一种海参源枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】一种海参源枯草芽孢杆菌按如下方法获得：将打捞出水的新鲜海参，在超净工作台内用无菌水清洗5遍后，取干净、新鲜的海参体壁用研磨机充分研磨成均浆后，将研磨液均匀涂布于现有的牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37℃恒温条件下培养2天；挑取单个形态各异的菌落反复划线培养至出现纯菌株，得海参源（共附生菌株）枯草芽孢杆菌HS22（BacillussubtilisHS22）菌株。本发明提供的菌株及其代谢产物抑菌活性强，对植物有促生长作用，并对海虾无节幼体具有一定毒性，制备方法简单，成本低廉，菌株及其代谢产物可应用于医药抑菌、抗肿瘤、生物防治、食品保鲜、防腐和化妆品添加剂等领域，具有产业价值。
【专利说明】一种海参源枯草芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业、食品及医药领域，特别是一种海参源(共附生菌株)枯草芽孢杆菌HS22 (.Bacillus subtilis HS22)菌株及其在对细菌和植物病原菌的生长抑制、对植物的促生长、其代谢产物在抑菌方面的应用。
【背景技术】
[0002]海参属棘皮动物门(Echinodermata)、海参纲动物(Holothuroidea)。全世界约有1200种海参，主要生活在热带和温带的海洋中，常见的可食海参有刺参、梅花参、白瓜参，这些海参除了食用价值之外，还含有丰富的生物活性物质，如海参毒素、海参多糖、海参皂苷、脂肪酸、多肽、海参神经节苷酯等，这些成分具有多种生物活性。另海参体内及肠道内生活着大量的细菌，这些细菌具有独特的结构与功能，但这些微生物及其代谢产物迄今未止还没有被充分利用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种制备工艺简单、成本低的海参源(共附生菌株)枯草芽孢杆菌HS22 {Bacillus subtilis HS22)菌株，以利用海参体内的有益物质，在细菌和植物病原菌的生长抑制方面、对植物的促生长方面发挥作用。
[0004]本发明的一种海参源枯草芽孢杆菌，按如下方法获得:
a.将打捞出水的新鲜海参，在超净工作台内用无菌水清洗5遍后，取干净、新鲜的海参体壁用研磨机充分研磨成均浆后，将研磨液均匀涂布于现有的牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37°C恒温条件下培养2天。
[0005]b.挑取单个形态各异的菌落反复划线培养至出现纯菌株，即得海参共附生枯草芽孢杆菌HS22 (Bacillus subtilis HS22)，该菌革兰氏阳性芽孢杆菌，原生质中无不着色颗粒，过氧化氢酶阳性，厌氧不能生长，V.P反应阳性，V.P反应之后的pH值7.2，对溶菌酶、叠氮化钠有抗性，能产生卵磷脂酶，PH5.7生长，7%的NaCl中生长，生长温度15~45°C，单个菌落圆形，白色，菌落边缘不光，表面有光泽，易挑取；该菌株已于2013年I月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCC No: 7080。
[0006]本发明的一种海参源(共附生菌株)枯草芽孢杆菌HS22 {Bacillus sub tillsHS22)菌株的在对细菌和植物病原菌的生长抑制、对植物的促生长、其代谢产物在抑菌方面的应用。
[0007]本发明提供的海参源(共附生菌株)枯草芽孢杆菌HS22 {Bacillus sub tillsHS22)菌株及其代谢产物抑菌活性强，对植物有促生长作用，并对海虾无节幼体具有一定毒性，制备方法简单，成本低廉，菌株及其代谢产物可应用于医药抑菌、抗肿瘤、生物防治、食品保鲜、防腐和化妆品添加剂等领域，具有产业价值。
[0008]本发明中的海参共附生枯草芽孢杆菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCC No: 7080。
【具体实施方式】
[0009]本发明的海参源(共附生菌株)枯草芽孢杆菌HS22 {Bacillus subtilis HS22)菌株按如下方法获得，
a.将刚打捞的中国黄海海域的新鲜海参，在超净工作台内用无菌水清洗5遍后，取干净、新鲜的海参体壁用研磨机充分研磨后，将200 μ L研磨液均匀涂布于现有的牛肉膏蛋白胨平板培养基上，37 °C恒温培养2天。
[0010]b.挑取单个形态各异的菌落反复划线培养至出现纯菌株，即得海参共附生枯草芽孢杆菌HS22 (Bacillus subtilis HS22)菌株，该菌革兰氏阳性芽孢杆菌，原生质中无不着色颗粒，过氧化氢酶阳性，厌氧不能生长，V.P反应阳性，V.P反应之后的PH值7.2，对溶菌酶、叠氮化钠有抗性，能产生卵磷脂酶，PH5.7生长，7%的NaCl中生长，生长温度15~45°C，单个菌落圆形，白色，菌落边缘不光，表面有光泽，易挑取；该菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCC No: 7080。
[0011]用滤纸片法检测各纯菌株的抑菌活性。
[0012]抑菌活性的检测:大肠杆菌co7i (EC)、变形杆菌/7Toiew1S vulgaris(?^0、金黄色葡萄球菌5^<3/7力_770<^9<^^/5.aureus (SA)、产气杆菌aerogenes(EA)和枯草芽孢杆菌(BS)均采用现有的牛肉膏蛋白胨培养基。上述各菌均受赠于中科院大连化学物理研究所。将各菌种分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，振荡培养24 h作指示菌。
[0013]分别用移液枪取指示菌液100 μ L于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，用无菌三角涂棒涂抹均匀，然后用记号笔在培养皿底部的外面将牛肉膏蛋白胨固体培养基培养皿分成六个区，每个区分别放入一张滤纸片，再分别用移液枪移取海参共附菌株(纯菌株)发酵物样品10 μ L滴到滤纸片中央，置于37°C培养箱中培养三天。每个纯菌株做3次重复处理，阳性对照为75%酒精，阴性对照为无菌水。观察指示菌的生长情况，测定抑菌圈的直径大小。
[0014]其中HS22菌株发酵液对金黄色葡萄球菌、产气杆菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用，抑菌圈平均直径为10 mm，对该抑菌活性菌株利用16SRNA分子鉴定确定其为芽孢杆菌属，通过耐盐性试验、对溶菌酶抗性试验、V.P实验、苯丙氨酸、丙二酸盐实验、柠檬酸盐利用、产糊精结晶、油脂水解、淀粉水解、二羟丙酮的形成、过氧化氢酶、酪氨酸水解、产硫化氢、明胶水解、对溶菌酶抗性、石蕊牛乳实验、糖发酵、硝酸盐还原、产生吲哚、动力实验、卵磷脂酶、甲基红实验、酪素水解等生理生化试验将其鉴定到种，该活性菌株为枯草芽孢杆菌。
[0015]c.采用正交试验(Table I)对HS22菌株进行抑菌条件优化，利用极差分析法对试验结果进行分析，得到分别得到抑制不同指示菌的最优条件，通过综合平衡分析和实验验证，评价其抑制细菌指示菌活性的较优条件为淀粉、硝酸钾、NaCl, K2HP04、MgS04、FeS04的添加量分别为1.5%、2%、0.05%,0.05%,0.05%,0.001%，控制培养基初始pH为5，40°C培养4 cL
[0016]Tablel Orthogonal factors and levels
【权利要求】
1.一种海参源枯草芽孢杆菌，其特征在于:按如下方法获得: a.将打捞出水的新鲜海参，在超净工作台内用无菌水清洗5遍后，取干净、新鲜的海参体壁用研磨机充分研磨成均浆后，将研磨液均匀涂布于现有的牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37°C恒温条件下培养2天； b.挑取单个形态各异的菌落反复划线培养至出现纯菌株，即得海参共附生枯草芽孢杆菌HS22(Bacillus subtilis HS22)，该菌革兰氏阳性芽孢杆菌，原生质中无不着色颗粒，过氧化氢酶阳性，厌氧不能生长，V.P反应阳性，V.P反应之后的PH值7.2，对溶菌酶、叠氮化钠有抗性，能产生卵磷脂酶，PH5.7生长，7%的NaCl中生长，生长温度15~45°C，单个菌落圆形，白色，菌落边缘不光，表面有光泽，易挑取；该菌株已于2013年I月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCC No: 7080。
2.一种根据权利要求1所述的一种海参源枯草芽孢杆菌的应用。
【文档编号】C12N1/02GK103966115SQ201310034682
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月30日 优先权日:2013年1月30日
【发明者】张付云, 刘晔, 王维才, 苍桂璐, 卢航 申请人:大连海洋大学, 张付云