专利名称：采用棉籽蛋白同步酶解发酵生产d-乳酸的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种发酵生产D-乳酸的方法，特别涉及一种左旋芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus laevolacticus)利用棉籽蛋白同步酶解发酵生产高光学纯D-乳酸的方法。
背景技术：
乳酸又称丙醇酸，分子式C3H6O3 (CH3CH0HC00H),分子量90.07884。由于乳酸分子中存在一个不对称的碳原子，因此具有光学异构现象，从而分为D-型和L-型两种。其生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法，化学法只能合成DL-乳酸，而发酵法根据所采用的菌株的不同，可以合成单一的L-乳酸、D-乳酸或者DL-乳酸。目前，约90%的乳酸是通过微生物发酵法生产的。D-乳酸作为一种主要的基本有机化工原料，在医药、农药、化工等方面均有十分广泛的应用。尤其是作为下一代高强度生物可降解塑料聚乳酸的单体，正在引起全球大公司和科学家的高度关注。全球D-乳酸的需求量每年都以6% 8%的速度增长，目前全世界D-乳酸的产量为1.6万吨，而D-乳酸的需求量约2.6万吨，由此可见，D-乳酸的市场前景广泛。随着全球性的能源和资源供求关系的日益紧张，以可再生生物质原料的高浓度、高光学纯D-乳酸生物制造势在必行。发展光学纯D-乳酸生物制造技术，将会促进可降解材料——聚乳酸的发展，对实施石油替代战略，确保国家能源与资源安全具有极为重要的作用。聚乳酸是一种由乳酸聚合而成的生物可降解性高分子聚合物，具有良好的生物相容性和生物可降解性。聚乳酸可用作药物缓释材料、手术缝合线、生物植片、组织修复材料等。聚乳酸制成的生物可降解纤维，耐热性175°C，可与聚酯纤维一样，制成长丝、短丝，用于服装和非服装织物，具有天然纤维的吸湿性，较好的手感，又有合成纤维的光滑和舒适挺括。聚乳酸制成的生物可降解塑料，能够代替PVC、PP塑料，用于塑料食品器具、医用服装、个人卫生用品、婴儿尿布、垃圾袋、`农用地膜及各种包装行业，从而减少“白色污染”，有利于环境保护。用乳酸生产生物降解塑料，在我国具有极大的市场发展潜力，目前已成为开发的热点项目。但是，由光学纯L-乳酸制得的聚乳酸在强度、热稳定性等方面尚需进一步的改进才能适应更为广泛的应用的需要。有报道称，由聚L-乳酸和聚D-乳酸混合而成的聚乳酸与聚L-乳酸相比具有更佳的结构和性能。虽然高纯度D-乳酸具有广阔的市场前景，但目前商业化的高纯度D-乳酸产品很少，高纯度D-乳酸的价格也远高于L-乳酸的价格。因此，采用廉价的非粮原料生产高纯度D-乳酸，具有良好的市场前景，一方面减轻对环境的压力，另一方面也会大大提高其经济价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种棉籽蛋白的新用途，以及发酵生产D-乳酸的方法。本发明所提供的棉籽蛋白的新用途，具体为棉籽蛋白在发酵生产D-乳酸中的应用。本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法，具体可包括如下步骤:将芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)接种到以棉籽蛋白作为唯一氮源的发酵培养基中进行发酵培养，所得发酵液(发酵体系，即发酵容器中的所有物质)中即含有D-乳酸。在所述方法中，所述棉籽蛋白在所述发酵培养基中的终浓度可为10-60g/L。在本发明的一个实施例中，所述棉籽蛋白在所述发酵培养基中的终浓度具体为40g/L。在所述方法中，所述发酵培养基的碳源可为葡萄糖；所述葡萄糖在所述发酵培养基中的终浓度可为50-200g/L，如50-100g/L，再如50_60g/L。在本发明的一个实施例中，所述葡萄糖在所述发酵培养基中的终浓度具体为50g/L、55g/L、60g/L、68g/L、75g/L或IOOg/L0在所述方法中，所述发酵培养基还含有中性蛋白酶；其中，中性蛋白酶的酶活定义为:在测定条件(30±0.2°C ;pH值7.5)下，每分钟水解酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm波长的吸光度与I微克酪氨酸的吸光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位(即1U)，用U/g表示。所述中性蛋白酶用于处理所述棉籽蛋白，释放氮元素。在本发明的一个实施例中，所述中性蛋白酶具体为诺维信(中国)生物技术有限公司产品，CAS号为9068-59-1。所述中性蛋白酶在所述发酵培养基中的终浓度为1X104U/L。在所述方法中，所述发酵培养基还含有中和剂，所述中和剂具体可为碳酸钙；所述碳酸钙在所述发酵培养基中的含量具体为所述葡萄糖质量的60% ;所述发酵培养基的pH为
5.5-6.5。具体的，所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下:所述葡萄糖50_200g/L ；所述棉籽蛋白10-60g/L ;所述中性蛋白酶IX 104U/L ;所述碳酸钙所述葡萄糖质量的60% ；PH为5.5-6.5。各浓度为相应组分在所述发酵培养基中的终浓度。
更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下:所述葡萄糖50g/L ;所述棉籽蛋白40g/L ;所述中性蛋白酶1X104U/L ;所述碳酸钙30g/L;pH为5.5。各浓度为相应组分在所述发酵培养基中的终浓度。在本发明的另一个实施例中，所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下:所述葡萄糖60g/L ;所述棉籽蛋白40g/L ;所述中性蛋白酶IX 104U/L ;所述碳酸钙36g/L ；pH为5.5-6.5。各浓度为相应组分在所述发酵培养基中的终浓度。在本发明中，所述发酵培养基需经高压灭菌，具体为115°C高压灭菌20min。在上述方法中，所述发酵培养的温度可为30_42°C。在本发明的一个实施例中，所述发酵培养的温度具体为37°C。在上述方法中，所述发酵培养的方式可为三角瓶静止培养(适于少量发酵，如50mL)或发酵罐震荡培养(适于批量发酵，如2L);所述发酵罐震荡培养的转速为50-100rpm(如50rpm)(旋转半径为6cm)；在上述方法中，所述发酵培养的时间可为24_48h，如35_48h。在本发明的一个实施例中，所述发酵培养的时间具体为35h、36h、42h或48h。在上述方法中，为了有效的提高发酵产物D-乳酸的产量，在所述发酵培养(所述发酵罐震荡培养)过程中，需要向所述发酵液中补加葡萄糖和碳酸钙；所述补加葡萄糖和碳酸钙的时间为所述发酵液中葡萄糖的含量开始低于20g/L时；所述补加葡萄糖的量为补加至所述发酵液中葡萄糖的含量达到初始浓度(60g/L);所述补加碳酸钙的量为所补加葡萄糖的质量的60%。本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法中，接种到所述发酵培养基中进行培养的所述芽孢乳杆菌(SporolactobaciIIus sp.)是经过活化的芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)。在本发明的一个实施例中，其活化方法(适于三角瓶静止培养)具体包括如下步骤:将所述芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)接入种子培养基,在37°C静止培养48h,得到培养物，将所述培养物按照1:10的体积比转接到新的种子培养基中，继续37°C静止培养24h,得到所述活化的芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)。在本发明的另一个实施例中，其活化方法(适于发酵罐震荡培养)具体包括如下步骤:1)将所述芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)接入种子培养基,在37°C静止培养48h，得到培养物1，将所述培养物I按照1:10的体积比转接到新的种子培养基中，继续37°C静止培养24h，得到培养物2 ；2)将步骤I)所述培养物2按照1:10的体积比转接到新的种子培养基中，继续37°C静止培养24h,得到所述活化的芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)。上述所有的所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下:葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，碳酸钙30g/L ；pH为5.5。各浓度为相应组分在所述发酵培养基中的终浓度。所述酵母粉为商业化产品，可以从国内生产商购买，比如安琪酵母股份有限公司。在上述方法中，所述芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)可为左旋芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus laevolacticus)。
在本发明的一个实施例中，所述将左旋芽孢乳杆菌(SporolactobaciIIuslaevolacticus)具体为左旋芽抱乳杆菌(Sporolactobacillus laevolacticus) DSM442。在上述方法中，所有所述棉籽蛋白中氮元素的质量含量均为8%。更加具体的，在本发明中，所述棉籽蛋白为青岛科瑞培养基有限公司的产品，其产品目录号为9508。本发明的再一个目的是提供一种发酵培养基及其在生产D-乳酸中的应用。本发明所提供的发酵培养基的pH为5.5-6.5，溶剂为水，溶质及浓度如下A或B:
A:所述甸甸糖50g/L ;所述棉杆蛋白40g/L ;所述中性蛋白酶I X 104U/L ;所述碳酸钙30g/L ;各浓度为相应组分在所述发酵培养基中的终浓度。B:所述甸甸糖60g/L ;所述棉杆蛋白40g/L ;所述中性蛋白酶I X 104U/L ;所述碳酸钙36g/L ;各浓度为相应组分在所述发酵培养基中的终浓度。本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法中，左旋芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus laevolacticus)DSM442以棉籽蛋白作为唯一氮源，大大的降低了原料成本，且酶解过程和发酵过程同步进行，大大简化了操作步骤，本发明的方法通过优化发酵最适氮源浓度、最适中性蛋白酶浓度酶解和最适温度等条件生产高浓度的D-乳酸,在分批补料发酵中，发酵时间为35h，发酵液中D-乳酸的浓度可达144.4g/L，糖酸转化率达到96.1%，D-乳酸的光学纯度达到99%。
图1为分批补料发酵模式高效生产D-乳酸，发酵液中相应葡萄糖和D-乳酸浓度的变化情况。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用 的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所涉及的各参数测定方法均如下:(I)L-乳酸和葡萄糖的测定方法:采用SBA-40C分析仪，双电机系统测定L-乳酸和葡萄糖的含量。原理:根据酶反应:L-乳酸(葡萄糖)+02+H20丙酮酸(葡萄糖酸)+H202。此反应是在固定化的L-乳酸氧化酶(葡萄糖氧化酶)的作用下完成的，反应产生的H2O2与L-乳酸(葡萄糖)的含量呈正比，通过过氧化氢电极来检测H2O2的生成量，从而计算L-乳酸(葡萄糖)的含量。测定方法:样品离心后收集上清，经适当稀释后由进样针吸取25 μ L，并注入反应池，底物透过酶膜圈与固定化酶层接触并反应，并产生电流信号，该电流信号与底物的浓度成线性比例关系，经微机控制的信号，可直接显示并打印结果。(2) D-乳酸浓度的测定方法:采用Agilentl260液相色谱仪，配备手性分离柱(日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10ff,4.6mm IDX50mm)。具体操作条件为:2mM的硫酸铜作为流动相，流量0.5mL/min,进样量5 μ 1，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25 V。利用D-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液(发酵体系)中D-乳酸的含量。(3)糖酸转化率均定义为:D_乳酸产量(克/升)-葡萄糖的消耗量(克/升)X 100%O(4)光学纯度(optical purity):是衡量旋光性样品中一个对映体超过另一个对映体的量的量度，它可用对映体过量值(enantiomeric excess)表示。本发明中D-乳酸的光学纯度按以下公式计算:D-乳酸含量+ (D-乳酸含量+L-乳酸含量)X 100%。左旋芽孢乳杆菌(SporolactobaciIIus laevolacticus)为左旋芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus laevolacticus) DSM442,该菌株购于德国菌种保藏保中心 DSMZ。棉籽蛋白:为青岛科瑞培养基有限公司的产品，其产品目录号为9508，其氮元素的质量含量为8% (产品说明中记载)。中性蛋白酶:为诺维信(中国)生物技术有限公司产品，CAS号为9068-59-1，其酶活为5X104U/g。其中，中性蛋白酶的酶活定义为:在测定条件(30±0.2°C ;pH值7.5)下，每分钟水解酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm波长的吸光度与I微克酪氨酸的吸光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位(即W。种子培养基:溶剂为水，溶质及其浓度如下:葡萄糖50g/L，酵母粉(安琪酵母股份有限公司)10g/L，碳酸钙30g/L ；pH为5.5-6.5。各浓度为相应组分在所述发酵培养基中的终浓度。所述发酵培养基需经高压灭菌，具体为1151:高压灭菌201^11。实施例1、高效生产D-乳酸的最适中性蛋白酶浓度的确定本实施例所用发酵培养基成分如下:55g/L葡萄糖，40g/L棉籽蛋白，33g/L碳酸钙，0g/L、0.Ig/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L或0.5g/L中性蛋白酶，培养基的溶剂为水；PH5.5-6.5。各浓度为相应组分在发酵培养基中的终浓度。所述发酵培养基需经高压灭菌，具体为115°C高压灭菌20min。确定用于生产D-乳酸的最适中性蛋白酶浓度的具体步骤如下:I)种子菌培养:将保存在MRS固体培养基上的左旋芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus laevolacticus) DSM442用接种环接一环到含有6mL种子培养基的试管中，30°C静止培养48h，然后按体积分数10%的接种量接种到新鲜种子培养基中，30°C静止培养24h,得到种子液(活化的左旋芽孢乳杆菌(SporolactobaciIIus laevolacticus)DSM442)。2)将步骤I)的种子液按体积比1:10的接种量接到上述六种含有不同浓度中性蛋白酶的发酵培养基(50mL)中。30°C三角瓶中静止发酵36小时。从Oh (将种子液接种到发酵培养基中的一刻)开始，每隔适当时间，取发酵液，12000rpm离心10分钟后，取上清液稀释合适的倍数测定如下参数:葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度；计算糖酸转化率和D-乳酸光学纯度。实验设3个重复，结果取平均值。结果显示，当不添加中性蛋白酶时，36h发酵结束后发酵液中残糖浓度依旧很高，D-乳酸的积累浓度仅有23.82g/L。当添加中性蛋白酶后D-乳酸的浓度会不同程度的增加，当中性蛋白酶的量从0.lg/L增加到0.3g/L时，D-乳酸的产量会逐渐的增加，当中性蛋白酶量从0.3g/L增加到0.5g/L时，D-乳酸的产量反而逐渐的降低。其中当中性蛋白酶的量达到0.2g/L和0.3g/L时D-乳酸的产量达到最大分别为52.2lg/L和52.78g/L，依据发酵时间短，糖酸转化率高、D-乳酸产量高和减低原料成本的原则，确定中性蛋白酶的最适浓度为 0.2g/L (相当于 1X104U/L)。表I生产D-乳酸的最适中性蛋白酶浓度的确定结果(30°C发酵36h)
权利要求
1.棉籽蛋白在发酵生产D-乳酸中的应用。
2.一种发酵生产D-乳酸的方法,包括如下步骤:将芽孢乳杆菌(Sporolactobacillussp.)接种到以棉籽蛋白作为唯一氮源的发酵培养基中进行发酵培养，所得发酵液中即含有D-乳酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述棉籽蛋白在所述发酵培养基中的终浓度为10-60g/L。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述发酵培养基的碳源为葡萄糖；所述葡萄糖在所述发酵培养基中的终浓度为50-200g/L。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于:所述发酵培养基还含有中性蛋白酶；所述中性蛋白酶在所述发酵培养基中的终浓度为ixio4u/l。
6.根据权利要求2-5中任一所述的方法,其特征在于:所述发酵培养基还含有中和剂，所述中和剂为碳酸钙；所述碳酸钙在所述发酵培养基中的含量为所述葡萄糖质量的60% ；所述发酵培养基的PH为5.5-6.5。
7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于:所述发酵培养基的组成为如下A或B: A:溶剂为水,溶质及浓度如下:所述葡萄糖50g/L ;所述棉籽蛋白40g/L;所述中性蛋白酶I X 104U/L ;所述碳酸钙30g/L ；pH为5.5 ; B:溶剂为水，溶质及浓度如下:所述葡萄糖60g/L;所述棉籽蛋白40g/L;所述中性蛋白酶I X 104U/L ;所述碳酸钙36g/L ；pH为5.5。
8.根据权利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于:所述发酵培养的温度为30-42 0C ;或 所述发酵培养的时间为24-48h。
9.根据权利要求2-8中任一所述的方法，其特征在于:所述发酵培养过程中，向所述发酵液中补加葡萄糖和碳酸钙； 所述补加葡萄糖和碳酸钙的时间为所述发酵液中葡萄糖的含量开始低于20g/L时； 所述补加葡萄糖的量为补加至所述发酵液中葡萄糖的含量达到初始浓度；所述补加碳酸钙的量为所补加葡萄糖的质量的60%。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述芽孢乳杆菌(Sporolactobacillussp.)为左旋芽抱乳杆菌(Sporolactobacillus Iaevolacticus)； 所述左旋芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus Iaevolacticus)具体为左旋芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus laevolacticus) DSM442。
全文摘要
本发明公开了一种发酵生产D-乳酸的方法。本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法，包括如下步骤将芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)接种到以棉籽蛋白作为唯一氮源的发酵培养基中进行发酵培养，所得发酵液中即含有D-乳酸；所述棉籽蛋白在所述发酵培养基中的终浓度为10-60g/L；所述芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)为左旋芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus laevolacticus)。本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法大大降低了原料成本，且酶解过程和发酵过程同步进行，大大简化了操作步骤，本发明在分批补料发酵中，发酵时间为35h，发酵液中D-乳酸的浓度可达144.4g/L，糖酸转化率达到96.1%，D-乳酸的光学纯度达到99%。
文档编号C12R1/01GK103184244SQ20131009026
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月20日 优先权日2013年3月20日
发明者李媛, 王丽敏, 于波, 马延和 申请人:中国科学院微生物研究所