望提高Tat蛋白的表达量并获得分子构象相对稳定的新型Tat免疫原，具有潜在的HIV疫苗开发和HIV感染检测诊断价值。本发明的第一方面，是提供了一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列(以下也称Tat Λ (31-45)或Tat Λ (31-45)突变体或Tat Λ (31-45)序列):Tat Δ (31-45)突变体由86个氨基酸组成，其氨基酸序列为:H2N-MEPVDPRLEPWKHPG SQPKTACTNCYCKKCSYGRKKRRQRRRAHQNSQTHQASLSKQPASQPRGDPTGPKESKKKVERETETDPVD— COOH (SEQ ID NO:1);编码Tat Δ (31-45)突变体的核苷酸序列为:5 ' -ATGGAACCGGTTGACCCGCGTCTGGAACCGTGGAAACACCCGGGTTCTCAGCCGAAAACCGCTTGCACCAACTGCTACTGCAAAAAATGCTCTTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGCTCACCAGAACTCTCAGACCCACCAGGCTTCTCTGTCTAAACAGCCGGCTTCTCAGCCGCGTGGTGACCCGACCGGTCCGAAAGAATCTAAAAAAAAAGTTGAACGTGAAACCGAAACCGACCCGGTTGAC-3/ (SEQ ID NO:2)。本发明的第二方面，是提供了上述缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其编码基因在制备HIV免疫原中的应用。进一步地，本发明还提供了上述一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其编码基因在制备预防和治疗性HIV疫苗中的应用。进一步地，本发明还提供了上述一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其编码基因在制备HIV检测试剂盒中的应用。本发明的第三方面，是要制备得到一种不含Tat疏水区(Tat第31-45位氨基酸)的原核表达量高、构象相对稳定并能诱导产生更强免疫反应的新型HIV-1Tat免疫原。本发明通过拼接PCR方法获得人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)HXB2株天然Tat(参见文献:0pi S, Peloponese JM Jr, Esquieu D, Campbell G, de Mareui I J, WalburgerA, Solomiac M,Gregoire C,Bouveret E,Yirrell DL,Loret EP.TatHIV-1primaryand tertiary structures critical to immune response againstnon-homologousvariants.J Biol Chem.2002; 277 (39):35915-35919.)分子高疏水区段第 31-45 位氨基酸缺失的Tat Δ (31-45)DNA片段，构建其原核表达质粒，经过转化大肠杆菌(E.coli)BL21 (DE3),用异丙基-β -D-硫代卩比喃半乳糖苷(isopropyl β -D-l-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达，经SDS-PAGE凝胶电泳分析和Western blot鉴定正确后，与直平均径75±15nm的胶体金颗粒结合形成一种构象相对稳定并能诱导产生更强免疫反应的新型HIV-1TatA (31-45)免疫原复合物。
本发明的Tat Λ (31-45)突变体与天然全长HIV-1Tat抗原及Tat N末端缺失的Tat22-101蛋白相比，HIV-1TatA (31-45)突变体蛋白的原核表达量显著增加，构象更加稳定，实验结果表明抗HIV-1Tat Λ (31-45)小鼠抗血清与HIV-1全长Tat蛋白呈特异性反应；而且能诱导产生更强的针对HIV-1Tat N端的免疫反应。此外，与HIV-1Tat Λ (31-45)突变体蛋白相比，HIV-1TatA (31-45)结合胶体金形成的金标体免疫复合物具有更强的免疫原性，抗TatA (31-45)金标体小鼠抗血清与Tat38_61的免疫反应明显增强。本发明的具体技术方案如下:(I)以 Overlap PCR 的方法全基因合成 tatl-101-HCVC122_191 DNA 片段，胶回收试剂盒回收PCR产物，经Ase I和BamH I两种限制性内切酶酶切并回收目的片段，再与同样经Ase I和BamH I酶切后的pPEPTIDE载体(图2)连接，连接产物转化E.coli ToplO感受态细胞。抽提单克隆转化菌落的质粒并进行序列鉴定，测序正确的重组质粒命名为pPEP-Tatl-101-HCVC(122-191)。(2)以 pPEP-Tatl-101-HCVC(122-191)质粒为模板，用 PCR 方法扩增两个 DNA片段tatl-30和tat46-101-HCVC (122-191)，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA片段大小与理论值相符，分别为90bp、381bp。以上述两片段为模板，用Overlap PCR扩增tat Δ (31-45)-HCVC(122-191)。经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增DNA片段大小与理论值相符，为471bp。再以tat( Λ 31-45)-HCVC (122-191)为模板，经PCR扩增目的基因，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增DNA片段大小与理论值相符，为258bp。(3)用胶回收试剂盒回收PCR产物，分别经Nco I和BamH I两种限制性内切酶酶切并回收目的片段，再与同样经Nco I和BamH I酶切后的表达载体pET32a连接，连接产物转化E.coli ToplO感受态细胞。抽提单克隆转化菌落的质粒并进行酶切鉴定和序列鉴定，测序正确的重组质粒命名为pET32a-Tat Δ (31-45)。(4)用上述重组质粒转化E.co`li BL21 (DE3)，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE检测和Western blot试验，结果表明表达的突变体融合蛋白Tat Λ (31-45)-PET的分子量大小与理论值相符，为27.6千道尔顿(KDa)，经GlykoBandScan5.0软件分析目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白比例为55.0%。通过亲和层析法对上述蛋白进行纯化，经Glyko BandScan5.0软件分析显示纯度为90.0%。(5)用上述亲和层析法纯化的Tat Δ (31-45)-PET蛋白标记平均直径大小为75nm的胶体金颗粒，形成Tat Λ (31-45)-PET蛋白金标体免疫复合物。经不同pH条件下NaCl聚沉实验证明Tat Δ (31-45)-PET蛋白金标体免疫复合物能在生理pH条件下保持稳定。(6)用以上制备的Tat Δ (31-45)-PET蛋白和Tat Δ (31-45)-PET蛋白金标体免疫复合物分别经皮下注射C57BL小鼠，首次免疫用弗氏完全佐剂，第二、三、四次用不完全弗氏佐剂，间隔两周免疫I次,最后一次免疫两周后摘除眼球取血,离心后取上清于_40°C保存。(7)取上述两种免疫小鼠抗血清(抗Tat Λ (31-45)-PET、抗Tat Δ (31-45)-PET金标体免疫复合物)分别检测与HIV-1全长Tat蛋白(用pPEPTIDE2载体表达)、Tat N末端融合表达抗原Tatl-21-PEP、Tat38_61_PEP、Tat C末端融合表达抗原Tat60-101_PEP的反应性。经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，该2种小鼠抗血清均与HIV-1全长Tat蛋白呈特异性反应，标记胶体金后对Tat Δ (31-45)-PET蛋白的免疫原性有增强作用。
经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，表明本发明的HIV-1Tat突变体蛋白Tat Λ (31-45) -PET得到了较高表达。经ELISA试验验证，表明抗该发明的Tat Δ (31-45)-PET蛋白和Tat Δ (31-45)-PET金标体免疫复合物的小鼠抗血清与HIV-1全长Tat蛋白呈特异性反应，其中抗Tat Λ (31-45)-PET小鼠血清与HIV-1Tat N端、TatC端和Tat38-61的反应性比与全长Tat蛋白的反应性更强，提示Tat Δ (31-45)可作为一种新的Tat免疫原，能诱导产生有更高滴度的针对Tat N端、Tat C端和Tat38_61的抗体，有望达到阻断野生型Tat蛋白生物学功能的作用，可用以制备抗HIV感染多肽药物的组成成分或作为制备HIV Tat疫苗的候选抗原。此外，抗Tat Λ (31-45)蛋白金标体免疫复合物抗血清与HIV-1全长Tat蛋白的反应性强于抗Tat Λ (31-45)血清，而且与HIV-1TatN端、Tat C端和Tat38_61的反应性比与全长Tat蛋白的反应性更强，表明缺失疏水区的TatA (31-45)突变体蛋白及其金标体颗粒均有助于该蛋白构象的稳定、免疫原性的增强以及该蛋白N端、C端和第38-61位氨基酸表位的展示，有望作为HIV疫苗开发和HIV感染检测诊断的候选抗原。


图1是用DNAssist Version2.2软件分析Tat蛋白疏水性结果其中:纵坐标代表亲疏水性，正值代表疏水，负值代表亲水。第31-45位氨基酸(椭圆区域)具有较强的疏水性，其余区域均具有较强的亲水性。图2是pPEPTIDE表达载体图谱其中:其N端融合高效表达的163个氨基酸及His标签的50个氨基酸，含Ase I和BamH I克隆位点用于目的片段的插入。该载体适用于小分子量多肽或蛋白的表达。图3是PCR扩增Tat Δ (31-45)DNA片段的琼脂糖电泳图

其中:M, DL2000Marker (从上至下DNA片段大小依次为2000bp、lOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp) ;1，tatl-31 ;2，tat(45-101)-HCVC (122-191) ;3，tat Δ (31-45)-HCVC(122-191) ；4, Tat Δ (31-45)。图4是重组表达质粒pET32a_Tat Δ (31-45)的酶切鉴定结果其中:M，DL5000Marker (从上至下 DNA 片段大小依次为 5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp) ;1，空载体 pET32a ;2，pET32a 经 Nco I 和BamH I 双酶切后产物；3，未酶切 tat Δ (31-45) ;4，tat Δ (31-45)经 Nco I 和 BamH I双酶切后产物；5，未酶切 pET32a-Tat Δ (31-45) ;6，pET32a_Tat Δ (31-45)经 Nco I 和BamH I双酶切后产物。图5是Tat Λ (31-45)突变体融合蛋白原核表达产物及其纯化后SDS-PAGE分析结果其中:Μ，蛋白Marker ;l，pET32a_Tat Δ (31-45)未经IPTG诱导表达产物(细胞裂解液上清)；2，pET32a-Tat Δ (31-45)经IPTG诱导表达产物；3，BL21(DE3)空菌裂解液上清(阴性对照)；4，纯化后Tat Δ (31-45)目的融合蛋白(27.6kDa)。图6是Tat Δ (31-45)突变体融合蛋白Western blot鉴定结果其中:M，蛋白预染Marker ;1，纯化后Tat Λ (31-45)-PET融合蛋白；2，全长Tat-PET融合蛋白(阳性对照)；3，pET32a载体蛋白(阴性对照)。
图7是用透射电镜检测制备的胶体金颗粒大小和均一度结果其中:胶体金平均粒径为75.0 ±15nm，没有成团聚集情况，均一度良好。图8 是四种小鼠抗血清(抗 Tat-PEP、抗 TatA (31-45)-PET、抗 TatA (31-45)-PET金标体复合物和正常小鼠血清)与HIV-1全长Tat融合蛋白(Tatl-1Ol-PEP)反应的抗体滴度测定结果图9 是四种小鼠抗血清(抗 Tat-PEP、抗 TatA (31-45)-PET、抗 TatA (31-45)-PET金标体复合物和正常小鼠血清)分别与3种HIV-1Tat突变体抗原(Tatl-21-PEP、Tat38-61-PEP 和 Tat60-101_PEP)的反应性结果其中:A，抗Tat 小鼠抗血清(抗 Tat-PEP、抗 Tat Δ (31-45)-PET、抗Tat Δ (31-45) -PET金标体复合物)分别与Tat N端抗原Tatl-21-PEP的反应性；B，抗Tat小鼠抗血清(抗Tat-PEP、抗Tat Δ (31-45)-PET、抗Tat Δ (31-45)-PET金标体复合物)分别与Tat38-61-PEP的反应性；C，抗Tat小鼠抗血清(抗Tat-PEP、抗Tat Δ (31-45) -PET、抗Tat Δ (31-45)-PET金标体复合物)分别与TatC端抗原Tat60-101_PEP的反应性。
具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例1:通过重组质粒的构建、原核表达获得能一种缺失疏水区的Tat蛋白1.1、目的基因的体外合成以Overlap PCR的方法全基因合成tatl-101-HCVC122_191 DNA片段，胶回收试剂盒回收PCR产物，经Ase I和BamH I两种限制性内切酶酶切并回收目的片段，再与同样经Ase I和BamH I酶切后的pPEPTIDE (购自TAKARA公司)载体(图2)连接，连接产物转化E.coli ToplO感受态细胞。抽提单克隆转化菌落的质粒并进行序列鉴定，测序正确的重组质粒命名为 pPEP-Tatl-101-HCVC (122-191)。用PCR方法体外合成编码Tatl-31和Tat46-101_HCVC (122-191)肽段的DNA片段。PCR反应体系包括:模板pPEP-Tatl-101-HCVC(122-191)质粒IOng ;分别以引物Tat-U和Tat31-D、Tat45-U和T7_Terminator为上下游引物各取2 μ I (浓度为0.0lmM)(引物序列见表 l);Taq 酶1.51(1见1310(^11101，]\%2+3_01，反应体积5(^ I。PCR扩增条件为:94°C 5min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 40s, 30 个循环；72°C IOmin0 经1.5% 琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检测，结果PCR扩增的2个目的片段(tatl-31和tat46-101_HCVC(122-191))大小与理论值相符，分别为90bp、381bp (图3第1、第2泳道)。以上两PCR产物原液为模板Overlap PCR扩增tatl-101( Δ 31-45)-HCVC(122-191)DNA 片段。PCR 反应体系包括:模板为上一步 PCR原液各2.5ul ;引物Tat-U和T7-Terminator为上下游引物各取2μ I (浓度为0.0lmM)(引物序列见表 I) ；Taq 酶1.5U, dNTPlOO μ mol, Mg2+3mmol,反应体积 50 μ I。PCR 扩增条件为:94 0C 5min ；94 °C 30s, 57 °C 30s, 72 °C 40s, 30 个循环；72 °C IOmin0 经1.5%琼脂糖凝胶电泳对Overlap PCR产物进行检测，结果Overlap PCR扩增的目的片段tatl-101(A 31-45)-HCVC (122-191)大小与理论值相符，为 471bp (图 3 第 3 泳道)。再以tatl-101( Δ 31-45)-HCVC(122-191)为模板，PCR 扩增目的基因Tatl-1OK Δ 31-45)，模板 为上 Overlap PCR 产物 2.5ul ;分别以引物 Tat-U 和 Tat-D 为上下游引物各取2μ1 (浓度为0.0lmM)(引物序列见表I) ;Taq酶1.5U，dNTPlOOymol,Mg2+3mmol，反应体积 50 μ I。PCR 扩增条件为:94°C 5min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 40s, 30个循环；72°C IOmin0经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增tatl-101 ( Δ 31-45) DNA片段大小与理论值相符，为258bp (图3第4泳道)。表I体外合成目的基因的引物名称及其序列
名称ml序列(5y)
Tat-U合成 tatl-31 等片段 cacagcatcatctctcagccatggcaatggaaccggttgac
的上游引物CCOCGTCTG (SEQIDN(M)
Tat31-D合成 tatl-31 下游弓I ccgtaagagcattttttgcagtagcagttg (seqidno:4)
物
Tat45-U合成CAAAAAATGCTCTTACGGTCGTAAAAAACGTCG
tat-46-101 HCVC,； s1.g id no:5)
(122-191)上游引物
T7_ Terminator 合成 t46-101HCVC gctagttattgctcagcgg ( seq id no:6 )
(122-191)等片段下
游引物
Tat-D合成 tatl-101( Δ tgcattacggatccttattagtcaaccgggtcggtttcggt
31-45)下游引物(SEQn)MW)L 2、重组表达载体的构建用胶回收试剂盒3S DNA Gel Purification Kit3.1 (购自上海TIANGEN公司)回收DNA片段后，用Nco I和BamH I两种限制性内切酶进行双酶切以获得含粘性末端的目的基因。酶切反应体系包括:DNA片段25 μ I (6 μ g)，Nco I和BamH I各2.5 μ I (25U)，10ΧΚ Buffer5y l,lmg/ml BSA5 μ 1，无菌双蒸水10 μ 1，反应总体积50 μ I。将酶切后的目的基因与同样用Nco I和B amH I双酶切的表达载体pET_32a (购自TAKARA公司)连接。连接条件:目的基因与pET-32a载体以摩尔比1:1比例连接，按总体积20 μ I的1/10加入高效连接液2 μ I于16°C连接16h。取连接产物10 μ I转化感受态细胞Ε.coli ToplO (购自上海杰李生物有限公司)。提取单克隆转化菌落质粒进行酶切及测序鉴定。酶切鉴定的反应体系:重组表达质粒15 μ I,Nco I和BamH I各1.5 μ I, IOXK buffer3 μ I,无菌双蒸水9 μ 1，反应总体积30 μ 1，于37°C酶切2h，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测(图4)。对经酶切鉴定结果阳性的单克隆质粒，委托上海杰李生物科技有限公司进行序列测定。测序结果用DNASTAR软件分析，测序正确的重组质粒分别命名为pET32a-Tat( Λ 31-45)。1.3、Tat ( Λ 31-45)融合蛋白的表达和纯化常规氯化钙法制备大肠杆菌BL21_TRXB(DE3)感受态细菌；取上述重组质粒pET32a-Tat ( Δ 31-45) 200ng加至200 μ I感受态细菌BL21-TRXB (DE3)(购自上海杰李生物有限公司)中，冰水浴30min，42°C、90s，再冰水浴l_2min后加800 μ I的LB培养基于37°C、150rpm培养Ih后涂LB培养基平板(含100yg/ml Amp和35 μ g/ml Kana)，于37°C培养过夜。次日挑取单克隆转化菌落接种至3ml LB液体培养基(含100 μ g/ml Amp和35 μ g/ml 1^的)，于371:、150印111振荡培养过夜后，取50(^1过夜菌液，加500 μ I甘油制备甘油保存菌种于_20°C保存；另按1:10的接种量将过夜培养的菌液转接到新鲜的3ml LB培养基中(含 100 μ g/ml Amp 和 35 μ g/ml Kana)，于 37°C、220rpm 振荡培养 3h 至 OD6tltl 为1.0时,加IM的IPTG3 μ I至终浓度ImM,诱导培养4h,于IOOOOrpm离心3min,弃上清,沉淀加300 μ 10.0lM磷酸盐缓冲液(PBS)重悬后，取20 μ I PBS重悬液加入2 X SDS点样液20 μ I混匀，制成SDS样品，同时收集未经IPTG诱导的菌液及空菌BL21-TRXB(DE3)培养液按同法制成SDS样品后，进行SDS-PAGE电泳检测:制备12%SDS聚丙烯酰胺凝胶，将上述SDS样品及蛋白标准品沸水浴5分钟，加样，初始加压5V/cm，待溴酚蓝进入分离胶后提高至12V/cm，直至溴酚蓝达分离胶底部。电泳结束，取出凝胶用考马斯亮蓝染色过夜，再置于甲醇-冰醋酸溶液中脱色3-4小时。结果可见含有重组质粒pET32a-Tat( Λ 31-45)的克隆在相对分子质量约27.6千道尔顿(KDa)处表达目的融合蛋白条带，未经IPTG诱导的菌液及空菌BL21-TRXB(DE3)培养液未见该条带。经Glyko BandScan5.0软件分析，蛋白的表达量约占菌体总蛋白比例分别为55%。随后对阳性细菌克隆进行大量诱导表达及纯化:将含pET32a-Tat ( Δ 31-45) /BL21甘油菌种按照1:10接种量接种至50ml LB培养基中(含100 μ g/ml Amp和35 μ g/ml Kana),于37°C、170rpm振荡培养过夜后,转接至新鲜的450mlLB 中(含 100 μ g/ml Amp 和 35 μ g/ml Kana),于 37°C、220rpm振荡培养 3.5h 至 OD600 为1.0，之后加IM IPTG500l.! I至终浓度为ImM，再于37°C、220rpm振荡培养4h后收集菌液，于4°C、5000rpm离心lOmin，弃上清，沉淀加入30ml8M尿素(pH8.0)裂解，于4°C过夜。次日，裂解产物于4°C、IOOOOrpm离心30min，取上清至另一离心管中，取其中20 μ I上清液加2 X SDS点样液20 μ I混匀制成SDS样品后，经12% SDS-PAGE电泳检测分析；取上清过金属螯合亲和层析介质柱(N1-NTA，购自德国QIAGEN公司)，N1-NTA柱以8M尿素(pH8.0)平衡，尿素裂解液上清上柱，8M尿素(pH7.0)洗柱，以8M尿素(pH4.5)洗脱，收集洗脱峰，用0.1M Tris中和，以PBS透析，经12% SDS-PAGE分析纯化效果，结果显示在相对分子量约27.6KDa处可见清晰目的融合蛋白条带，经GlykoBandScan5.0软件分析显示重组蛋白纯化后纯度为90.0%(图 5)。1.4、Tat ( Λ 31-45)融合蛋白的 Western blot 检测取出SDS-PAGE电泳凝胶作适当修剪，浸泡于转移缓冲液中准备转膜；剪12张与凝胶大小一致的滤纸与I张硝酸纤维素膜，带手套操作，将滤纸与硝酸纤维素膜用转膜缓冲液浸泡15分钟后，将6张滤纸整齐叠放，凝胶置于其上(靠近负极)，将硝酸纤维素膜(靠近正极)置于凝胶上，再叠放6张滤纸，在300mA条件下进行蛋白稳流转膜50min ;转膜结束后加适量封闭液(含0.01mol/L PBS,10%脱脂奶粉、0.l%Tween-20、0.2%柳硫汞)于4°C封闭过夜；用PBST洗液洗涤5次，加入小鼠抗Tat单克隆抗体(购自abeam公司)(1:1000稀释)，37°C孵育2h，漂洗液洗5次，加入辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG-HRP (购自abeam公司)(1: 1000稀释)，37°C孵育45min，漂洗液洗涤5次，加入底物二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)显色5_10分钟，出现棕色条带后立即用蒸懼水冲洗，终止显色反应。结果可见Tat ( Λ 31- 45)-PET融合蛋白和全长Tat融合蛋白均与小鼠抗Tat单克隆抗体呈阳性反应，而pET32a载体蛋白则无此反应(图6)。实施例2:通过制备和标记获得Tat蛋白金标体免疫复合物，并对其进行质量鉴定。2.1、胶体金的制备0.01%氯金酸溶液IOOml加热至沸腾，200rpm搅动下准确加入1%柠檬酸三钠
0.7ml，金黄色氯金酸溶液变成紫红色。继续加热搅拌15min，冷却后定容到100ml。2.2、电子显微镜检测胶体金颗粒大小和均一度透射电子显微镜检测胶体金颗粒大小和均一度，发现胶体金平均颗粒直径为75nm，均一度较好(图7)。2.3、Tat Λ (31-45) -PET蛋白标记胶体金溶液取纯化后Tat ( Δ 31-45) -PET 蛋白对 0.005Mol/L pH 9.0NaCl 溶液 4°C透析 9 小时后测定蛋白浓度。以0.1Mol/L K2C03或0.1Mol/L HCl调节胶体金溶液pH值到9.6，搅拌加入透析后Tat ( Λ 31-45)-PET蛋白直到溶液不再被10%NaCl聚沉为止，1200rpm离心lOmin，分离上清和沉淀，测定上清中蛋白浓度后，加入适量上清重悬沉淀配成蛋白吸附量为0.lmg/ml的Tat ( Λ 31-45)-PET蛋白金标体溶液备用。2.4、NaCl聚沉实验鉴定Tat Δ (31-45)蛋白金标体稳定性取以上金标体溶液2管 ，每管50ul，各加入5ul 10 % NaCl溶液后静置2h，观察聚沉情况。结果发现未结合Tat Δ (31-45)-PET蛋白的胶体金溶液在加入10% NaCl溶液后发生聚沉，溶液颜色由酒红色变为蓝灰色，而结合了足量Tat Δ (31-45) -PET蛋白的胶体金溶液在加入10% NaCl溶液后保持稳定，溶液颜色不发生变化，仍保持酒红色。2.5、NaCl聚沉鉴定不同pH条件下Tat Δ (31-45)蛋白金标体稳定性取以上金标体溶液7管，每管50ul,各加入5ull0% NaCl溶液后0.lMol/LK2C03或 0.1Mol/L HCl 调节其 pH为 2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0,12.0,13.0。静置2h，观察聚沉情况。结果发现Tat ( Δ 31-45) -PET蛋白金标体在pH5.0-11.0范围内均能保持稳定，不发生聚沉。当PH值小于5.0或大于11.0时，加入10% NaCl溶液后，溶液颜色由酒红色变为蓝灰色，表明Tat Δ (31-45)-PET蛋白金标体复合物发生聚沉。实施例3:通过动物免疫试验检测Tat突变体免疫原性的改变及胶体金标记对其表位展示的影响3.1、动物免疫实验初次免疫取纯化后全长Tat-PET、Tat ( Δ 31-45)-PET融合蛋白和Tat( Λ 31-45)-PET蛋白金标体各100 μ I (蛋白含量均为0.0lmg)分别与弗氏完全佐剂等体积混合后，于脚掌和腹部皮下注射免疫健康雌性六周龄C57BL小鼠(第二军医大学实验动物中心)，每组5只实验小鼠；之后每2周进行一次加强免疫，免疫用弗氏不完全佐剂，共加强免疫3次，方法及剂量均与初次免疫相同。同时设立胶体金和生理盐水对照组。最后一次免疫两周后摘除眼球取血，约1.2ml/只，IOOOOrpm离心lOmin，取上层血清于_40°C冻存备用。3.2、免疫小鼠血清的ELISA检测将纯化的HIV-1全长Tat融合蛋白(Tatl-101-PEP)及3种Tat突变体融合蛋白(Tat1-21 -PEP, Tat 38-61-PEP 和 60-101-PET)分别用 50mM 碳酸盐缓冲液(ρΗ9.6)按 1:200稀释包被96孔酶联反应板，每种抗原包被5排复孔，0.5 μ g/孔，37°C孵育2h，弃包被液，加180 μ 110%脱脂奶粉于37°C封闭2h，用PBST洗液洗涤4次后，分别加入1:2倍比稀释的小鼠抗 Tatl-1Ol-PET 血清、抗 Tat ( Δ 31-45)-PET 血清、抗 Tat ( Δ 31-45)-PET 蛋白金标体血清、胶体金溶液组小鼠血清和生理盐水组小鼠血清各100μ 1，最后I孔不加，37°C孵育45min，用PBST洗涤5次，加入HRP标记的羊抗兔IgG (1:1000稀释)，100 μ I/孔，37°C孵育45min, PBST 洗漆 5 次，经 3，3' ,5,5'-四甲基联苯胺(3，3' ,5,5' -tetramethylbenzidine, TMB)显色，加2mol/L硫酸终止反应，用酶标仪(Bio Rad)于450nm波长处测定吸光度值(A450)。用生理盐水组小鼠血清作为阴性对照，以高于阴性对照A45tl值3倍的数值作为阳性判断标准。抗Tat ( Λ 31-45)蛋白小鼠抗血清和抗Tat ( Λ 31_45)蛋白金标体小鼠抗血清均与HIV-1全长Tat蛋白呈特异性反应，标记胶体金后可明显增强Tat ( Λ 31-45)蛋白的免疫原性(图8)。与抗全长Tat小鼠抗血清相比，Tat ( Δ 31-45)及其金标体免疫小鼠抗血清均与Tat N端和Tat38-61抗原的反应性增强(图9A、9B) ;Tat( Λ 31-45)标记胶体金后免疫小鼠抗血清与Tat38-61抗原的反应性更强(图9B);抗全长Tat、抗Tat ( Λ 31-45)和抗Tat (Δ 31-45)金标体三者小鼠抗血清与Tat60-101反应性均明显高于对照组，但三者之间无明显差异(图9C)。 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
序列表SEQUENCE LISTING
〈110〉中国人民解放军第二军医大学
<120〉一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用<130〉说明书，权利要求书
<160>7
<170〉PatentIn version 3.3
〈210〉 I<211> 86<212〉 PRT〈213〉人工序列〈400〉 I
Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser151015
Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Ser Tyr202530`
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln354045

权利要求
1.人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体在制备HIV免疫原中的应用。
3.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体在制备预防和治疗性HIV疫苗中的应用。
4.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体在制备HIV检测试剂盒中的应用。
5.编码如权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
6.根据权利要求5所述的编码人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体的核苷酸序列在制备HIV免疫原中的应用。
7.根据权利要求6所述的编码人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体的核苷酸序列在制备HIV免疫原中的应用，其特征在于，是将该编码人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体的核苷酸序列，构建其重组原核表达质粒，经过转化大肠杆菌，用异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达后，与直径75±15nm的胶体金颗粒结合形成一种免疫原复合物。
8.根据权利要求7所述的编码人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体的核苷酸序列在制备HIV免疫原中的应用，其特征在于，对HIV-1天然Tat分子结构进行改造，截去Tat蛋白中疏水区段31-45氨基酸后克隆至原核表达质粒pET-32a上，转化大肠杆菌BL21，用异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖 苷诱导表达，经镍柱纯化后与直径75± 15nm的胶体金颗粒结合形成免疫复合物。
9.根据权利要求5所述的编码人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体的核苷酸序列在制备预防和治疗性HIV疫苗中的应用。
10.根据权利要求5所述的编码人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体的核苷酸序列在制备HIV检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用。本发明提供的一种人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体，是缺失疏水区的Tat△(31-45)突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了该Tat蛋白突变体在制备HIV免疫原、预防和治疗性HIV疫苗、HIV检测试剂盒中的应用，本发明的Tat△(31-45)突变体蛋白及其金标体颗粒均有助于该蛋白构象的稳定、免疫原性的增强以及该蛋白N端和第46-61位氨基酸表位的展示，有望作为HIV疫苗开发和HIV感染检测诊断的候选抗原。
文档编号C12N15/49GK103073625SQ20131002062
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者曹洁, 杨界, 潘卫, 张华群, 王锦红, 廖文婷, 祁培培, 陈秋莉, 丁超, 何婷, 丁莹莹 申请人:中国人民解放军第二军医大学