极端嗜盐菌的培养配方及工艺的制作方法
【专利摘要】本发明为极端嗜盐菌的培养配方及工艺，极端嗜盐菌是提取“紫膜”的原料，从盐湖中提取似大海捞针，用蛋白胨、牛肉膏培养，成本价高，极端嗜盐菌生长需要营养复杂，本发现提供了廉价的风化煤、褐煤、泥碳为主料的培养配方，可以快速高效繁殖极端嗜盐菌，为提取紫膜提供了方便快捷廉价的原料，降低紫膜成本，让紫膜能走出试验室，为修复DNA做贡献。
【专利说明】极端嗜盐菌的培养配方及工艺
[0001]所属领域:生物技术【背景技术】
[0002]嗜盐菌、Halophiles)是生活在高盐环境中的古细菌，他生长在盐湖(中国青海湖、新疆死海、美国大盐湖)盐场的浓缩的海水中，一般生活在含盐10-30%的盐液中。
[0003]嗜盐菌可分为三类:一类是提能耐受一定盐浓度的盐溶液，但在无盐环境中生长最佳的一类微生物，称为耐盐菌:二类是指在盐浓度从零点到饱和的环境中均能生长，但其最佳生长需要一定盐浓度的特殊微生物，称为广域嗜盐菌；三类是指菌体生长需要一定的盐浓度，且在一定的盐浓度生长最佳的微生物，这类微生物称为嗜盐菌。根据对盐的不同需要，嗜盐菌可以分为弱嗜盐菌、中度嗜盐菌和极端嗜盐菌。
[0004]Na+对维持细胞膜，细跑壁的构造有特别重要怍用。阻止嗜盐菌的溶菌和维持细胞完整性的重要作用。嗜盐菌的细胞壁以糖蛋白代替传统的肽聚糖，这种糖蛋白含有天门冬氨酸和谷氨酸，这些酸性氨基酸在蛋白表面形成负电屏蔽，捉进蛋白在高盐环境中的稳定，当极端嗜盐菌限制通气，即低氧压和厌氧情况下光照培养，极端嗜盐菌产生红紫色菌体，这种菌体的细跑膜 上，有紫膜片组织，约占全膜50%，由25%的脂类和75%的蛋白质组成。由三个BR分子构成的三聚体可在细胞膜上形成一个刚性的二维六边形的稳定，特征结构，即紫膜。紫膜中含有菌视蛋白与类胡萝卜素类的色素，以1:1结合组成。
[0005]嗜盐菌的生长需要离钠环境，但细胞内的钠浓度并不高，因为它们的光介导的H+质子泵具有Na-K-反向转运功能，即具有吸收和浓缩钾向胞外排放Na+的功能。嗜盐菌是采用细胞膜内积累高浓度的K+对抗胞外高渗环境。随着培养及食盐的增加，氨基酸浓度有规律的增加，其中主要为谷氨酸、脯氨酸及甘氨酸，它们具有渗透保护作用。
[0006]极端嗜盐菌广泛存在于海水中的晒盐场，盐湖，古海洋沉积物等高浓度盐环境中的一大类极端微生物，其中蕴藏着丰富的极端嗜盐酶类，特殊脂类，生物表面活性物质，蛋白抗生素(嗜盐菌紫)生物钠米材料“紫膜”，和生物可讲解塑料前期物PHA等。
[0007]以上这些物质被发现，但由于嗜盐古细菌获得是从盐湖死海中近乎大海捞针，分离和繁殖不是易事，原料的供应，设备的精良、工艺的复杂，紫膜的秘诀，在世界上把紫膜的价格变成“天价”，虽然用途广泛，但价格昂贵，挡住了研究试验和使用的去路。
[0008]要生产“紫膜”第一步首先要解决大量的极端嗜盐菌，不能靠大海捞针的方法，或用蛋白陈、牛肉膏等贵重原料在试验室去培养繁殖，因为极端嗜盐菌生长需要营养极复杂，给生产带来困难。经过反复试验发现一种高效繁殖极端嗜盐菌的配方，可以在短时间内把极端嗜盐菌繁殖到430亿/克的含菌量。(其中一部分是嗜盐杆菌，不属于极端嗜盐菌，但不影响提取紫膜)主要内容，
[0009]极端嗜盐菌的培养配方及工艺
[0010]1、将300克湖盐、3克K2O, 30克黄豆粉，100克极端嗜盐菌〈用常规方法从含30%的盐湖水中分离出来的极端嗜盐菌浓度0.2亿/克以上)，放入600克无菌水中溶器中搅匀；[0011]2、将1000克荷选粉碎过100目过筛的风化煤粉放入配好的1033克物料的溶器中搅匀；
[0012]3、将2033克配好的物料放入培养箱中，加温25° -35° °C，湿度75° -85° °C，用日光灯波长550-600nm，照射(时间和墙养时间相同)；
[0013]4、培养箱自然供氧培养七天后，用低氧压或厌氧环境培养14天，待极端嗜盐菌发紫红色时培养即可结束(经检测极端嗜盐菌在430亿/克以上)；
[0014]荻得的极端嗜盐菌因为含量极高，可以用来提取紫膜，可以降低紫膜培养料成本；
[0015]5、风化煤、褐煤含腐植酸40%以上，泥碳含腐植酸21%以上为宜。
实施例:
[0016]极端嗜盐菌的培养配方及工艺
[0017]1、将300克湖盐、3克K2O, 30克黄豆粉，100克极端嗜盐菌(用常规方法从含30%的盐湖水中分离出来的极端嗜盐菌浓度0.2亿/克以上)，放入600克无菌水中溶器中搅匀:
[0018]2、将1000克精选粉碎过100目过筛的风化煤粉放入配好的1033克物料的溶器中搅匀；
[0019]3、将2033克配好的物料放入培养箱中，加温25° -35° °C，湿度75° -85° °C，用日光灯波长550-600nm,照射(时间和培养时间相同)；
[0020]4、培养箱自然供氧培养七天后，用低氧压或厌氧环境培养14天，待极端嗜盐菌发紫红色时培养即可结束(经检测极端嗜盐菌在430亿/克以上)；
[0021]获得的极端嗜盐菌因为含量极高，可以用来提取紫膜，可以降低紫膜培养料成本；
[0022]5、风化煤、褐煤含腐植酸40%以上，泥碳含腐植酸21%以上为宜。
[0023]嗜盐菌的分离
[0024]了解嗜盐菌在实验室中的培养方法和高产细菌视紫质(Bacteriorhodopsin, BR)的培养条件以及菌种保藏等常规工作。
[0025]二、原理
[0026]嗜盐菌在系统发生上与甲烧细菌(methanobacteria)、热酸菌(thermoacidophilic bacteria)均属于古细菌类(archaebaeteria),这种只有在极高盐浓度介质中才能生长的细菌在分类学上属于盐杆菌科(Halobacteriaceae)。已经知道，此科下有两个属:一个属为盐杆菌属(Halobacterium),如盐制品盐杆菌(H.salinarium)盐生盐杆菌(H.ha1bium);另一个属为盐球菌属(Halococcus),如鳍盐球菌(H.morrhuae)。盐杆菌科的细菌有机体具有古细菌类特征的核糖体(如16SrRNA);不具有一般细菌所具有的那种细胞壁(如细胞壁上不含有一般细菌细胞壁所具有的肽聚糖等典型组分，而是由糖蛋白组成)；有极端嗜盐的原核细胞，仅能在大于2mol/L的NaCl中才能正常生长；它们的酵系也仅在高盐的介质中才具有正常活性；它们的蛋白质含有较多的酸性氨基酸残基等。
[0027]这一科的生物大都是蛋白水解型的，属于异养成的需氧呼吸代谢类型。当它们从自然界中分离出来时，都包含有C-50类胡萝卜素，但在自然界中以及在人工培养条件下，均会遇到无色素的菌体。另外，有许多菌株还含有视黄醛(Retinal)类色素，即细菌视紫质。但BR是否存在以及它在细胞中的含量，在任何一个菌株中均与生长条件有关，因此它不是分类学上的特征。
[0028]在20世纪60年代，发现了嗜盐菌中含BR的膜，即紫膜(为细胞膜的一部分)具有光驱动的质子泵功能，并导致产生光合磷酸化。此后对这一细菌的研究有了更加广泛的兴趣，相继开展了有关光能转换、紫膜结构和功能、对极端环境的调节适应以及探讨古细菌进化途径的因子等等多方面的研究。嗜盐菌中细菌的细胞壁由糖蛋白组成，在2mol/L NaCl中会完全失去其坚硬性，在低于lmol/L NaCl的介质中，细胞壁破碎并发生溶胞。在经受中等强度的机械压力时，也能引起溶胞。这些特点是与另一属盐球菌属不同的。它们的细胞壁由坚固的硫酸盐杂多糖组成，在水中其结构也不会破坏，细胞也不呈通常的棒形。
[0029]盐杆菌的细胞所要求的生长环境，如介质中离子组分、盐浓度和PH等，常反映了它们的生态特点，如从高碱性、高盐分的沙漠湖中分离到种类都要求高PH、低镁和高NaCl浓度的介质，而从晒盐场中分离的则要求中性PH、一般镁离子浓度和高NaCl浓度的介质。
[0030]嗜盐菌生长的条件除了 NaCl盐浓度要大于2mol/L以外，还要求Na+、Mg2+为细胞外介质中的主要阳离子，而在细胞内部这类离子也保持着同样的强度，但K则是细胞内的主要阳离子。
[0031]本实验介绍的培养方法主要是以盐生盐杆菌作为对象，这是一种从盐场中分离出来的，目前世界上各实验室使用最广泛的嗜盐菌。
[0032]三、实验材料
[0033]培养盐生盐杆菌最好选用Oxoid或Inolex蛋白胨。有些蛋白胨如美国Bacto-Tryptone (Difco0123_01)或 Bacto-peptone (Difco0118_01)因含有一种能使嗜盐菌细胞溶胞的物质，故不能使用，有一些蛋白胨在准备培养基过程中会产生少量沉淀，可以在培养基未加热前用6000g离心30min(20°C )除去，或用0.45um过滤器去除。
[0034]液体培养基由蛋白胨加盐基介质(即为保持细菌正常生长所要求的离子组分和高渗浓度的介质，常简称为BS)组成，这样的培养基常简写为RM。盐生盐杆菌RM的化学配方如下:Nacl233.76g/L，MgSO4.7H209.4g/L，NasC6H5O7.2H20 (柠檬酸钠)3.0g/L, kcl2.0g/L，Oxoid L-37蛋白胨10g/L，调节PH为7.2左右。
[0035]BS即是指上面配方中不含蛋白胨和柠檬酸钠的溶液。在上述培养基中加入1.5%(质量体积分数)琼脂后即成固体培养基。121°C，灭菌15~20min。
[0036]四、方法与步骤
[0037]1.液体通气培养
[0038]细菌可在大体积、透明的玻璃瓶中培养，如20L体积的玻璃瓶，内盛4L培养液，将瓶水平放置，这样可使培养液有较大的表面接受光照。为了给以充分的光照条件，可以在瓶子的上、下两个方向各放置。
[0039]4只20W的日光灯管。虽然照明对色素形成不一定是必需的，但在照明条件下(IO6~106crg/s.cm2)可以使细菌合成最大产率的紫膜。
[0040]用I %处于稳定生长期的菌液来接种。细菌可在高达57°C下生长，但为了防止水分过分蒸发，通常调节生长温度为38~40°C，为了保证良好的有氧生长条件，瓶中必须通气，空气在未进入培养液前先流过蒸馏水，以防止培养液的过分蒸发。培养液中可用喷雾微量抗泡剂以防止泡沫大量形成。在开始生长的36h里，介质的通气量可以保持为250L/h，这样的通气量在开始生长的6h里，使4L的培养液达到氧的饱和状态，然后氧浓度迅速下降到10%的饱和水平。故在36h后，通气速率可调节到160L/h，这样的速率使得氧浓度在其后的生长期间保持为低于5%的饱和状态。在这样的氧浓度下，细菌能以最高速率合成紫膜。在IlOh生长后，此时细菌已处于稳定生长期约30h，可以收获。
[0041]细胞的生长情况可用测定在660nm处的浊度米检查，也可以进行细胞计数。紫膜生长通常在细菌生长的对数期快结束时出现，而且在氧的供应降低时有最大产率。随着培养条件的变化，紫膜的产率也会有很大差别。某些条件下可以完全不产紫膜。故在实验室中的不同条件下，需要掌握生长期间的一些参数，如对数生长期的延续时间、稳定生长期的开始时间、介质中氧的接受情况等。
[0042]2.摇瓶培养
[0043]摇瓶培养既可为较大量的液体培养准备接种液，也可用来收集紫膜。摇瓶所盛的液体通常为瓶体积的1/4~1/3。摇床振荡速率的大小控制着摇瓶内的氧气饱和程度，从而控制着紫膜的合成速率。如振荡频率为100r/min，生长6d，39°C，可以达到最大紫膜产率。而当提高至180r/min时，则菌体有较快的增长速度，但紫膜产率较低。 [0044]3.菌种保藏
[0045]菌种可以在RM固体培养基的琼脂平板上于4°C下保存6个月至I年。平板必须用石蜡严密封好后，在4°C下可保存I~2年。处于对数生长期的液体培养液(在RM基质中)在-10°C下可以保存更长时间。
[0046]4.色素突变菌株的分离
[0047]嗜盐菌细胞在RM-琼脂上形成很清晰的菌落，琼脂平板上可见有大数量的细胞，由它们形成的群体可通过双简显微镜(4X25)放大进行观察。根据不同的颜色可以很容易地识别突变菌落。特别是在反射光下，当它们与大量相邻亲缘群体进行互相对照比较时，更易区别。
[0048]在分离时，首先将在RM液体培养中所得到的菌体液在显微镜下进行计数，并用BS稀释成IO4个mL，取0.05~0.1mL均匀涂布于琼脂平板上，着平板能得到500~1000个群体，则表明这些细胞的接种效率为100%。必须严防干燥，为此可将琼脂平板保存在密封的塑料袋中，于39°C下培养。第一次观察可在培养15d以后，第二次观察在总共培养了 25d后，空泡的存在将严重影响颜色，因为它能将入射光反射回来。在相差显微镜下观察，带有空泡的单个细胞由于有很强的反射，对比细胞的暗背景显得很亮。
[0049]突变菌株用在RM-琼脂平板上反复划线的办法来纯化。突变菌株的表现型应加以记录，并在重新划线后再观察检查。
[0050]色素突变菌株的分离对于选育BR高产菌株是非常重要的。在连续做液体培养的进程中，由于菌种变异等多种原因，BR产率将逐渐减少，因此至少每隔一年需要进行一次高产菌株的分离筛选工作。此外，菌株分离工作还应用于选育除含BR外的其它色素系统的菌体。
【权利要求】
1.将300克湖盐、3克1(20，30克黄豆粉，100克极端嗜盐菌(用常规方法从含30%的盐湖水中分离出来的极端嗜盐菌浓度0.2亿/克以上)，放入600克无菌水中溶器中搅匀。
2.将1000克精选粉碎过100目过筛的风化煤粉放入配好的1033克物料的溶器中搅匀。
3.将2033克配好的物料放入培养箱中，加温25°-35° °C，湿度75° -85° °C，用日光灯波长550-600nm，照射(时间和培养时间相同)。
4.培养箱自然供氧培养七天后，用低氧压或厌氧环境培养14天，待极端嗜盐菌发紫红色时培养即可结束(经检测极端嗜盐菌在430亿/克以上)，获得的极端嗜盐菌因为含量极高，可以用来提取紫膜，可以降低紫膜培养料成本。
5.风化煤、褐煤含腐植酸40%以上，泥碳含腐植酸21%以上为宜。
【文档编号】C12R1/01GK104017743SQ201310063225
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2013年2月28日 优先权日:2013年2月28日
【发明者】魏明重 申请人:魏明重