专利名称：一种谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法
技术领域：
本发明涉及一种高新生物技术，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法。
背景技术：
在细菌和植物中，由公共途径莽草酸途径以及三个专一性途径分别合成色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸三种芳香族氨基酸，公共途径第一步反应，被认为是芳香族氨基酸合成的限速步骤，由DAHP合成酶催化。目前，对谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)DAHPSCgTyr的立体结构还未见报道，但大肠杆菌Escherichia col1、海栖热袍菌Thermotoga maritima、啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae的(β /a )8立体桶状结构均以报道，这些来源不同的DAHPS高度同源，功能相同，只是受不同底物的反馈抑制，但底物抑制的结合位点基本相同，表明它们可能是由同一个桶状结构的祖先进化而来，或者是由不定的结构收敛进化到同一种稳定的三维结构的结果，或者是二者兼有的结果。1991年的大肠杆菌中进化高度保守的苯丙氨酸反馈抑制的DAHPS的(DAHPSEcPhe)金属离子结合位点Cys61、Glu302、Asp326、Lys97中的Cys61进行突变研究，结果该氨基酸的突变导致酶活性丧失，推测谷氨酸棒杆菌酪氨酸反馈抑制的DAHPSCgTyr活性同样对金属离子也有依赖性，保守N末端Cys69的突变，可能也会导致酶活性丧失。1999,2002年，研究人员根据AroG-PEP-(Pb2+、Mn2+)共结晶的晶体结构指出了 Glu24、Lys25、Argl24、His217对DAHPSEcPhe的四连体结构起到重要的作用，从DAHPSCgTyr氨基酸序列分析发现这几个氨基酸进化过程中并不保守，预示DAHPSCgTyr不是四连体结构，可能是以紧密的二聚体结构存在。研究人员确定了 DAHPSEcPhe的活性中心位于(β/α)8桶的C末端，由于PEP和Ε4Ρ都是带有负电的反应底物，所以在活性中心附近带正电荷的氨基酸比负电荷的多，在距离Pb2+8A范围内多为Arg和Lys，而DAHPSCgTyr中这些带电的氨基酸都是高度保守的，说明D AHPSCgTyr的活性中心位置与DAHPSEcPhe基本相同，但对这些带正电的Arg和Lys的突变研究鲜见报道。研究人员还认为DAHPSEcPhe反馈抑制子苯丙氨酸的苯环结合在氨基酸Phel44、Prol50、Leul75和Leul79的侧链形成疏水“pocket”的底部，苯丙氨酸结合这些氨基酸以后，引起一些氨基酸残基间的新接触的形成以及原有接触的破坏，引起酶催化活性的降低，而在DAHPSCgTyr氨基酸序列中没有保守的Leul79 (E.Coli)，而对应为Met，其余几个氨基酸均保守，固推测是该位氨基酸在进化过程中的改变，导致反馈抑制子的不同。我国研究人员确定大肠杆菌DAHPSEcPhe Leul75的所有突变体的比活都比野生型高，并部分或完全解除反馈抑制。本研究对与大肠杆菌AroG基因Leul75相对应的谷氨酸棒杆菌aro I基因Leul83进行突变，所得突变体L183Q比活同样比野生型高，分析原因可能是该氨基酸残基的突变使得反馈抑制子酪氨酸不易结合，或是底物PEP更容易结合到活性位点，或是另一个底物E4P更容易与已结合在活性位点的PEP发生反应，但具体原因还有待于深入研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供了一种谷氨酸棒杆菌AroI基因及突变基因AroI*的原核表达方法。为解决上述技术问题，本发明通过以下方案来实现:谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法，所述方法所使用的材料为菌株大肠杆菌BL21及pET-28a(+)原核表达载体，由以下步骤实现:I)、DAHP合成酶基因及突变基因的原核表达载体构建；2)、目的基因与表达载体pET_28a(+)的酶切，限制性内切酶Nde I和XhoI双酶切重组质粒pMD18T-simple_Aro ]^PpMD18T-simple-Aro I*,回收目的基因片段，分别按照下表中体系进行加样，对目的基因和pET-28a(+)载体于37°C恒温4h进行双酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳结果，回收目的基因和载体的目的片段；
权利要求
1.谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法，其特征在于:所述方法所使用的材料为菌株大肠杆菌BL21及pET-28a(+)原核表达载体，由以下步骤实现: 1)、DAHP合成酶基因及突变基因的原核表达载体构建； 2)、目的基因与表达载体pET-28a(+)的酶切，限制性内切酶NdeI和Xho I双酶切重组质粒pMD18T-simple_Aro I和pMD18T_simpIe-Aro I*,回收目的基因片段,分别按照下表中体系进行加样，对目的基因和pET-28a(+)载体于37°C恒温4h进行双酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳结果，回收目的基因和载体的目的片段；
全文摘要
本发明公开了一种高新生物技术，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法，pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具选择性充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上。尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。
文档编号C12N15/70GK103215287SQ20131007459
公开日2013年7月24日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者佟毅, 刘俊梅, 王宏龄, 胡耀辉, 李琢伟, 王丹, 王玉华, 朴春红, 代伟长, 于寒松 申请人:吉林中粮生化科技有限公司