专利名称：链霉菌产生纳他霉素与几丁质酶的协同发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种链霉菌产生纳他霉素与几丁质酶的协同发酵方法。
背景技术：
目前，工业生产上对于链霉菌的发酵多采用的是优化单一拮抗物质纳他霉素的发酵方法。例如I960年，Cynamadi报道了用传统的发酵法生产纳他霉素的方法。此后人们对于发酵纳他霉素的研究很少，生产纳他霉素直到近些年来才被人们重新拾起。1993年，M.A.艾森申克报道了生产纳他霉素的方法。2002年，何艳玲等人对纳他霉素产量的工艺进行了研究，在IOL自动发酵罐发酵条件下，最终使纳他霉素的产量提高到疒3g/L。2010年，李卫宁等，研究了褐黄孢链霉菌菌株WZ-18产纳他霉素的培养条件及发酵培养基成分，优化后，纳他霉素产量达到3.51 g/L。但是，上述方法都是单一优化链霉菌所产生的一种抗生素，通过抗生作用抑制病原菌而达到生物防治目的，但是没有研究另一个重要拮抗因子几丁质酶的产生及作用。几丁质酶在生物防治中具有如下重要作用:(I)水解病原菌细胞壁；(2)提高植物的防御能力；(3)与其他防御反应酶的协同增效作 用。因此很有必要研究纳他霉素与几丁质酶协同表达方法。
发明内容
本发明针对现有发酵技术只优化一种拮抗物质的不足，提供一种能够有效诱导链霉菌协同产生纳他霉素与几丁质酶的协同发酵方法，实现了在一种培养基中同时诱导两种拮抗物质协同高效表达，使得发酵液抑菌活性大大增加。本发明通过不同时间添加不同诱导物解决了纳他霉素产生的阻遏问题。本发明方法以链霉菌为研究对象，诱导其产生两种拮抗物质几丁质酶与纳他霉素，实现了诱导抗性、降解病原菌细胞壁与抗生作用三种生防机制，可以防治多种作物病害，为新型复合生物农药的建立奠定了基础。本发明的技术方案如下:
一种链霉菌产生纳他霉素与几丁质酶的协同发酵方法，为:在一种培养基中不同时间分别添加纳他霉素诱导物与几丁质酶诱导物对链霉菌进行发酵培养，在诱导初始阶段添加纳他霉素诱导物，在所述纳他霉素诱导物消耗殆尽时，添加几丁质酶诱导物。一种链霉菌产生纳他霉素与几丁质酶的协同发酵方法，包括以下步骤:
O将链霉菌在如下发酵培养基中进行发酵:纳他霉素诱导物40.38g/L，黄豆粉28.llg/L,大豆蛋白胨 14.91g/L，CaCO3 5g/L，MgSO4.7H20 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L ;发酵条件为:初始pH 6.0,3%的接种量，装液量50/250mL，温度28°C，转速180r/min ；
2)在发酵第4天，纳他霉素诱导物消耗殆尽时添加几丁质酶诱导物llg/L；
3)发酵8天后得到发酵液。优选地，所述纳他霉素诱导物为葡萄糖。优选地，所述几丁质酶诱导物为几丁质粉。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下:
第一.本发明克服了传统发酵过程中都是以提高单一抗生素产量为发酵目的，提出了一种诱导纳他霉素与几丁质酶协同发酵的方法，具体通过在发酵初期添加纳他霉素诱导物，发酵一段时间后待纳他霉素诱导物消耗殆尽时，添加几丁质酶诱导物，解决了纳他霉素诱导物对于几丁质酶产生过程的阻遏作用，大大促进了菌株产生几丁质酶的能力；
第二.本发明方法以链霉菌为研究对象，诱导其产生两种拮抗物质几丁质酶与纳他霉素，实现了诱导抗性、降解病原菌细胞壁与抗生作用三种生防机制，可以防治多种作物病害，为新型复合生物农药的建立奠定了基础；
第三.本发明的协同发酵思想还可用于其它生防菌发酵，能实现同一生防菌在同一种培养基中高效表达不同的拮抗物质，通过不同的作用机制来达到协同防治病虫害的目的。当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施例方式下方结合具体实施例对本发明做进一步的描述。
实施例本实施例采用的链霉菌为拮抗木霉菌株，利迪链霉菌A01-cAii33CT(,Streptomyces),来自上海交通大学农业与生物学院农业部都市农业(南方)重点
实验室。本实施例的链霉菌采用如下方法发酵培养: O首先，将链霉菌在如下发酵培养基中进行发酵:葡萄糖40.38g/L，黄豆粉28.Hg/L，大豆蛋白胨 14.91 g/L, CaCO3 5g/L，MgSO4.7H20 0.5g/L, K2HPO4 0.5g/L ;发酵条件为:初始pH 6.0,3%的接种量，装液量50/250mL，温度28。。，转速180r/min ；
2)在发酵第4天，葡萄糖消耗殆尽时添加几丁质粉llg/L；
3)发酵8天后得到发酵液。该发酵液中纳他霉素和几丁质酶产量分别达到2.32g/L和1049U/mL。由上述方法制备的发酵液为产纳他霉素和几丁质酶培养基发酵液(标记为I)与同样条件下制备的不添加几丁质粉的单独产纳他霉素培养基发酵液(标记为2)和单独产几丁质酶培养基发酵液(标记为3)分别进行如下的田间防治植物病害的实验，比较防治效果:
在番茄生长20d左右，先分别喷洒上述三种发酵液，空白对照组(标记为CK)喷洒清水，发酵液或清水的喷洒程度以叶面滴水为宜，待叶面干后，再对上述四组样品用同样的方法喷施番茄灰霉病病原菌的孢子悬浮液，接种后放于22°C温室，用塑料薄膜遮盖保湿2d，并以加湿器加湿。待空白对照组发病后调查发病情况，根据下列公式计算发病率、病情指数和防治效果，并对数据做方差分析。发病率(％)=发病叶数/调查总叶数X 100
病情指数(％)=[(病级叶数X代表数值)]/ (调查的总叶数X发病最重级的代表数值)XlOO
防治效果(％)=(对照病情指数一发酵液处理病情指数)/对照病情指数X100 灰霉病的调查以叶片为单位，全部调查。参照农业部农药鉴定所生测室制定的《农药田间药效试验准则(一)》(1997)确定病害分级标准:0级一无病斑；1级一单叶片有病斑3个；3级一单叶片有病斑4 6个；5级一单叶片有病斑7 10个；7级一单叶片有病斑11 20个，部分密集成片；9级一单叶片病斑密集占叶面积1/4以上。病情调查结果及链霉菌发酵液对番茄灰霉病的温室防治效果如表I所示。该结果表明，链霉菌的培养基发酵液(标号为1、2、3 )对番爺灰霉病具有很好的抑制作用，处理后的植物发病率和病情指数明显低于对照(标号为CK)。其中，产纳他霉素和几丁质酶培养基发酵液(标号为I)对番茄灰霉病的抑制作用相对更明显，防治效果达78.9% ;单独的产纳他霉素培养基发酵液对番茄灰霉病的抑制作用次之，防治效果在70.3%左右，单独的产几丁质酶培养基发酵液对番茄灰霉病的抑制作用较弱，防治效果只有50%左右。表I链霉菌A01_chit33CT发酵液对番茄灰霉病的温室防治效果
权利要求
1.一种链霉菌产生纳他霉素与几丁质酶的协同发酵方法，其特征在于，在一种培养基中不同时间分别添加纳他霉素诱导物与几丁质酶诱导物对链霉菌进行发酵培养，在诱导初始阶段添加纳他霉素诱导物，在所述纳他霉素诱导物消耗殆尽时，添加几丁质酶诱导物。
2.一种链霉菌产生纳他霉素与几丁质酶的协同发酵方法，其特征在于，包括以下步骤: (O将链霉菌在如下发酵培养基中进行发酵:纳他霉素诱导物40.38g/L，黄豆粉28.llg/L，大豆蛋白胨 14.91g/L，CaCO3 5g/L, MgSO4.7H20 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L ;发酵条件为:初始pH 6.0,3%的接种量，装液量50/250mL，温度28。。，转速180r/min ； (2)在发酵第4天，纳他霉素诱导物消耗殆尽时添加几丁质酶诱导物llg/L； (3)发酵8天后得到发酵液。
3.如权利要求2所述的链霉菌产生纳他霉素与几丁质酶的协同发酵方法，其特征在于，所述纳他霉素诱导物为葡萄糖。
4.如权利要求2所述的链霉菌产生纳他霉素与几丁质酶的协同发酵方法，其特征在于，所述几丁质酶诱导物为几丁质粉。
全文摘要
本发明公开了一种链霉菌产生纳他霉素与几丁质酶的协同发酵方法，在一种培养基中不同时间分别添加纳他霉素诱导物与几丁质酶诱导物对链霉菌进行发酵培养，在诱导初始阶段添加纳他霉素诱导物，在所述纳他霉素诱导物消耗殆尽时，添加几丁质酶诱导物。本发明通过不同时间添加不同诱导物解决了纳他霉素诱导物对于几丁质酶产生过程的阻遏作用。本发明方法以链霉菌为研究对象，诱导其产生两种拮抗物质几丁质酶与纳他霉素，实现了诱导抗性、降解病原菌细胞壁与抗生作用三种生防机制，可以防治多种作物病害，为新型复合生物农药的建立奠定了基础。
文档编号C12R1/465GK103215327SQ201310081250
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月14日 优先权日2013年3月14日
发明者陈捷, 林振亚, 吴琼, 马佳, 余传金, 高金欣, 范莉莉, 李雅乾 申请人:上海交通大学