专利名称：一种人活性颗粒酶k重组蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体地涉及了一种人活性颗粒酶K重组蛋白的表达、纯化及其活性鉴定的方法。
背景技术：
颗粒酶是外源性的丝氨酸蛋白酶，来源于自然杀伤细胞(NK)和细胞毒淋巴细胞(CTLs)释放的细胞浆颗粒，在抗肿瘤和抗病毒感染过程中发挥重要作用。这些颗粒内含颗粒酶原及其它蛋白酶原如穿孔蛋白。目前已经发现的颗粒酶有11种，分别命名为颗粒酶Al。在人类发现了 5类颗粒酶，它们分别是颗粒酶A (GzmA)、颗粒酶B (GzmB)、颗粒酶H(GzmH)、颗粒酶 K (GzmK)和颗粒酶 M (GzmM)0GzmK属于丝氨酸蛋白酶家族成员。研究表明，GzmK在能够诱导肿瘤细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的方式与GzmA相似，都是通过caspase非依赖途径诱导细胞凋亡，该方式的特点是颗粒酶和穿孔素共同作用时可以直接导致胞内线粒体损伤，从而导致活性氧(ROS)水平上升、粗面内质网压力(RER stress)或形成单链DNA缺口等。除诱导细胞凋亡功能外，还有研究表明，GzmK在炎症反应中也具有重要作用。如GzmK能够诱导巨噬细胞释放IL-1 β ,并通过PAR受体(蛋白酶激活受体)胞外诱导人肺成纤维细胞释放IL-6、IL-8、MCP-1等。因此，获得具有活性的GzmK重组蛋白对于研究其生物学功能及临床应用具有重要的理论和实际意义。原核表达具是目前掌握的最为成熟的表达系统，其所需的成本相对比较低廉，能够在较短时间内获得基因表达产物，并且具有操作简便的特点。加之可以表达产物尾部加上His标签，能够与Ni2+亲和层析柱特异性结合，并易于被高浓度咪唑溶液洗脱，因而可以利用镍柱亲和层析法对目的蛋白进行分离和纯化。亲和层析纯化蛋白具有简单，快速，产物纯度高等优点，是实际应用效果最好的方法之一。`Z-Lys-SBzl是一种丝氨酸蛋白酶硫酯底物,被丝氨酸蛋白酶GzmK切割后,SBzl能够与DTNB反应显黄色，在405nm处具有最大吸收值。吸光值越高，说明蛋白活性越好，从而准确检测GzmK的活性水平。
发明内容
本发明提出了一种人活性颗粒酶K重组蛋白(rhGzmK)的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤:
(1)获得hGzmK 的 cDNA ；
(2)构建和鉴定重组表达载体pET24a(+)-hGzmK；
(3 )重组质粒pET24a (+) -hGzmK转化大肠杆菌BL21 ；
(4)hGzmK重组蛋白的表达和鉴定；
(5 ) hGzmK重组蛋白的纯化；
(6)hGzmK重组蛋白的活性鉴定。
本发明rhGzmK的制备方法中，所述步骤(I)包括以下步骤:提取人NK92细胞中的总RNA，通过反转录获得cDNA，然后用特异PCR扩增获得约720 bp的hGzmK基因，引物序列如下:引物 1:5' - GGAATTCCATATGGAAATTATTGGAGGGAAAG ~3/ (划线部分为 Nde I 酶切位点，76-97);引物 2:5' - CCGCTCGAGATTTGTATGAGGC -3'(划线部分为 Xho I 酶切位点，780-792)。hGzmK 基因 PCR 扩增产物约 720 bp。本发明rhGzmK的制备方法中，所述步骤(2)包括以下步骤:将得到的hGzmK PCR产物与原核表达载体pET24a(+)分别进行Nde I和Xho I双酶切，酶切产物回收后于16 °C过夜连接，连接产物转化大肠菌DH5a后提取质粒并用Nde I和Xho I双酶切鉴定，获得表达载体 pET24a (+) -hGzmK。本发明rhGzmK的制备方法中，所述步骤步骤(3)中的转化是指:将所述重组质粒pET24a(+)-hGzmK加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态中，然后置于冰上冷却后进行热击；加入无抗生素培养基后培养60min，涂布于kan+ LB平板，经37 °C培养12_16h，得到hGzmK阳性转化子细菌。所述置于冰上时间是30min ;热击的条件为:水温42°C，时间90s ；无抗培养基加入体积比为1:3 ;恢复时间为60min。本发明rhGzmK的制备方法中，所述步骤(4)中的表达是指:将阳性转化子细菌PET24a(+)-hGzmK/BL21接种于LB培养基中，摇菌过夜；再接菌于新的LB培养基中，摇菌至0D600=0.6 0.8之间；然后在加入ImM IPTG诱导表达6h，12000rpm离心2min，去上清后，用PBS重悬菌体,沸水中煮样5min,收集上清得到所述rhGzmK。本发明rhGzmK的制备方法中，所述步骤(4)中的鉴定是指:将重组蛋白加样进行SDS-PAGE电泳并转膜后，以小鼠抗His多克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗，通过Western Blot鉴定所述rhGzmK的表达。本发明rhGzmK的制备方法中，所述步骤(5)中的包括以下步骤:将IPTG诱导表达所获得的PET24a(+)-hGzmK/BL21菌体离心后，用PBS重悬，然后置于超声波破碎仪中进行超声破碎；破碎后 ，于4°C, 12000rpm,离心15min,弃去上清，收集的沉淀用bindingbuffer (0.5M NaCl、20mM Tis_HCl、5mM咪唑、10%甘油、8M尿素)，使包涵体中的蛋白溶解在尿素溶液中，再次离心，收集获得的上清，0.45 μ m滤膜过滤。将过滤后的溶液通过预处理好的Ni2+柱进行亲和层析纯化,然后用binding buffer和washing buffer (0.5M NaCl>20mM Tis-HCl、60mM咪唑、10%甘油、8M尿素)重悬洗去未结合的杂质，最后用含高浓度咪唑的 elute buffer (0.5M NaCl、20mM Tis_HCl、500mM 咪唑、10% 甘油、8M 尿素)使亲和力减弱，从而将rhGzmK洗脱下来。洗脱下来的buffer中含有高浓度尿素和咪唑，将其放入处理好的透析袋中进行透析，尿素和咪唑析出，袋中的蛋白即为高纯度的rhGzmK。本发明rhGzmK的制备方法中，所述步骤(6)中的活性鉴定是指:在缓冲液(50 mMTris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.01% Triton X-100 ；pH 7.6)中加入终浓度为 0.3mM 底物溶液Z-Lys-SBzl，混匀后加入96孔板中。在含底物溶液的96孔板中加入待测重组蛋白后，加入终浓度为0.3mM底物显色液5，5- 二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，作用10分钟后于酶标仪上读取405nm处OD值。本发明利用基因工程的方法构建了能够稳定表达人活性颗粒酶K重组蛋白的大肠杆菌工程菌，表达产物可以用镍层析柱进行纯化，且获得的纯化蛋白具有较好的生物学活性。本发明提供了一种制备人活性颗粒酶K重组蛋白的方法及纯化工艺，为获得具有生物学活性的人活性颗粒酶K重组蛋白提供了一种简单、高效的实验方法，有利于对人颗粒酶K进行结构和生物学功能的研究。
图1为本发明方法中重组表达质粒PET24a(+)-hGzmK构建流程图；图2为hGzmK基因PCR扩增图谱，第一泳道为DL 2000分子量标准(自上向下依次为: 2000 bp, IOOObp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp)，第二泳道为 PCR 产物；图3为重组质粒pET24a(+)-hGzmK酶切鉴定图谱；第一泳道为为DL 2000分子量标准 (自上向下依次为:2000 bp, IOOObp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp),第二泳道为未酶切的质粒pET24a (+) -hGzmK,第三泳道为Nde I和Xho I双酶切后的pET24a (+) -hGzmK ； 图4为GzmK重组蛋白表达的SDS-PAGE鉴定结果；第一泳道为蛋白分子量标准(自上向下依次为:116KDa, 66.2KDa, 45.0KDa, 35.0 KDa, 25.0 KDa, 18.4 KDa, 14.4 KDa)，第二泳道为pET24a (+) -hGzmK/BL21无IPTG诱导的电泳结果，第三泳道为pET24a (+) -hGzmK/ BL21 IPTG诱导的电泳结果，第四泳道为pET24a(+)/BL21的IPTG诱导分析结果；图5为GzmK重组蛋白表达的western blot鉴定结果；第一泳道为蛋白分子量标准(自上向下依次为:170 KDa, 130KDa, 95KDa, 70 KDa, 55 KDa, 43 KDa, 34 KDa, 26 KDa)，第二泳道为pET24a⑴-hGzmK/BL21无IPTG诱导的电泳结果，第三泳道为 pET24a(+)-hGzmK/BL21 IPTG诱导的电泳结果，第四泳道为pET24a(+)/BL21的IPTG诱导分析结果；图6为GzmK蛋白亲和层析的SDS-PAGE检测结果；第一泳道为蛋白分子量标准(自上向下依次为:116KDa, 66.2KDa, 45.0KDa, 35.0 KDa, 25.0 KDa, 18.4 KDa, 14.4 KDa)，第二泳道为pET24a (+) -hGzmK/BL21无IPTG诱导的电泳结果，第三泳道为pET24a (+) -hGzmK/ BL21 IPTG诱导的电泳结果，第四泳道为亲和层析纯化后的电泳结果；图7为GzmK重组蛋白活性鉴定结果；以透析液为对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式
作进一步描述，以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不以此来限制本发明的保护范围。
实施例1本实施例是本发明方法中重组质粒pET24a(+)-hGzmK的构建及鉴定，其流程图见图1， 具体过程如下:1.获得 hGzmK 的 cDNA提取人NK92细胞中的总RNA，以OligdT为引物扩增获得hGzmK的cDNA。
2.重组表达载体pET24a(+)-hGzmK的构建 (I) hGzmK基因的PCR扩增根据GenBank中人颗粒酶K基因序列(NM_002104)设计引物如下:引物 1:5' - GGAATTCCATATGGAAATTATTGGAGGGAAAG ~3/ (划线部分为 Nde I 酶切位点，76-97)引物 2:5' - CCGCTCG AGATTTGTATGAGGC -3'(划线部分为 Xho I 酶切位点，780-792)以人cDNA为模板，引物I和引物2为上下游引物，PCR扩增获得约720 bp的hGzmK基因(图2)。
(2)将PCR产物与pET24a(+)同时进行Nde I和Xho I双酶切并回收，然后进行 16 °C过夜连接。
(3)连接产物转化大肠杆菌DH5CI感受态后，获得转化菌，提取质粒并经酶切鉴定，hGzmK基因正确插入pET24a(+)相应酶切位点中，获得重组质粒pET24a(+)-hGzmK，其酶切鉴定图谱如图3所示，在约720bp处有一特异性DNA条带(第三泳道)，表明质粒构建正确。测序结果显不该基因序列与GenBank公布的序列一致。
实施例2本实施例为将实施例1中的重组质粒pET24a(+)-hGzmK转化大肠杆菌BL21中，并进行诱导表达及表达产物的鉴定，具体过程如下:1.重组质粒pET24a (+) -hGzmK转化大肠杆菌BL21Cl)将鉴定正确的重组质粒pET24a(+)-hGzmK约4μ L加入冰预冷的200 μ L BL21感受态中，冰上放置30min，42°C水浴热击90s，然后冰上放置2 3min，加入600 μ L不含抗生素的LB培养基，置于37°C，220rpm摇菌60min，然后涂布于kan+ LB平板，37 °C培养至单菌落长出。(2)挑单菌落接种到kan+ LB培养基中培养过夜，然后提取质粒并进行双酶切鉴定，即获得了阳性转化子细菌pET24a (+) -hGzmK/BL21。
2.hGzmK重组蛋白的表达和鉴定。
(l)pET24a(+)_hGzmK/BL21 阳性克隆的诱导表达将筛选得到的阳性转化子细菌pET24a(+)-hGzmK/BL21按2%接种于LB培养液中，37 °C, 220 rpm摇菌过夜，再按2%接菌于新的LB培养液中，37 °C, 220 rpm摇菌至对数期，SP 0D600=0.6 1.0，然后加入ImM的IPTG诱导剂，37 °C, 220 rpm诱导表达6h，收集菌体。
(2) hGzmK重组蛋白的鉴定将收集到的菌体用PBS重悬，取200 μ LjPASOyL 5XSDS上样缓冲液并煮样 5min，收集上清得到细菌总蛋白，其中包含其所表达的hGzmK重组蛋白。SDS-PAGE电泳结果如图4所示，在25-35KDa处有一特异性蛋白条带(第三泳道)，与预期的人活性颗粒酶K蛋白分子量相符。由于该重组蛋白为人活性颗粒酶K和6个His连接的融合蛋白，将凝胶转膜后，以小鼠抗His单克隆抗体为一抗，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，利用Western Blot对该重组蛋白进行鉴定，其结果如图5所示，在26-34KDa处有一特异性显色条带(第三泳道)，表明该重组蛋白能特异性地与抗His单克隆抗体结合。
实施例3 将实施例2中的重组蛋白利用亲和层析柱进行纯化，并对纯化蛋白进行活性鉴定，具体过程如下:1.hGzmK重组蛋白的纯化 Cl)重组蛋白包涵体的制备与处理表达菌体用PBS重悬后，置于超声破碎仪中进行超声破碎；破碎后，于4°C，12000rpm, 离心20min，检测到hGzmK重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中，弃去上清。
收集的沉淀用PBS尿素溶液重悬，使包涵体中的蛋白溶解在尿素溶液中，于4°C12000rpm离心20min,收集获得的上清,0.45 μ m滤膜过滤。
(2) His柱亲和层析纯化用5个体积的50mM Ni2+通过His亲和层析柱以后，Ni2+与凝胶通过亲和力结合在一起，再分别用5个体积的双蒸水和5个体积的binding buffer(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl> 5mM咪唑、10%甘油、8M尿素)洗去未结合的Ni2+，当带His标签的hGzmK重组蛋白滤液通过时，hGzmK重组蛋白与Ni2+亲和吸附,然后用10个体积的binding buffer和6个体积的 washing buffer (0.5M NaCl、20mM Tis_HCl、60mM 咪唑、10% 甘油、8M 尿素)将不能结合的杂质洗掉，最后用 3 个体积的 elute bufferC0.5M NaCl、20mM Tis_HCl、500mM 咪唑、10% 甘油、8M尿素)将hGzmK重组蛋白体脱下来，每管2mL依次收集洗脱液。
洗脱下来的hGzmK蛋白溶液中含有8M尿素和500mM咪唑，将其放入处理好的透析袋中，透析袋浸透在不含尿素和咪唑的缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tis_HCl、10%甘油)中，尿素和咪唑析出，袋中的蛋白即为高纯度的hGzmK重组蛋白。该纯化蛋白的SDS-PAGE电泳图谱见图6，其纯度可达95%以上。
2.hGzmK重组蛋白的活性检测活性鉴定是在常温 的缓冲液(50 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.01% Triton X-100， pH 7.6)中进行。向该缓冲液中加入终浓度为0.3mM底物溶液Z-Lys-SBzl，混匀后加入96 孔板中，每孔150 μ L0在每孔底物溶液中加入终浓度为0.4 μ M hGzmK重组蛋白或相同体积的透析溶液(Mock)，然后加入终浓度为0.3mM底物显色液5，5- 二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)，混匀后静置10分钟，于酶标仪上读取405nm处OD值，其检测如见图7所示，表明获得的人活性颗粒酶A重组蛋白具有较好的生物学活性。
权利要求
1.一种人活性颗粒酶K重组蛋白的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤: a)获得hGzmK 的 cDNA 提取人NK92细胞中的总RNA，用RT-PCR的方法获得cDNA，然后用特异PCR扩增获得hGzmK基因； b)构建和鉴定重组表达载体pET24a(+)-hGzmK 将得到的hGzmK PCR产物与原核表达载体pET24a(+)分别进行Nde I和Xho I双酶切，酶切产物回收后于16 1:过夜连接，连接产物转化大肠菌DH5a后提取质粒并用Nde I和Xho I双酶切鉴定，得到约720 bp条带，证明pET24a(+)-hGzmK重组质粒构建成功； c)重组质粒pET24a(+) -hGzmK转化大肠杆菌BL21 转化是指:将所述重组质粒pET24a (+)-hGzmK加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态中，然后置于冰上冷却后进行热击；加入无抗生素培养基后培养60min，涂布于kan+ LB平板，经37°C培养12 -16h，得到hGzmK阳性转化子细菌； d)hGzmK重组蛋白的表达和鉴定 将所述阳性转化子细菌pET24a (+) -hGzmK/BL21接种于LB培养基中，摇菌过夜；再接菌于新的LB培养基中，摇菌至0D600=0.6^0.8之间；然后再加入IPTG诱导表达6h，12000rpm离心2min，去上清后，用PBS重悬菌体，沸水中煮样5min，收集上清得到rhGzmK ;以小鼠抗His多克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗,通过Western Blot鉴定所述rhGzmK的表达；其中:诱导表达的诱导剂IPTG终浓度为ImM ； e ) hGzmK重组蛋白的纯化 将IPTG诱导表达所获得的PET24a(+)-hGzmK/BL21菌体离心后，用PBS重悬，然后置于超声波破碎仪中进行超声破碎；破碎后，于4°C、12000rpm,离心15min,检测到rhGzmK主要以包涵体的形式存在于沉淀中；弃去上清后，收集的沉淀用binding buffer尿素溶液重悬，使包涵体中的蛋白溶解在尿素溶液中，再次离心，收集获得的上清，0.45 μ m滤膜过滤；将过滤后的溶液通过预处理好的Ni2+柱进行亲和层析纯化； f) hGzmK重组蛋白的活性鉴定 在缓冲液中加入底物溶液Z-Lys-SBzl，混匀后加入96孔板中；在含底物溶液的96孔板中加入待测重组蛋白后，加入底物显色液5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，作用10分钟后于酶标仪上读取405nm处OD值。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)的hGzmK基因PCR的引物序列如下:引物 1:5' - GGAATTCCATATGGAAATTATTGGAGGGAAAG -3'其中:划线部分为 Nde I 酶切位点，76-97;引物 2:5' - CCGCTCGAGATTTGTATGAGGC -3'其中:划线部分为 Xho I 酶切位点，780-792 ；hGzmK基因PCR扩增产物约720 bp。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)所述的置于冰上的时间是30min;热击的条件为:水温42°C，时间90s ;无抗培养基加入体积比为1:3 ;恢复时间为60min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e)所述Ni2+柱进行亲和层析纯化是:将Ni2+通过亲和层析凝胶柱以后，Ni2+与凝胶亲和吸附，当带His标记的rhGzmK滤液通过时rhGzmK与Ni2+亲和吸附，然后用binding buffer和washing buffer洗去未结合的杂质，最后用含高浓度咪唑的elute buffer使亲和力减弱,将rhGzmK洗脱下来；洗脱下来的缓冲液中含有高浓度尿素和咪唑，将其放入处理好的透析袋，透析袋浸透在不含尿素和咪唑的缓冲液中，尿素和咪唑析出，袋中的蛋白即为高纯度的rhGzmK。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述bindingbuffer的成分包括0.5MNaCl、20mM Tis_HCl、5mM 咪唑、10% 甘油、8M 尿素；所述 washing buffer 的成分包括 0.5MNaCl、20mM Tis-HCl、60mM 咪唑、10% 甘油、8M 尿素；所述 elute buffer 的成分包括(λ 5ΜNaCl、20mM Tis_HCl、500mM 咪唑、10% 甘油、8M 尿素。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述不含尿素和咪唑的缓冲液成分为0.5MNaCl、20mM Tis-HCl、10% 甘油。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤f)的缓冲液为50mM Tris-HCl，0.15M NaCl,0.01% Triton X-100，pH 7.6 ;底物溶液 Z-Lys-SBzl 终浓度为 0.3mM ;底物显色液.5，5- 二硫代 双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)终浓度为0.3mM。
全文摘要
本发明涉及一种人活性颗粒酶K重组蛋白(rhGzmK)的制备方法，该重组蛋白去除了人颗粒酶K(hGzmK)N端的24个氨基酸，并在C端增加了6个组氨酸，以方便用镍离子柱进行纯化。其流程是抽提人NK92细胞的总RNA，利用RT-PCR技术得到hGzmK基因，将之与原核表达载体pET24a(+)相连，构建重组表达质粒pET24a(+)-hGzmK，经转化大肠杆菌BL21后获得工程菌，该工程菌经IPTG诱导可表达rhGzmK。该重组蛋白以包涵体的形式表达，可利用镍亲和层析柱进行纯化，其纯度可达95%以上。该方法具有操作简单、产量高、重组蛋白易于纯化等特点，且纯化蛋白具有较高的生物学活性。
文档编号C12N15/70GK103205444SQ20131009085
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者江文正, 龙凤英, 杜佳妮, 陈冉, 孔晓波, 史亚茹 申请人:华东师范大学