清除淀粉样多肽的细胞及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及清除淀粉样多肽的细胞及其应用，首次揭示了NG2细胞可以被Aβ激活并吞噬Aβ。NG2细胞可作为一个药学靶点来研究和筛选激活或促进NG2吞噬Aβ的药物，本发明为脑中Aβ过量导致的神经退行性疾病的治疗提供了有效途径。
【专利说明】清除淀粉样多肽的细胞及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞生物学和药学领域；更具体地，本发明涉及清除淀粉样多肽的细胞及其应用。
【背景技术】
[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是老年痴呆症的最常见的形式。在神经病理学上有三大特征:沉积在细胞外的淀粉样蛋白斑；细胞内的神经纤维缠结和特定脑区的神经元死亡。β淀粉样多肽(Αβ)是淀粉样蛋白斑的主要成分，其是由淀粉样前体蛋白(APP)经由不同的内切蛋白酶催化剪切而形成的自然代谢产物。有三种蛋白酶参与了APP的剪切过程，按其剪切位点的发现顺序，分别称为α-分泌酶，β-分泌酶和Y-分泌酶。APP的剪切过程可分为淀粉样途径和非淀粉样途径。淀粉样途径主要是β_分泌酶先把APP剪切成两个片段:游离形式的N-端蛋白片段(sAPPii)和留在膜上的含β淀粉样多肽的C-端(C99)。Y -分泌酶复合体进一步剪切C-端，产生A β和APP胞内结构域片段(APP intracellular domain, A1))。大部分的全长Αβ由40个氨基酸组成(Αβ40),仅有约10%由42个氨基酸组成(Αβ42)。Αβ42由于多了两个疏水的氨基酸残基而更易于聚集，同时也是淀粉样蛋白斑的主要成分。Αβ自身可自发地聚集从而形成多种共存形式。可由2-6个多肽形成寡聚体，并进一步融合形成中间聚集体；也可以形成纤维，并排列为β-折叠片，进一步形成不可溶纤维，最终导致淀粉样蛋白斑的形成。可溶性寡聚体和淀粉样中间聚集体是Aβ毒性最高的两种形式。
[0003]随着对AD研究的深入，越来越多的研究者认为，很多AD患者可能由于大脑清除Αβ的功能出现障碍，致使生命过程中正常生成的Αβ无法被及时清除，从而导致了 AD。遗传有载脂蛋白E4(apolipoprotein E4,ApoE4) 一个或两个等位基因的个体更容易患上AD,通过对其病因的研究，发现携带ApoE4等位基因的个体A β的生成量并没有增加，在细胞水平共表达APP和ApoE也没有改变细胞A β的生成量。人的神经病理性损伤分析和动物模型研究表明，ApoE使大脑中的A β总体水平稳定升高，可能增加了 A β的纤维形成能力和/或是降低了 Αβ的清除。尽管其具体机制还尚未研究清楚，ApoE介导的大脑中Αβ水平的增高至少提示了细胞在Aβ的清除方面存在功能障碍。
[0004] 真核细胞中有两条主要的胞内蛋白降解途径:泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin/proteasome pathway,UPP)和自曬-溶酶体途径(autophagy/lysosome pathway,ALP)。据报道，很多神经退行性疾病的病理都与泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径的功能障碍有关。有研究表明，Αβ既能被蛋白酶体降解，又能抑制其活性。如果蛋白酶体活性受到抑制，将被降解的已泛素化蛋白就会积累起来，这将引起神经元退行和死亡。而AD最主要的特征就是沉积在细胞外的淀粉样蛋白斑和细胞内的神经纤维缠结，这有可能是由于泛素蛋白酶体的功能异常，导致Αβ不能被及时清除，从而形成淀粉样蛋白斑，并对周围神经细胞产生毒性作用，引起一系列的病理损伤。当泛素蛋白酶体介导的蛋白质降解过程受到损伤或呈减弱趋势，这将促使自噬-溶酶体降解途径担负起更多的蛋白降解功能。
[0005]综上，本领域有必要研究有效清除细胞内A β的有效产品和途径，以期应用于AD疾病的治疗。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供清除淀粉样多肽的细胞及其应用。
[0007]在本发明的第一方面，提供一种筛选潜在的防治神经退行性疾病的药物的方法，所述方法包括:
[0008](I)用β淀粉样多肽(Α β )处理NG2细胞(包括NG2细胞系)，并确定细胞吞噬β淀粉样多肽的程度(包括吞噬效率)；
[0009](2)在候选物质存在下，如(I)所述处理NG2细胞，再次确定细胞吞噬β淀粉样多肽的程度；和
[0010](3)比较⑴和⑵中细胞吞噬β淀粉样多肽的差异；
[0011]其中，如果(2)中细胞吞噬β淀粉样多肽的程度在统计学上高于(优选显著高于，如高20%，较佳地高40% ;更佳地高60%或更高)(I)中细胞吞噬β淀粉样多肽的程度，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
[0012]在一个优选例中，所述的方法的(I)和(2)中，还包括:确定NG2细胞中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量；并且，(3)中，还包括:比较(I)和(2)中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量；其中，如果(2)中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量在统计学上高于(优选显著高于，如高20%，较佳地高40%;更佳地高60%或更高)(I)中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
[0013]在另一优选例中，所述方法的(I)和(2)中，还包括:确定细胞中β淀粉样多肽被降解的效率；并且，⑶中，还包括:比较⑴和⑵中β淀粉样多肽被降解(或被清除)的效率；其中，如果(2)中β淀粉样多肽被降解的效率在统计学上高于(优选显著高于，如高20%，较佳地高40%;更佳地高60%或更高)(I)中β淀粉样多肽被降解的效率，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
[0014]在另一优选例中，所述方法的(I)和(2)中，还包括:确定细胞中自噬体数量；并且，(3)中，还包括:比较(I)和(2)中的自噬体数量；其中，如果(2)中自噬体数量在统计学上高于(优选显著高于，如高20%，较佳地高40% ;更佳地高60%或更高)(I)中自噬体数量，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
[0015]在另一优选例中，所述方法的(I)和⑵中，还包括:确定细胞中lampl、lamp2、LC3-11、P62或beclinl基因或它们编码的蛋白的表达情况；并且，⑶中，还包括:比较(I)和(2)中的lampl、lamp2、LC3-11、P62或beclinl基因或它们编码的蛋白的表达情况；其中，如果(2)中lampl、lamp2、LC3-11、P62或beclinl基因或它们编码的蛋白的表达在统计学上高于(优选显著高于，如高20%，较佳地高40% ;更佳地高60%或更高)(I)中相应基因或蛋白的表达，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
[0016]在另一优选例中，所述的β淀粉样多肽、溶酶体或自噬体标记有可检测信号，如突光信号。
[0017]在另一优选例中，通过鉴定β淀粉样多肽上可检测信号的定位来确定β淀粉样多肽的定位，进而确定β淀粉样多肽的吞噬程度或降解情况。
[0018]在另一优选例中，所述方法的(I)或⑵中，所述的如2细胞以501^~5(^11(较佳地为10nM~20 μ M ;更佳地为200ηΜ~10 μ Μ) β淀粉样多肽处理。
[0019]在另一优选例中，所述的方法还包括:对获得的潜在药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，选择和确定对于防治神经退行性疾病有用的药物。
[0020]在另一优选例中，所述的神经退行性疾病是脑中β淀粉样多肽过量导致的神经退行性疾病，包括阿尔兹海默症。
[0021]在本发明的另一方面，提供一种NG2细胞的用途，用于筛选潜在的防治神经退行性疾病的药物；或用于制备防治神经退行性疾病的药物。
[0022]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1、NG2细胞聚集在淀粉样蛋白斑周围。A:14月龄APPswe/PSl转基因鼠(上)和对照组(下)大脑皮质的NG2免疫组织化学染色和斑块硫黄素-S染色。NG2阳性细胞在对照组的大脑皮质中呈均匀分布，在APPswe/PSI转基因鼠中则聚集在淀粉样蛋白斑周围。标尺=50 μ m。B:A图方框区域的局部放大。标尺=20 μ m。
[0024]图2、APPswe/P Sl转基因鼠大脑皮质免疫组织化学染色。硫黄素-S染色显示淀粉样蛋白斑，Ibal显示小胶质细胞,GFAP显示星形胶质细胞,NeuN显示神经元。标尺=20 μ m。
[0025]图3、NG2细胞是一种新的聚集在淀粉样蛋白斑周围的细胞类型。APPswe/PS I转基因鼠大脑皮质免疫组织化学双标。将大脑皮质进行NG2和GFAP，NeuN, Ibal双标。DAPI用于细胞核定位染色。标尺=20 μ m。
[0026]图4、原代NG2细胞和ol1-neu细胞能吞噬Αβ。原代NG2细胞(A)和Ol1-neu细胞(B)接种于24孔板的玻片上，培养18小时后用2μ M的荧光标记的A β孵育24小时。细胞固定后进行NG2抗体的细胞免疫荧光染色。DAPI染色用于细胞核定位。标尺=5μηι。
[0027]图5、透射免疫电镜显示NG2细胞中的Aβ。01i_neu细胞用Αβ处理6小时后用于免疫电镜实验。超薄切片用抗Αβ的一抗和结合18nm胶体金颗粒二抗标记。图中所嵌高倍图像为方框区域所示。标尺=0.2 μ m。
[0028]图6、Αβ吞噬过程具有时间依赖性。A:细胞免疫荧光检测A β吞噬过程。Ol1-neu细胞用400nM荧光标记的Αβ处理不同时间点，固定后用NG2抗体进行细胞免疫荧光染色。标尺=5 μ m。B-C:流式细胞术检测NG2阳性细胞吞噬A β的过程。Ol1-neu细胞⑶和原代NG2细胞(C)用400nM荧光标记的Αβ处理不同时间点。细胞所吞噬的Αβ含量通过流式细胞仪检测胞内荧光强度来定量。
[0029]图7、肌动蛋白参与ol1-neu细胞对Αβ的吞噬过程。Ol1-neu细胞用细胞松弛素D (A, cytochalasin D,肌动蛋白聚集形式抑制剂)和噻氨酯咕唑(B, nocodazole,破坏微管蛋白动态变化)预处理30分钟，然后再用400nM荧光标记Αβ处理不同时间点。细胞所吞噬的Αβ含量通过流式细胞仪检测胞内荧光强度来定量。
[0030]图8、吞噬到NG2细胞中的A β被迅速降解。免疫印迹实验检测NG2细胞胞内和细胞培养基中的Αβ含量。所有数据用平均值土标准偏差显示；与Aβ处理O小时相比较P<0.01,为#。实验为三次重复。
[0031]图9、吞噬到NG2细胞中的Αβ被转运到溶酶体。NG2细胞用400ηΜ荧光标记Αβ处理24小时，然后在细胞培养基中直接加入40ηΜ溶酶体示踪剂，再孵育30分钟。DAPI染色用于细胞核定位。标尺=10 μ m。
[0032]图10、Αβ吞噬引起NG2细胞中LAMPl和LAMP2基因表达的改变。NG2细胞用Αβ处理不同时间点后收集RNA，用于实时定量PCR检测。所有数据用平均值土标准偏差显示；与Αβ处理O小时相比较P < 0.01,为#。实验为三次重复。
[0033]图11、溶酶体抑制剂可以抑制NG2细胞中Αβ的降解。NG2细胞用Αβ孵育6小时后，加亮肽素(Leup印tin, 20 μ Μ)和胃酶抑素A (P印statin A, 20 μ Μ)处理18小时。所有数据用平均值土标准偏差显示；与只用Αβ处理组相比较P < 0.05，为*，P < 0.01，为林。实验为三次重复。
[0034]图12、Αβ吞噬增加NG2细胞中自噬相关蛋白的表达。所有数据用平均值土标准偏差显示；与Αβ处理O小时相比较P < 0.05,为P < 0.01,为#。实验为三次重复。
[0035]图13、Α β与LC3-1I阳性的自噬体共定位。NG2细胞与400ηΜ荧光标记的A β孵育24小时，再用LC3-1I抗体进行细胞免疫荧光标记。DAPI染色用于细胞核定位。标尺=5 μ m0
[0036]图14、Α β孵育增加NG2细胞中自噬体形成。NG2细胞瞬时转染mCherry - LC3质粒后再与A β孵育，通过计量mChenT-LC3荧光斑点阳性细胞数量来定量自噬体形成水平。所有数据用平均值土标准偏差显示；与不用A β处理组相比较P <0.01，为实验为三次重复。
[0037]图15、自噬抑制剂能抑制NG2细胞中A β降解。NG2细胞与A β孵育6小时后，加浓度梯度的渥曼青霉素(wortmannin,左)和巴佛洛霉素Al (bafilomycinAl,0.2nM,右)再孵育18小时。免疫印迹实验检测Αβ，LC3，P62和beclinl蛋白水平。所有数据用平均值土标准偏差显示；与只用Αβ处理组相比较P < 0.05，为*，P < 0.01，为#。实验为三次重复。
[0038]图16、蛋白酶体活性抑制剂能抑制NG2细胞中Αβ降解。NG2细胞与Αβ孵育6小时后，加MG132(lnM)再孵育18小时。免疫印迹实验检测Aβ，LC3，P62和beclinl蛋白水平。所有数据用平均值土标准偏差显示；与只用Αβ处理组相比较P <0.05，为*，P<0.01,为#。实验为三次重复。
【具体实施方式】
[0039]本发明人在研究中发现，阿尔兹海默症发病过程中，淀粉样蛋白斑周围的NG2细胞被激活，激活后的NG2细胞吞噬并降解淀粉样多肽(又称为淀粉样蛋白，Αβ )，其降解过程涉及到自噬溶酶体途径和蛋白酶体途径。因此，NG2细胞可作为一个药学靶点，用于研究和筛选可以激活或促进NG2吞噬A β的药物；且NG2细胞本身可作为一种治疗药物。本发明为脑中Aβ过量导致的神经退行性疾病的治疗提供了有效途径。
[0040]NG2 细胞
[0041]NG2细胞也称为少突胶质细胞前体细胞，其区别于中枢神经系统里的星形胶质细胞、小胶质细胞、成熟的少突胶质细胞和神经元。在中枢神经系统的发育过程中，NG2前体细胞的分布区域与全能干细胞所在的以及具持续性神经发生的区域相重叠。与神经干细胞类似，NG2细胞在成熟的大脑中持续存在并缓慢增殖，是出生后仍具增殖分裂能力的最大一群前体细胞，分布于大脑的神经发生和非神经发生区域。在体外和体内实验中，NG2细胞具有分化成多种细胞的潜能，可分化产生少突胶质细胞和星形胶质细胞，以及神经元。
[0042]迄今的研究表明，NG2细胞在一系列的中枢神经系统损伤中会很快被激活，并伴随着细胞形态的改变。这些损伤包括物理创伤，兴奋性病变，病毒感染，暴露于化学试剂，X线照射和免疫引发的脱髓鞘等。但是，目前还没有研究来探讨NG2细胞在AD中的活性变化。
[0043]本发明中，通过多种实验手段研究在阿尔兹海默症的致病过程中NG2细胞的状态及其功能，以及其中的作用机制。结果表明，阿尔兹海默症转基因动物大脑皮层中，在淀粉样蛋白斑周围的NG2细胞被激活，并且被激活的NG2细胞是不同于神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的一类新的细胞类型。在体外实验中，利用原代NG2细胞和NG2细胞系(Ol1-neu)，发现这两种细胞都能将外源的A β吞噬进入胞内，并且该吞噬过程具有时间依赖性。与小胶质细胞吞噬外源Αβ的机制不同，NG2细胞的吞噬是依赖于肌动蛋白的动态变化，当肌动蛋白聚合被抑制，外源Αβ则不能被吞噬进入胞内。当外源Αβ被吞噬进入胞内，通过免疫荧光实验，发现A β能与溶酶体示踪剂共定位，说明A β被转运到溶酶体中。溶酶体主要负责细胞内蛋白的降解，本发明人利用蛋白免疫印迹实验，检测到被转运到溶酶体中的Αβ被逐渐的降解。进一步的研究还提示，自噬体也参与了 Αβ的降解。当外源Αβ被吞噬进入胞内，Αβ可以与自噬体共定位，与自噬相关的蛋白表达上调，自噬体数量增加，自噬过程被激活。当用自噬过程的抑制剂处理细胞，胞内的Αβ降解被抑制。通过RNA干扰，降低自噬过程中关键蛋白beclinl的表达，细胞内Αβ的降解也被抑制。说明自噬过程在Αβ的降解中发挥着重要作用。通过以上的研究，揭示了在阿尔兹海默症的发病过程中，淀粉样蛋白斑周围的NG2细胞被激活，激活后的NG2细胞吞噬并降解Αβ，其降解过程涉及到自噬溶酶体途径和蛋白酶体途径，这为进一步深入理解NG2细胞在大脑中的存在意义及其对疾病的治疗提供了广阔的思路。
[0044]本发明还提供了 NG2细胞的用途，包括(但不限于)用于:研究Αβ的产生及降解机制；研究神经退行性疾病(特别是阿尔茨海默病)的机制；筛选潜在的防治神经退行性疾病(特别是阿尔茨海默病)的药物等。
[0045]筛选防治神经退行性疾病的药物的方法
[0046]在得知了 NG2细胞能够被Αβ激活并且吞噬Αβ这一机制，可以基于该机制筛选促进NG2细胞吞噬Αβ的潜在物质。从而，可从所述的潜在物质中找到对于预防或治疗神经退行性疾病有用的物质。
[0047]因此，本发明提供一种筛选潜在的防治神经退行性疾病药物的方法，所述的方法包括:(I)用A β处理NG2细胞(包括NG2细胞系)，并确定细胞吞噬A β的程度(包括吞噬效率)；(2)在候选物质存在下，如(I)所述处理NG2细胞，再次确定细胞吞噬A β的程度；和⑶比较⑴和⑵中细胞吞噬A β的差异；其中，如果⑵中细胞吞噬A β的程度在统计学上高于(I)中细胞吞噬A β的程度，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
[0048] 进一步地，还可以通过⑴比较⑴和⑵中Αβ被转运到溶酶体中的量；(ii)比较⑴和⑵中Αβ被降解(或被清除)的效率；(iii)比较⑴和(2)中的自噬体数量；(iv)比较(I)和(2)中的lampl、lamp2、LC3-11、P62或beclinl基因或它们编码的蛋白的表达情况；来确定候选物质的有效性。
[0049]所述的候选物质可以来源自现有的一些蛋白库或化合物库中。例如选自:肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列。通常本领域人员清楚如何获得这种用于筛选的库。有目的地选择细胞活性促进剂、细胞膜通透化试剂、对于促进细胞内吞或吞噬作用有用的试剂等，将提高筛选的效率。
[0050]确定存在或不存在候选物质的情况下Αβ的吞噬程度的差异可以采用任何本领域已知的方法。具体例如可通过荧光标记或染色的方法来进行定位或定量，此外免疫荧光标记结合流式细胞仪是有效定量Aβ定位的方法。也可以将细胞种在多孔板中，作相关候选物质处理后用荧光标记定位，然后用酶标仪读数，比较候选物质存在与不存在情况下的差异，来确定此候选物质是否可作为潜在的防治神经退行性疾病的药物。
[0051]如果在加入与不加入候选物质的情况下Αβ被吞噬或降解的差异是显著的或者超过了某个阈值，则候选试剂可能对于防治神经退行性疾病是有效的。如果差异不显著，则可以用另一候选物质重复所述步骤进行筛选。通常，本领域技术人员可同时试验多种候选物质，例如通过使用多孔板或其它高通量方法。
[0052]作为一种优选的方式，所述的方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，选择和确定对于防治神经退行性疾病有用的物质。
[0053]这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于预防或治疗神经退行性疾病确定有用的物质。
[0054]基于本发明人的新发现，本发明还提供了一促进NG2细胞吞噬Αβ的物质，所述的物质可用于制备对于防治神经退行性疾病有用的药物。任何可促进NG2细胞吞噬Αβ的物质均可用于本发明，作为潜在的防治神经退行性疾病药物。
[0055]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0056]1.材料和方法
[0057]1.免疫组化荧光双标
[0058](I)脑组织切片(脑片)在0.1M磷酸缓冲液配制的0.3%Triton X-100中室温处理10分钟。
[0059](2)在抗体封闭液(1%牛血清白蛋白，0.3%Triton X-100于0.1M磷酸缓冲液)中室温封闭I小时。
[0060](3)脑片转入一抗中，4°C孵育过夜。第二天用PBS洗3次，每次20分钟。
[0061](4)脑片转入二抗中，室温避光孵育2小时。PBS洗3次，每次20分钟。
[0062](5)标记完第一个抗体的脑片接着进行第二个抗体的标记，进行荧光双标。第二个抗体的标记过程与第一个抗体的标记过程完全相同。
[0063](6)两个抗体都标记完成后，进行细胞核的DAPI染色。脑片于I μ g/mlDAPI溶液中孵育5分钟，然后用PBS洗3次，每次10分钟。
[0064](7)染完色的脑片进行贴片，水分晾干后用抗淬灭封片剂封片。
[0065](8)片子在双光子共聚焦激光显微镜下观察，拍照得到实验结果图片。
[0066]一抗用抗体封闭液按以下稀释倍数配制:NG2 (兔，1:500)，6E10 (小鼠，1:500)，IbaI (兔 1:2000 ;山羊 1:200)，GFAP (小鼠 1:1000)，NeuN(兔，1:1000)。
[0067]二抗用抗体封闭液按以下稀释倍数配制:Alexa Fluor488或HiLyte Fluor555标记的羊抗鼠，羊抗兔，驴抗羊的二抗均为1:1000。
[0068]部分荧光双标染色为先进行Ibal，GFAP, NeuN和NG2免疫荧光染色然后再与硫磺素S染色结合,进行荧光双标。
[0069]
【权利要求】
1.一种筛选潜在的防治神经退行性疾病的药物的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)用β淀粉样多肽处理NG2细胞，并确定细胞吞噬β淀粉样多肽的程度； (2)在候选物质存在下，如(I)所述处理NG2细胞，再次确定细胞吞噬β淀粉样多肽的程度；和 (3)比较⑴和(2)中细胞吞噬β淀粉样多肽的差异； 其中，如果(2)中细胞吞噬β淀粉样多肽的程度在统计学上高于(I)中细胞吞噬β淀粉样多肽的程度，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(I)和(2)中，还包括:确定NG2细胞中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量；并且， (3)中，还包括:比较⑴和⑵中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量；其中，如果(2)中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量在统计学上高于(I)中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(I)和(2)中，还包括:确定细胞中β淀粉样多肽被降解的效率；并且， (3)中，还包括:比较⑴和⑵中β淀粉样多肽被降解的效率； 其中，如果(2)中β淀粉样多肽被降解的效率在统计学上高于(I)中β淀粉样多肽被降解的效率，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(I)和(2)中，还包括:确定细胞中自噬体数量；并且， (3)中，还包括:比较⑴和⑵中的自噬体数量； 其中，如果(2)中自噬体数量在统计学上高于(I)中自噬体数量，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(I)和(2)中，还包括:确定细胞中lampl、lamp2、LC3-11、P62或beclinl基因或它们编码的蛋白的表达情况；并且， (3)中，还包括:比较(I)和(2)中的lampl、lamp2、LC3-11、P62或beclinl基因或它们编码的蛋白的表达情况； 其中，如果⑵中lampl、lamp2、LC3-11、P62或beclinl基因或它们编码的蛋白的表达在统计学上高于(I)中相应基因或蛋白的表达，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
6.如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的β淀粉样多肽、溶酶体或自噬体标记有可检测信号，如荧光信号。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，通过鉴定β淀粉样多肽上可检测信号的定位来确定β淀粉样多肽的定位，进而确定β淀粉样多肽的吞噬程度或降解情况。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(I)或⑵中，所述的NG2细胞以50ηΜ~50μΜβ淀粉样多肽处理。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的神经退行性疾病是脑中β淀粉样多肽过量导致的神经退行性疾病，包括阿尔兹海默症。
10.一种NG2细胞的用途，其特征在于，用于筛选潜在的防治神经退行性疾病的药物；或用于制备防治神经退行性疾病的药物。
【文档编号】C12Q1/02GK104046676SQ201310079159
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2013年3月13日
【发明者】柯尊记, 骆嘉, 李文霞, 唐义芬, 范志勤 申请人:中国科学院上海生命科学研究院