一种海带内生坚强芽孢杆菌蛋白及其在抗肿瘤方面的应用的制作方法
【专利摘要】一种海带内生坚强芽孢杆菌蛋白，按如下步骤制备：取海带内生坚强芽孢杆菌，该菌株在pH=9的蔗糖蛋白胨液体培养基中25℃发酵6天，所述蔗糖蛋白胨液体培养基中蔗糖和蛋白胨的质量所占的百分比分别为5%和1%；在8000r/min条件下离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为90%，4℃静置过夜，过滤将沉淀用蒸馏水溶解后，再用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥，得海带内生坚强芽孢杆菌蛋白。该蛋白抗肿瘤活性强，制备工艺简单、成本低廉。
【专利说明】一种海带内生坚强芽孢杆菌蛋白及其在抗肿瘤方面的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，特别是一种海带内生坚强芽孢杆菌蛋白及其在抗肿瘤方面的应用。
【背景技术】
[0002]海带QMmirmria Japonica Aresch)是一种在低温海水中生长的大型海生褐藻植物。它生长于水温较低的海洋中，分布于中国北部沿海及朝鲜、日本和苏联太平洋地区沿岸，在中国北部及东南沿海有大量养殖。海带主要是自然生长，也有人工养殖，多以干制品行销于市，质量以色褐、体短、质细而肥厚者为佳。海带有“长寿菜”、“海上之蔬” “含碘冠
军”的美誉。
[0003]海带作为一种重要的海洋资源，其食用与药用价值早为世人所知。从海带中提取的有效成分具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗HIV和增强免疫功能，对治疗心脑血管疾病和中、早期慢性肾衰等均有一定的作用。海带中还含有一些共附微生物，但这些微生物及其代谢产物迄今未止还没有被充分利用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种制备工艺简单、成本低廉的海带内生坚强芽孢杆菌蛋白及其在抗肿瘤方面的应用，克服现有技术的不足。
[0005]本发明的海带内生坚强芽孢杆菌蛋白，按如下步骤制备:
1)取海带内生坚强芽孢杆菌DNN7(Bacillus firmus DNN7)，该菌株已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCCNo: 7076 ；
2)以海带内生坚强芽孢杆菌DNN7为材料，该菌株在pH9的蔗糖蛋白胨液体培养基中25°C发酵6天，所述蔗糖蛋白胨液体培养基中蔗糖和蛋白胨的质量所占的百分比分别为5% 和 1% ；
3)在8000 r/min条件下离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为90%，4°C静置过夜，过滤将沉淀用蒸馏水溶解后，再用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥，得海带内生坚强芽孢杆菌蛋白。
[0006]本发明的海带内生坚强芽孢杆菌蛋白在抗肿瘤方面的应用。
[0007]本发明的海带内生坚强芽孢杆菌蛋白即从海带内生坚强芽孢杆菌DNN7菌株的发酵液中所提取的抗肿瘤活性蛋白，具有抑制肝癌细胞HePG2、乳腺癌细胞MDA-MB-231、白血病细胞K562和神经母细胞瘤SH-SY5Y多种肿瘤细胞的活性，抗肿瘤活性强，并可促进肿瘤细胞NO的产生，并对海虾无节幼体具有一定毒性，可应用于制备抗肿瘤药品，具有产业价值。本发明的制备工艺简单、成本低廉。
[0008]本发明中的海带内生坚强芽孢杆菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCC No: 7076【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1是本发明的蛋白对白血病细胞K562的影响示意图；
图2是本发明的蛋白对乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响示意图。
【具体实施方式】
[0010]本发明实施例依次按如下步骤进行:
a.将刚打捞的新鲜海带，在超净工作台内用无菌水清洗5遍后，再用75%酒精漂洗30-90s (30s 一个梯度)，无菌水冲洗；0.1%氯化汞漂洗6-18s (6s 一个梯度)，无菌水冲洗多次。将不同灭菌时间梯度的海带片都分成两份，一份用灭菌研钵研碎后接种到培养皿上作为实验组，另一份直接放入空白培养基做对照组。倒置于37°C温室中培养5~14天，观察选取较好的实验条件，即选择实验组中内生菌生长良好，而对照组中无菌落长出的灭菌时间梯度作为海带表面灭菌条件。海带表面灭菌充分研磨后，将200 μ L研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，25°C恒温培养5~7天。 [0011]b.挑取单个形态各异的菌落反复划线培养至出现纯菌株，用滤纸片法检测各纯菌株的抑菌活性作为初步筛选标准，得到活性菌株DNN7，该菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCC No: 7076。
[0012]通过耐盐性试验、对溶菌酶抗性试验、V.P实验、苯丙氨酸、丙二酸盐实验、柠檬酸盐利用、产糊精结晶、油脂水解、淀粉水解、二羟丙酮的形成、过氧化氢酶、酪氨酸水解、产硫化氢、明胶水解、对溶菌酶抗性、石蕊牛乳实验、糖发酵、硝酸盐还原、产生吲哚、动力实验、卵磷脂酶、甲基红实验、酪素水解等生理生化试验将其鉴定到种，该活性菌株为坚强芽孢杆菌。
[0013]c.以抑菌圈平均直径为指标，优化坚强芽孢杆菌DNN7的次级代谢产物产生的较佳条件，结果表明较佳培养条件为在PH 9的蔗糖蛋白胨液体培养基中25°C发酵6天，所述蔗糖蛋白胨液体培养基的质量百分比分别为5%和1%。
[0014]d.将上述发酵液8000 r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为90%，4°C静置过夜，过滤，将沉淀用蒸馏水溶解后，再用至少3600道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥，SDS-PAGE电泳结果表明，冷冻干燥的透析袋中物质为蛋白质。
[0015]e.取冻干样品用DMEM溶解，培养肿瘤细胞(肝癌细胞HePG2、乳腺癌细胞MDA-MB-231、白血病细胞K562和神经母细胞瘤SH-SY5Y，样品设定浓度梯度，用MTT法测蛋白作用后肿瘤细胞存活率。具体操作如下:
O抗肿瘤活性的检测:首先培养肿瘤细胞，将肝癌细胞HePG2、乳腺癌细胞MDA-MB-231、白血病细胞K562和神经母细胞瘤SH-SY5Y复苏到20%的血清培养集中，培养4飞天，接种到六孔板中，换成10%培养基培养，细胞密度达到2*106后接种到96孔板中，每空100 yL，过夜；将蛋白用DMEM溶液溶解，然后用DMEM做梯度稀释(10、20、30、40、60、80、100、150、200、300 μ g/mL)，将96孔板中培养基弃掉加入蛋白样品孵育6小时，空白对照只加DMEM。配制MTT，6小时后每空加入10 μ L MTT，孵育4小时，然后将孔内液体弃掉，每空加入100 μ L DMSO溶解紫色结晶，37°C水浴保持20分钟。然后用酶标仪在490nm下测吸光度值进而处理数据计算细胞存活率。结果以对白血病细胞K562的影响和对乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响为例作图(如图1、图2所示)。
[0016]实验结果表明，该菌株蛋白在低剂量范围内(10 yg/mL)就开始有一定的抑制活性，抑制效果有一定的剂量效应，当在300 μ g/mL时对肝癌细胞HePG2、乳腺癌细胞MDA-MB-231、白血病细胞K562的抑制率分别为42.9%, 85.7%, 96.47% ;在180 μ g/mL时对神经母细胞瘤SH-SY5Y的抑制率为70.49%。该蛋白具有作为粉剂或针剂用于抗肿瘤药物制备的潜力。
[0017]2)海虾毒性实验:取本发明蛋白样品(8 mg/mL)0.05mL加到3个带刻度的试管中，再在每试管中加入约4 mL海水和10只健康的海奸无节幼体,最后用海水加至5 mL ;取3只试管，也加入10只健康的海虾无节幼体，再用海水加至5 mL，作为空白对照。24°C置日光灯下，24 h后计数存活海虾。每个实验重复三次。实验结果表明小虾存活率为5%，而空白对照无一死亡，因此该蛋白具有一定的海虾毒性活性。海虾幼虫曾被许多活性测试系统应用，有研究发现海虾毒性法和9KB (人鼻咽癌)细胞毒性实验呈现很好的相关性(P =01036，kappa = 0156)。细胞毒的ED50 —般是海虾毒LD50的I/ 10，可用海虾毒性法代替昂贵而繁杂的体内体外抗肿瘤实验，指导对具细胞毒和3PS ( P388，体内老鼠白血病)活性提取物的分离。海虾毒性法具快速(24h)、便宜和简单(如不需无菌操作)等优点，实验结果表明:本发明实施例所制备的DNN7菌株蛋白质有抗肿瘤活性，可应用于抗肿瘤药物的制备。
[0018]3)对神经母 细胞瘤NO的影响
肿瘤细胞接种在含有10%小牛血清的RPM1-1640培养液中，在培养基中加入100国际单位青霉素和链霉素，PH7.1，置于37 °C>5% CO2培养箱中培养。细胞呈单层生长达到70% -80%密度饱和时，进行传代，传代时用0.25%胰酶消化。
[0019]标准品浓度为0、1、2、5、10、20、40、60、100 ymol/L，酶标仪在540nm下测吸光值。以标准品浓度为横坐标，相应的OD54tl值为纵坐标绘制标准曲线
实验分为阴性对照组(未经试样处理的细胞悬液)，实验组加入不同浓度的蛋白溶液(10，30，90，180和360 μ g/mL)，每个浓度做5个复孔。取对数生长期的肿瘤细胞，调细胞浓度I~3X IO4个/mL，将细胞悬液加入96孔培养板中，每孔100 yL，于饱和湿度37 0C 5%CO2培养箱中培养24 h，细胞完全贴壁后，实验组加入蛋白溶液150 μ L(对照为无菌水)，饱和湿度37°C 5% CO2培养箱中培养24h，每孔取50 μ L上清于新的96孔培养板中，每孔加入50 μ L室温下Griess Reagent I和Griess Reagent II,在脱色摇床上混匀，用酶标仪于540 nm波长处测定各孔的OD值。结果表明蛋白在180 yg/mL和360 μ g/mL时能明显增加NO的量，因此该蛋白的抗肿瘤做用至少部分通过NO信号途径起作用。
【权利要求】
1.一种海带内生坚强芽孢杆菌蛋白，其特征在于:按如下步骤制备: 1)取海带内生坚强芽孢杆菌DNN7(.Bacillus firmus DNN7)，该菌株已于2013年I月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCC No:7076 ； 2)以海带内生坚强芽孢杆菌DNN7为材料，该菌株在pH9的蔗糖蛋白胨液体培养基中25°C发酵6天，所述蔗糖蛋白胨液体培养基中蔗糖和蛋白胨的质量所占的百分比分别为5% 和 1% ； 3)在8000 r/min条件下离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为90%，4°C静置过夜，过滤将沉淀用蒸馏水溶解后，再用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥 ，得海带内生坚强芽孢杆菌蛋白。
2.一种根据权利要求1所述的海带内生坚强芽孢杆菌蛋白在抗肿瘤方面的应用。
【文档编号】C12R1/07GK103966284SQ201310034683
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月30日 优先权日:2013年1月30日
【发明者】张付云, 徐凤, 杨阳, 王维才, 何云海 申请人:大连海洋大学, 张付云