8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列和SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本发明还提供一种翻译系统，其包含：(i)8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物；(ii)本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物优先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。最后，本发明提供一种能够催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸的酪氨酸酚裂解酶突变体，其含有的氨基酸序列由SEQ?ID?NO：5所示。
【专利说明】8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域。具体地，本发明提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体， 其为一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID N0 :4所示的氨基 酸序列和SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与 SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本发明还涉及一种2-氨基-3-(8-羟基喹 啉-5-基）丙酸（简称8-羟基喹啉丙氨酸，简写为HqAla)翻译系统。更具体地，本发明涉 及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物 定点特异性插入目标蛋白质的翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异性 插入8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的方法。本发明还涉及一种酪氨酸酚裂解酶突变 体，其含有的氨基酸序列由SEQ ID N0 :5所示，所述酪氨酸酚裂解酶突变体催化8-羟基喹 啉生成8-羟基喹啉丙氨酸。最后，本发明还提供一种通过遗传编码包含能够螯合金属离子 的非天然氨基酸的突变蛋白质来拓展蛋白功能的方法。
【背景技术】
[0002] 遗传编码螯合金属离子的非天然氨基酸是一种研究蛋白质传感器设计，金属酶工 程以及蛋白核磁共振的有力工具，但是，受限于非天然氨基酸合成的复杂性，使得该方法不 能被生物学家广泛地应用。本发明通过定向进化酪氨酸酚裂解酶，使其能够高效地催化一 种新型非天然氨基酸-8-羟基喹啉丙氨酸的生物合成，该非天然氨基酸可以与多种过渡金 属离子形成稳定复合物。酪氨酸酚裂解酶（Tyrosine phenol lyase, TPL)，又名β-酪氨 酸酶，以憐酸批卩多醒（pyridoxal_phosphate，PLP)为辅酶。1987年，Kazakov等发现TPL分 子由4个相同的分子量约为50kDa的亚基组成，每个亚基四聚体与4分子磷酸吡哆醛（PLP) 结合在一起。TPL可以催化L-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个 反应是可逆的，将8-羟基喹啉代替苯酚后，可由8-羟基喹啉、丙酮酸钠和氯化铵可在TPL 催化下生成8-羟基喹啉丙氨酸。
[0003] 遗传编码8-羟基喹啉丙氨酸还需要一种在目标蛋白中定点特异插入非天然氨基 酸的方法，本研究现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地 定点插入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别合适的 选择密码子（selector codon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸插入限 定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA (Ο-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰 基-tRNA合成酶（0-RS)用非天然氨基酸加载该Ο-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任 何内源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶（RS)、氨基酸或密码子交叉反应（即，它必须是正交 的）。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。
[0004] 本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交 翻译系统，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公布号W0 2002/086075， 其发明名称为"METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS" ；W0 2002/085923,其发明名称为"IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS";W0 2004/094593,其发明名称为"EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"。定点特异性插入非天然氨基酸的正交翻译系统及 它们的产生和使用方法的其他讨论还可参见Wang和Schultz, Chem. Commun. (Camb) 1 : 1-11 (2002) ;Wang 和 Schultz, Angewandte Chemie Int. Ed. 44(1) :34-66(2005); Xie 和 Schultz，Methods 36(3) :227-238(2005) ;Xie 和 Schultz，Curr. Opinion in Chemical Biology9 (6) :548-554(2005) ;Wang 等，Annu. Rev. Biophys.Biomol. Struct. 35: 225-249 (2006)。虽然目前本领域已有一套完善的系统可以定点特异性插入多种非天然氨 基酸，但是由于8-羟基喹啉丙氨酸自身结构的特点，目前仍无报道可以成功地在蛋白中插 入8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物。同时，目前报道中成功插入的其他非天然氨基酸均 与8-羟基喹啉丙氨酸结构差异较大，导致本领域技术人员根本不会想到使用相同的系统 去整合8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物。另外，正交氨酰基-tRNA合成酶的筛选工作量 非常大，需要通过3轮正负筛选，即总共6轮筛选，才从突变库（包含上百万甚至上千万个 克隆）中筛选得到本发明中所述的正交氨酰基-tRNA合成酶。同时由于筛选过程中经常会 出现假阳性克隆，我们需要通过进一步的试验依次去验证它们插入非天然氨基酸的能力， 无形中又增加了许多工作量。因此，本发明的内容具有重要的意义，也是首次在蛋白中成功 地定点特异插入8-羟基喹啉丙氨酸，所产生的突变蛋白质不仅具有螯合金属离子的能力， 并且能够作为特异性金属离子传感器。
【发明内容】
[0005] 1、技术问题
[0006] 本发明提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其为一种正交氨酰基-tRNA合成酶， 其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID N0 :4所示氨基酸和SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列的 保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列相同的酶活 性。这种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够用8-羟基喹啉丙氨酸（简写为HqAla)或其结构 类似物优先氨酰化与之配对的正交tRNA，从而在翻译的氨基酸序列中插入HqAla或其结构 类似物。这是本发明人首次发现的，相应地，在本发明中将其命名为正交8-羟基喹啉丙氨 酸氨酰基-tRNA合成酶（HqAlaRS)。
[0007] 在整个本发明的说明书中，术语"8-羟基喹啉丙氨酸的结构类似物"是指选自 8-羟基喹啉丙氨酸的盐或酯、对羟基苯基丙氨酸或对羟基苯基丙氨酸的盐或酯的化合物。 本发明还提供一种酪氨酸酚裂解酶（Tyrosine phenol lyase,简写为TPL)突变体，所述酪 氨酸酚裂解酶突变体可以高效地催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸，其氨基酸序列 为：
[0008] (l)SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列，或
[0009] (2)将SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添 加且具有与SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列相同的催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨 酸的酶活性的由SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0010] 此外，本领域技术人员应该理解，在本发明中，术语"能够催化8-羟基喹啉生成 8-羟基喹啉丙氨酸的酪氨酸酚裂解酶突变体"不仅包括SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列， 还包括SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列的功能片段或功能衍生物，S卩，所述功能片段保留催 化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸的酶活性，所述功能衍生物是指将SEQ ID NO :5所 示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO :5所示的 氨基酸序列相同的催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸的酶活性的由SEQ ID NO :5所 示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0011] 这种能够催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸的酪氨酸酚裂解酶突变体是本 发明人首次发现的。
[0012] 在上述发现的基础上，本发明提供一种利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶 的配对将8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物定点特异性插入目标蛋白质的翻译系统，和 利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异性插入8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的 方法。本发明还涉及用这种翻译系统和这种方法产生的含有8-羟基喹啉丙氨酸或其结构 类似物的突变蛋白质及其应用。
[0013] 因此，本发明的目的在于提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将 8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物定点特异性插入蛋白质的翻译系统，并且提供利用该翻 译系统在目标蛋白质中定点特异性插入8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的方法。
[0014] 本发明还提供利用本发明的翻译系统产生的含有至少一个8-羟基喹啉丙氨酸或 其结构类似物的突变蛋白质。在本发明的优选方面中，本发明人利用这种方法将8-羟基喹 啉丙氨酸或其结构类似物定点特异性插入目的蛋白中，所述目的蛋白包括，但不限于，荧光 蛋白（Fluorescent Proteins,简写为FP)。然而，本领域技术人员应该理解，本发明的方法 也可以用于在荧光蛋白之外的多种蛋白中定点特异性插入8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类 似物，并不局限于该蛋白。
[0015] 最后，本发明还提供一种通过遗传编码包含能够螯合金属离子的非天然氨基酸的 突变蛋白质来拓展蛋白功能的方法，所述非天然氨基酸能螯合多种金属离子，本发明中优 选在蛋白的氨基酸序列中引入8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物。
[0016] 2、技术方案
[0017] 本发明人经过筛选，获得一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其为一种正交氨酰 基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID N0 :4所示氨基酸序列和SEQ ID N0 : 4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID NO :4所示的 氨基酸序列相同的酶活性，在本发明中将其命名为正交8-羟基喹啉丙氨酸氨酰基-tRNA合 成酶（HqAlaRS)。并且，本发明人利用所述正交氨酰基-tRNA合成酶，研发了一种在蛋白的 氨基酸序列中引入8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的翻译系统，该翻译系统在本文中 简称为8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统（有时也简称为"本发明的翻译系统"）。
[0018] 本领域技术人员应该理解，在本发明中，除了 SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列之 夕卜，术语"本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶"或"正交8-羟基喹啉丙氨酸氨酰基-tRNA合 成酶"还包括SEQ ID N0 :4所示氨基酸序列的保守性变体，只要所述保守性变体具有与SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列相同的酶活性即可；并且还包括将SEQ ID N0 :4所示的氨基酸 序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列 相同的酶活性的由SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0019] 具体来说，本发明提供在体内（例如在宿主细胞内）识别选择密码子（selector codon)如琥珀终止密码子（TAG)从而将非天然氨基酸8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物 定点特异性插入到多肽链中的8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统。所述8-羟基喹啉丙氨酸翻译 系统包含不与宿主细胞翻译机制相互作用的正交-tRNA (O-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成 酶（Ο-RS)配对。即，宿主细胞内源性氨酰基-tRNA合成酶不会识别O-tRNA。类似地，本发 明提供的Ο-RS不以显著水平或者某些情况下不以可检测水平地识别内源性tRNA。利用所 述翻译系统能够产生在翻译过程中定点特异性插入8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的 大量蛋白质。
[0020] 在一些方面中，本发明提供8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统。所述翻译系统包含：
[0021] (a) 8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物，
[0022] (b)本发明的正交氨酰-tRNA合成酶（0-RS)，和
[0023] (c)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID N0 :1所示的多核苷酸序列，其中所述正交 氨酰-tRNA合成酶用8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物优先氨酰化所述0-tRNA。
[0024] 其中，术语"8-羟基喹啉丙氨酸的结构类似物"是指选自8-羟基喹啉丙氨酸的盐 或酯、对羟基苯基丙氨酸或对羟基苯基丙氨酸的盐或酯的化合物。
[0025] 优选地，本发明的8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸，其 中所述核酸含有由正交tRNA (Ο-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子，优选地为琥珀 密码子。更优选地，本发明的8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统还包含编码正交氨酰基-tRNA合 成酶的核苷酸序列。
[0026] 所述系统中所用的正交氨酰基-tRNA合成酶（0-RS)即为本发明人首次发现的氨 酰基tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID N0 :4所示氨基酸序列和SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID N0 :4 所示的氨基酸序列相同的酶活性。
[0027] 本发明还涉及编码所述正交氨酰-tRNA合成酶（0-RS)的核苷酸序列。在一个优 选的方面中，所述核苷酸序列为SEQ ID N0 :3。
[0028] 在本发明的优选方面中，本发明提供一种8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统，所述系统 包含：
[0029] (i) 8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物；
[0030] (ii)本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶；
[0031] (iii)正交tRNA，其包含SEQ ID N0 :1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰 基-tRNA合成酶用所述8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物优先氨酰化所述正交tRNA ;和
[0032] (iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至 少一个选择密码子。
[0033] 其中，术语"8-羟基喹啉丙氨酸的结构类似物"是指选自8-羟基喹啉丙氨酸的盐 或酯、对羟基苯基丙氨酸或对羟基苯基丙氨酸的盐或酯的化合物。
[0034] 优选地，所述8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统还包含编码本发明的正交氨酰基-tRNA 合成酶的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，所述编码本发明的正交氨酰基-tRNA合 成酶的核苷酸序列为SEQ ID N0 :3所示。
[0035] 该翻译系统中的各种组分可以衍生自各种物种来源，例如，该翻译系统中的各组 分衍生自詹氏甲烧球菌（]^1：1^110(30(^118」3111^8(311；[；0。例如，正交七1?敵(041?敵）为古菌来 源的反密码子突变为与琥珀密码互补的酪氨酸tRNA。在一些实施方式中，ο-tRNA是琥珀抑 制型tRNA。在一些实施方式中，0-tRNA包含SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列，优选地， O-tRNA的序列如SEQ ID NO :1所示。在一个实施方式中，用于该系统的正交氨酰基-tRNA 合成酶可以包含SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列及该序列的保守变体。在优选的实施方案 中，用于该系统的正交氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸序列为SEQ ID NO :4所示。
[0036] 在一些方面中，本发明的8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的 核酸，其中所述核酸具有由正交tRNA (Ο-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子。在优选 方面中，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子。
[0037] 在一些方面中，本发明提供包含编码本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸 序列和相对应的正交tRNA序列的宿主细胞。所用的宿主细胞不作具体限定，只要正交氨酰 基-tRNA合成酶和正交tRNA在它们的宿主细胞环境中保留它们的正交性即可。例如，所述 宿主细胞可以是真细菌细胞，优选大肠杆菌。
[0038] 本发明还提供产生在至少一个所选位置定点特异性插入8-羟基喹啉丙氨酸的突 变蛋白质的方法。所述方法利用上述8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统。所述方法通常包括下 述步骤：
[0039] (a)提供含有以下组分的8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统的步骤：
[0040] (i) 8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物；
[0041] (ii)本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶（0-RS);
[0042] (iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID N0 :1所示的多核苷酸序列，其中所述 0-RS用8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物优先氨酰化所述Ο-tRNA ;和
[0043] (iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有Ο-tRNA特异性识别的至少一个 选择密码子（任选地为琥珀密码子）；
[0044] (b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及 编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入8-羟 基喹啉丙氨酸或其结构类似物，在所述目标蛋白质的翻译过程中，8-羟基喹啉丙氨酸或其 结构类似物氨酰化的正交RNA识别编码所述目标蛋白质的mRNA上的选择密码子以及8-羟 基喹啉丙氨酸或其结构类似物，从而介导8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物定点特异性 插入所述选择密码子对应的氨基酸位置，从而产生在所选位置含有8-羟基喹啉丙氨酸或 其结构类似物的突变蛋白质。
[0045] 其中，术语"8-羟基喹啉丙氨酸的结构类似物"是指选自8-羟基喹啉丙氨酸的盐 或酯、对羟基苯基丙氨酸或对羟基苯基丙氨酸的盐或酯的化合物。
[0046] 本领域技术人员应该理解，适当的重组载体的构建和宿主细胞的筛选可以通过常 规分子克隆技术和筛选技术实现。
[0047] 本领域技术人员应该理解，在步骤（b)中，将所述正交tRNA序列和编码所述正交 氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适 当的宿主细胞中可以通过多种方式进行，例如，将所述正交tRNA序列、编码所述正交氨酰 基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列分别可操作性地连接 到适当的载体中，再以任意次序或三者共同转化到适当的宿主细胞中；或者，也可以将所述 正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地连接到一个 适当的载体中（两种序列之间有或无适当的接头连接），将编码所述目标蛋白质的核酸序 列可操作性地连接到另一种不同的适当的载体中，然后将构建好的两种重组载体共同转化 到适当的宿主细胞中；或者，也可以将所述正交tRNA序列和编码所述目标蛋白质的核酸序 列可操作性地连接到一个适当的载体中（两种序列之间有或无适当的接头连接），将编码 所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地连接到另一种不同的适当的载体 中，然后将构建好的两种重组载体共同转化到适当的宿主细胞中。或者，也可以将正交tRNA 序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码目标蛋白质的核酸序列 以任意适当的顺序可操作性地连接在一起，然后克隆到一个载体上，最后转化到适当的宿 主细胞中。上述克隆方案都是可行的，本领域技术人员可以根据实验的需要容易地进行适 当的选择。
[0048] 另外，本领域技术人员还应该理解，为了避免宿主细胞对外源重组载体的"踢除" 效应，往往选择用带有不同抗生素标记的载体来构建需要共同转化到同一宿主细胞中的核 酸序列片段。对于适当的载体的选择、重组载体的构建、宿主细胞的转化或转染等等，都是 本领域的常规技术，例如，可以参见美国冷泉港实验室出版的分子克隆手册。
[0049] 在所述方法的一些实施方式中，提供翻译系统的步骤包括通过定点诱变使野生型 氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合口袋发生突变，选择用所述非天然氨基酸（即8-羟基喹 啉丙氨酸或其结构类似物）优先氨酰化所述Ο-tRNA的氨酰基-tRNA合成酶突变体（即， 本发明所用的正交氨酰基-tRNA合成酶）。所述选择步骤包括定点诱变后从得到的氨酰 基-tRNA合成酶分子库进行所述0-RS的正选择和负选择（参见下述实施例2)。在一些实 施方式中，提供翻译系统的步骤还包括提供Ο-tRNA的序列，Ο-tRNA为古菌来源的反密码子 突变为与琥珀密码互补的酪氨酸tRNA，例如，所述Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA，或者0-tRNA 包含SEQ ID N0 :1所示的多核苷酸序列。在这些方法中，提供翻译系统的步骤还包括提供 含有所述翻译系统所用的琥珀选择密码子的编码目标蛋白质的核酸。
[0050] 还可在宿主细胞内实施产生含有8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的突变蛋白 质的方法。在这些情况中，提供的宿主细胞包含本发明的8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统（即， 包含编码本发明的0-RS的核苷酸序列、Ο-tRNA序列和含有至少一个选择密码子的编码目 标蛋白质的核酸），而在适宜的培养条件下（例如，在培养基中添加8-羟基喹啉丙氨酸或其 结构类似物等）培养该宿主细胞可导致在所述目标蛋白质中定点特异性插入8-羟基喹啉 丙氨酸或其结构类似物。在一些实施方式中，提供步骤包括提供真细菌宿主细胞（例如，大 肠杆菌）。
[0051] 本发明还提供生产含有8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的荧光蛋白突变体的 方法，其利用上述产生在至少一个所选位置定点特异性插入8-羟基喹啉丙氨酸或其结构 类似物的突变蛋白质的方法，其中所用的编码荧光蛋白突变体的核酸序列在适当的位置包 含所述正交tRNA特异性识别的选择密码子，在荧光蛋白的翻译期间，8-羟基喹啉丙氨酸或 其结构类似物定点插入到所述选择密码子对应的氨基酸位置，从而产生含有8-羟基喹啉 丙氨酸或其结构类似物的荧光蛋白突变体。
[0052] 优选地，本发明还提供生产含有8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的绿色荧光 蛋白突变体的方法，所述方法利用上述8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统进行，所述方法通常包 括下述步骤：
[0053] (a)提供含有以下组分的8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统的步骤：
[0054] (i) 8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物；
[0055] (ii)正交氨酰基-tRNA合成酶（0-RS);
[0056] (iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID N0 :1所示的多核苷酸序列，其中所述 0-RS用所述8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物优先氨酰化所述Ο-tRNA ;和
[0057] (iv)编码所述绿色荧光蛋白的核酸，例如，但不限于，SEQ ID N0 :6,其中所述核酸 含有所述Ο-tRNA特异性识别的至少一个选择密码子（任选地为琥珀密码子）；
[0058] (b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及 编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入8-羟 基喹啉丙氨酸或其结构类似物，在所述目标蛋白质（即绿色荧光蛋白）的翻译过程中，8-羟 基喹啉丙氨酸或其结构类似物氨酰化的正交RNA识别编码绿色荧光蛋白的mRNA上的选择 密码子以及8-羟基喹啉丙氨酸，从而介导8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物定点插入所 述目标蛋白质的特定位置（即，所述选择密码子对应的氨基酸位置）。
[0059] 其中，术语"8-羟基喹啉丙氨酸的结构类似物"是指选自8-羟基喹啉丙氨酸的盐 或酯、对羟基苯基丙氨酸或对羟基苯基丙氨酸的盐或酯的化合物。
[0060] 本发明还提供利用本发明的8-羟基喹啉丙氨酸翻译系统产生的含有8-羟基喹 啉丙氨酸或其结构类似物的荧光蛋白突变体，所述荧光蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO :7。
[0061] 另外，本发明人进一步研究了在氨基酸序列中引入了 8-羟基喹啉丙氨酸或 其结构类似物的蛋白突变体的应用，研究结果发现，超容易折叠绿色荧光蛋白突变体 sfGFP-151-HqAla具有很强的铜离子结合能力，对铜离子的亲和力为0. lfM，可以用于螯合 去除铜离子；并且sfGFP-66-HqAla还在N末端和C末端分别加入一段六肽的接头GGTGGS 后形成的突变蛋白cpsfGFP-66-HqAla可以作为特异性锌离子传感器。
[0062] 本发明还涉及一种通过遗传编码包含8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的突变 蛋白质来拓展蛋白功能的方法，所述方法包括：利用本发明所述的8-羟基喹啉丙氨酸翻译 系统或所述的产生在至少一个所选位置定点特异性插入8-羟基喹啉丙氨酸的突变蛋白质 的方法来生产包含8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的突变蛋白质，所产生的突变蛋白 质具有螯合金属离子的能力，并且能够作为特异性金属离子传感器。
[0063] 最后，本发明人经过筛选，还获得了 一种能够催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙 氨酸的酪氨酸酚裂解酶（简写为TPL)突变体，其氨基酸序列为：
[0064] (l)SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列，或
[0065] (2)将SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添 加且具有与SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列相同的催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨 酸的酶活性的由SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0066] 优选地，所述酪氨酸酚裂解酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0 :5。分子模型表 明，与野生型酪氨酸酚裂解酶（氨基酸序列为SEQ ID N0:11)相比较，该突变体的288位和 448位氨基酸分别突变为丝氨酸和半胱氨酸后显著地扩大了酶口袋，使酶和底物可以更好 地作用，从而高效地催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸。酶催化反应液经过HPLC纯 化后产率可达到40%，最终获得较高产量的8-羟基喹啉丙氨酸。
[0067] 此外，本领域技术人员应该理解，在本发明中，术语"能够催化8-羟基喹啉生成 8-羟基喹啉丙氨酸的酪氨酸酚裂解酶突变体"不仅包括SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列， 还包括SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列的功能片段或功能衍生物，S卩，所述功能片段保留催 化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸的酶活性，所述功能衍生物是指将SEQ ID NO :5所 示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO :5所示的 氨基酸序列相同的催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸的酶活性的由SEQ ID NO :5所 示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0068] 本发明还涉及编码所述酪氨酸酚裂解酶突变体的核苷酸序列。
[0069] 本发明还涉及一种制备8-羟基喹啉丙氨酸的方法，所述方法包括用上述酪氨酸 酚裂解酶突变体催化8-羟基喹啉，生成所述的8-羟基喹啉丙氨酸。
[0070] 综上所述，本发明提供下述：
[0071] 1. 一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID N0 :4所示 氨基酸序列和SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具 有与SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列相同的酶活性。
[0072] 2. -种翻译系统，所述系统包含：
[0073] (i) 8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物；
[0074] (ii)第1项所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；
[0075] (iii)正交tRNA，其包含SEQ ID N0 :1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰 基-tRNA合成酶用所述8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物优先氨酰化所述正交tRNA ;和
[0076] (iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至 少一个选择密码子，
[0077] 其中所述8-羟基喹啉丙氨酸的结构类似物选自8-羟基喹啉丙氨酸的盐或酯、对 羟基苯基丙氨酸或对羟基苯基丙氨酸的盐或酯。
[0078] 3.如第2项所述的翻译系统，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，所 述选择密码子是琥拍密码子。
[0079] 4.如第2项所述的翻译系统，其中所述翻译系统还包含编码正交氨酰基-tRNA合 成酶的核苷酸序列。
[0080] 5. -种宿主细胞，其包含编码第1项所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序 列和相对应的正交tRNA序列，其中所述宿主细胞是真细菌细胞，优选大肠杆菌细胞。
[0081] 6. -种产生在至少一个所选位置定点特异性插入8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类 似物的突变蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：
[0082] (a)提供第2项所述的翻译系统，该系统包含：
[0083] (i) 8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物；
[0084] (ii)第1项所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；
[0085] (iii)正交tRNA，其包含SEQ ID N0 :1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰 基-tRNA合成酶用所述8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物优先氨酰化所述正交tRNA ;和
[0086] (iv)编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸在所选的位置包含所述正交 tRNA特异性识别的至少一个选择密码子；和
[0087] (b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及 编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入8-羟 基喹啉丙氨酸或其结构类似物，在所述目标蛋白质的翻译期间，8-羟基喹啉丙氨酸或其结 构类似物氨酰化的正交tRNA识别编码所述目标蛋白质的mRNA上的选择密码子以及8-羟 基喹啉丙氨酸，从而介导8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物定点特异性插入所述选择密 码子对应的氨基酸位置，从而产生在所选位置含8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的所 述目标蛋白质，
[0088] 其中所述8-羟基喹啉丙氨酸的结构类似物选自8-羟基喹啉丙氨酸的盐或酯、对 羟基苯基丙氨酸或对羟基苯基丙氨酸的盐或酯。
[0089] 7. -种通过遗传编码包含8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的突变蛋白质来拓 展蛋白功能的方法，所述方法包括：利用第6项所述的方法生产包含8-羟基喹啉丙氨酸或 其结构类似物的突变蛋白质，所产生的突变蛋白质具有螯合金属离子的能力，并且能够作 为特异性金属离子传感器。
[0090] 8. -种酪氨酸酚裂解酶突变体，所述酪氨酸酚裂解酶突变体催化8-羟基喹啉生 成8-羟基喹啉丙氨酸，其氨基酸序列为：
[0091] (l)SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列，或
[0092] (2)将SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添 加且具有与SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列相同的催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨 酸的酶活性的由SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0093] 9.编码第8项的酪氨酸酚裂解酶突变体的核苷酸序列。
[0094] 10. -种制备8-羟基喹啉丙氨酸的方法，所述方法包括用第8项的酪氨酸酚裂解 酶突变体催化8-羟基喹啉，生成所述的8-羟基喹啉丙氨酸。
[0095] 3、有益效果
[0096] 本发明旨在通过遗传编码螯合金属离子的非天然氨基酸来拓展蛋白功能，其中螯 合金属离子的非天然氨基酸优选为8-羟基喹啉丙氨酸，目标蛋白优选为荧光蛋白。通过 在超容易折叠绿色荧光蛋白sfGFP，超容易折叠黄色荧光蛋白sfYFP，光转换单体橙色荧光 蛋白PsmOrange和深红色突光蛋白eqFP650中定点特异地插入8-轻基喹啉丙氨酸后，这 几种突变蛋白的激发/发射波长均出现了不同程度的移动，发射波长均红移30nm左右，尤 其是eqFP650突变体，激发和发射波长分别为622和680nm，这是迄今为止报道的类似绿色 荧光蛋白中远红外区的最大发射波长。这些蛋白突变体均能作为体内成像研究的标记物， 增加探测的灵敏度，进行深层组织成像或者作为荧光能量共振转移传感器。同时，本发明 中的sfGFP-151-HqAla突变体（即，将野生型绿色荧光蛋白sfGFP第151位的氨基酸突变 为8-羟基喹啉丙氨酸（HqAla))相比于GFP-151_pyTyr( S卩，将野生型绿色荧光蛋白GFP 第151位的氨基酸突变为吡唑酪氨酸（pyTyr)，参见申请号为201210285659. 7,发明名称 为"3-吡唑基酪氨酸翻译系统及其应用"的专利申请）拥有更强的铜离子结合能力，其对 铜离子的亲和力是GFP-151-pyTyr的九百万倍，证明8-轻基喹啉丙氨酸比3-批唑酪氨酸 更适宜做光诱导电子传递探针从而研究蛋白中的电子传递。通过进一步的遗传进化，突变 体cpsfGFP-66-HqAla还可以作为锌离子传感器，而锌离子在细胞中发挥着至关重要的作 用，敏感特异的锌离子感应器使得我们能够更深入地研究各种调控机理，如酶催化反应，细 胞代谢，基因表达和神经传递等。
[0097] 另外，由于野生型酪氨酸酚裂解酶无法催化生成8-羟基喹啉丙氨酸，我们通过进 化酪氨酸酚裂解酶（TPL)，使其可以直接催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸，得到一 种酪氨酸酚裂解酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO :5,使用该酪氨酸酚裂解酶突变体只 需一步反应就可以达到40 %的产率，最终能够较容易地获得大量定点插入8-羟基喹啉丙 氨酸的突变蛋白质。与传统的化学法合成相比，该种微生物酶法生物合成非天然氨基酸具 有工艺简单、产量稳定等优点，同时，避免了化学合成过程中所涉及到的重金属催化，致癌 溶剂及强酸强碱，并且不需要经过后续复杂的过柱纯化步骤就能够得到大量的目标产物。
【专利附图】
【附图说明】
[0098] 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
[0099] 图1是TPL突变体（SEQ ID NO :5)催化合成8-羟基喹啉丙氨酸的反应式；
[0100] 图2是薄层层析法筛选TPL突变体；
[0101] 图3是HqAla的HPLC纯化图谱；
[0102] 图4是HqAla的质谱图；
[0103] 图5是正交tRNA、野生型酪氨酰tRNA合成酶、本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶、 酪氨酸酚裂解酶（TPL)突变体、荧光蛋白突变体的序列；
[0104] 图 6 是 sfGFP-66-HqAla 的 SDS-PAGE 电泳图；
[0105] 图 7 是 sfGFP-66-HqAla 的质谱图；
[0106] 图8是sfGFP-66-HqAla的高分辨率晶体结构图；
[0107] 图 9 :图 9A 是 sfGFP-66-HqAla， sfYFP-66-HqAla， PsmOrange-72-HqAla 和 eqFP650-67_HqAla 的吸收和发射光谱图；图 9B 是野生型 sfGFP，sfYFP，PsmOrange，eqFP650 和突变体 sfGFP-66-HqAla，sfYFP-66-HqAla，Psm0range-72_HqAla 和 eqFP650-67_HqAla 的 发色团化学结构示意图；
[0108] 图10 :图10A是ΙμΜ cpsfGFP-66-HqAla加入不同金属离子后的荧光强度；图10B 是表达cpsfGFP-66-HqAla的大肠杆菌细胞分别在加入锌离子前（左上图是共聚焦荧光图， 右上图是可见光图）和加入锌离子后（左下图是共聚焦荧光图，右下图是可见光图）的荧 光成像图；图10C是sfGFP-66-HqAla的结构图；图10D是cpsfGFP-66-HqAla的结构图。
【具体实施方式】
[0109] 以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明 的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
[0110] 本领域技术人员应该理解，除非特别说明，下述实施例中所用的化学试剂均为可 通过商业途径购得的分析纯级别的试剂。
[0111] 实施例1 :8_羟基喹啉丙氨酸（HqAla)的生物催化合成（图1-图4)
[0112] 本发明采用生物酶催化的方法，利用从弗氏柠檬酸细菌（ATCC8090,购自美国典型 培养物保藏中心（ATCC))中克隆出的酪氨酸酚裂解酶（TPL)催化8-羟基喹啉合成8-羟基 喹啉丙氨酸，催化反应式见图1。
[0113] 但是实验结果表明，野生型酪氨酸酚裂解酶（TPL，氨基酸序列为SEQID NO :11)无 法催化生成8-羟基喹啉丙氨酸。因此，本发明人分析了 TPL的晶体结构图，挑选出448位 苯丙氨酸、36位苯丙氨酸和288位甲硫氨酸，引入NNK突变（N = A+T+C+G ;K = T+G)，构建 成pEt-TPL突变库来进行TPL的定向进化。从突变库挑选出1024个单克隆，用96孔板培 养过夜后，加入溶菌酶裂解细胞，然后加入8-羟基喹啉、氯化铵和丙酮酸钠，37°C孵育4h， 用茚三酮薄层色谱法检测氨基酸的形成。结果表明（图2)，其中一个克隆成功地催化形成 了 8-羟基喹啉丙氨酸。测序结果显示，该酪氨酸酚裂解酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO :5,与野生型TPL(氨基酸序列为SEQ ID NO :11)相比，该突变体的288位由甲硫氨酸突 变成了丝氨酸，448位由苯丙氨酸突变为了半胱氨酸。使用该酪氨酸酚裂解酶突变体只需一 步反应就可以达到40 %的产率，最终能够较容易地获得大量定点插入8-羟基喹啉丙氨酸 的突变蛋白质。
[0114] 我们将筛选得到的TPL突变体进行放大培养，然后收菌，离心，超声破碎，采用镍 柱纯化，得到突变蛋白酶。取30mM乙酸铵、20mM8-羟基喹啉（购自北京百灵威公司）、60mM 丙酮酸钠、5禮巯基乙醇、5〇1^磷酸吡哆醛和1〇1^突变蛋白酶，定容至11^，？!18.0，然后室 温避光搅拌7天。收集水相，通过HPLC分离纯化得到白色粉末（图3)，产率40%。产物经 过质谱检测，发现其分子量为23?a (图4)，与理论分子量23?a吻合。
[0115] 以上合成反应所需化学试剂如无特别说明，均购自Sigma公司，均为分析纯以上 级别。
[0116] 另外，本领域技术人员应该理解，在本发明中，术语"能够催化8-羟基喹啉生成 8-羟基喹啉丙氨酸的酪氨酸酚裂解酶突变体"不仅包括SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列， 还包括SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列的功能片段或功能衍生物，S卩，所述功能片段保留催 化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸的酶活性，所述功能衍生物是将SEQ ID N0 :5所示 的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0 :5所示的氨 基酸序列相同的催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸的酶活性的由SEQ ID N0 :5所示 的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0117] 实施例2 :进化HqAla特异性氨酰基-tRNA合成酶
[0118] 为了在基因中位点特异性插入HqAla，需要在所用的E. coli宿主细胞中引入 氨酰基-tRNA合成酶/tRNA正交对，这个正交对来源于詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschi i)琥珀抑制酪氨酰tRNA (MjtRNAeuATylr) /酪氨酰tRNA合成酶（MjTyrRS，野生型，其 氨基酸序列为SEQ ID NO :2)对。MjTyrRS突变库构建在卡纳霉素抗性pBK质粒（购自美国 scripps研究所Peter G. Schultz实验室）中，位于该质粒上E. coli谷氨酰胺合成酶的启 动子和终止子之间。所使用的合成酶突变库为pBk-lib-jwl库，该突变库的构建方法为：在 皿奵7冰5基因上挑选6个位点〇>132，1^1165，？1^108,611110948口158，和1^11162)引入剛1( 突变（N = A+T+C+G ;K = T+G)，另外 6个位点（Ile63，Ala67，His70，Tyrll4，Ilel59，Vall64) 或随机突变为 Gly 或保持不变（SMXie，J.;Liu，W.S.;Schultz，P.G.Angew.Chem.，Int. Ed. 2007,46,9239-9242 ；ffang, JY. ；Zhang ff. ；Song WJ ；et al. J. Am. Chem. Soc. 2010,132, 14812-14818)。
[0119] 通过正负筛选来进化特异性识别HqAla的氨酰基-tRNA合成酶。正筛选质粒包 含MjtRNA euATylr，TAG突变的氯霉素乙酰转移酶基因，启动表达绿色荧光蛋白的琥珀突变的 T7RNA聚合酶，四环素抗性基因。负筛选质粒包含MjtRNA^'在阿拉伯糖操纵子下的琥珀 突变芽孢杆菌RNA酶基因，以及氨苄青霉素抗性基因。进行3轮正负筛选：包含有正筛选质 粒的E.coli DH10B细胞作为正筛选寄主细胞。细胞电转pbk-lib-jwl库，S0C培养基（2% (评八）胰蛋白胨，0.5%(^)酵母粉，0.05%(^)恥(：1，2.511111((：1，1011111%(：12,201111葡 萄糖）在37°C培养1小时。之后换用极限培养基（GMML极限培养基的配方：M9盐/甘油： 764g Na2HP04.7H20或者30g Na2HP04，15g KH2P04,2.5g NaCl，5g NH4Cl，50ml甘油，高压灭菌， pH7. 0 ;1M MgS04 :高压灭菌；50mM CaCl2 :高压灭菌；25mM FeCl2 :过滤灭菌；0. 3M亮氨酸： 溶解于0. 3M NaOH中，过滤灭菌；1L液体GMML培养基：200ml M9盐/甘油，2ml MgS04, 2ml CaCl2,2ml FeCl2, lml亮氨酸）洗两次，铺板固体极限培养基（在液体GMML培养基中加入 500ml3%琼脂粉，ImM HqAla，50mg/L卡那霉素，60mg/L氯霉素，15mg/L四环素），37°C培养 60小时。收取细胞，提取质粒DNA，电泳分离，胶回收。然后，将经过正筛选的pBK-lib-jwl 转化到包含负筛选质粒的DH10B感受态细胞中。SOC培养基中恢复1小时。之后涂板包含 0· 2%阿拉伯糖（购自sigma公司）的LB固体培养基（每升培养基含10g胰蛋白胨，5g酵 母粉，lOgNaCl)。37°C培养8-12小时。共重复3轮。
[0120] 最后一轮正筛选挑384个克隆，分别点板在含有ImM HqAla、氯霉素60,80，100， 120mg/L的GMML固体培养基上，及不包含HqAla、但包含氯霉素0, 20,40,60mg/L的GMML固 体培养基。挑选在在ImM HqAlal00mg/L氯霉素的培养基上生长，而在OmM F2Y，浓度大于 20 μ g/mL氯霉素培养基中不生长的克隆进行进一步验证。最终挑出1个克隆，插入8-羟 基喹啉丙氨酸效率最高，测序表明，克隆所包含的氨酰基-tRNA合成酶突变体（HqAlaRS)的 氨基酸序列为SEQ ID N0 :4所示，其中突变位点为Y32H，153V，L65H，H70G，F108R，Q109V， D158N，L162D 和 V164G。
[0121] 本领域技术人员应该理解，在本发明中，除了 SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列之 夕卜，术语"正交氨酰基-tRNA合成酶"或"正交8-羟基喹啉丙氨酸氨酰基-tRNA合成酶"还 包括SEQ ID N0 :4所示氨基酸序列的保守性变体，只要所述保守性变体具有与SEQ ID N0: 4所示的氨基酸序列相同的酶活性即可；并且还包括将SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列经 过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列相同的 酶活性的由SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0122] 实施例3 :表达HqAla-绿色荧光蛋白及质谱鉴定
[0123] 将正交tRNA (SEQ ID NO: 1)和筛选出来的编码HqAlaRS的核苷酸序列（SEQ ID NO :3)构建到pEVOL载体（购自美国scripps研究所Peter G. Schultz实验室）上，编码 超容易折叠绿色荧光蛋白的核苷酸序列（66TAG) (SEQ ID NO :6)构建到pET22b载体（购自 Novagen公司）上，然后共转化到大肠杆菌BL21感态细胞（购自全式金公司）中。挑取单 个克隆在至含有50 μ g/mL氨苄霉素和30 μ g/mL氯霉素的5ml LB培养基中，37 °C培养12 小时。然后将lml以上培养液在含有以上抗生素的100ml LB培养基中扩大培养，到0D_ 约等于1.1时，向1^培养基中加入1禮取41&，1!1111?了6及0.2%阿拉伯糖（购自8丨8111 &公 司）培养细胞，对照不加入HqAla。12小时之后，收菌，Ni-NTA纯化蛋白，并用SDS-PAGE电 泳分析（图6)。
[0124] 我们发现，只有在存在HqAla的培养基中才能纯化出全长的超折叠绿色荧光蛋 白，这说明筛选出来的HqAlaRS可以特异性的识别HqAla。在LB培养基中HqAla-超折叠绿 色荧光蛋白的产率为20mg/L，而野生型蛋白的产率为100mg/L。为了检测HqAla仅仅插入 到超折叠绿色荧光蛋白的66位琥珀突变位点，我们对sfGFP-66-HqAla进行了 ESI-T0F质 谱检测，检测结果分子量为27342Da (图7)，与计算的分子量27342Da吻合。
[0125] 突变蛋白质sfGFP-66-HqAla的激发和发射波长分别为537和544nm，相比野生型 sfGFP产生了约30nm的红移，我们解析了 sfGFP-66-HqAla的晶体结构（图8)，发现HqAla 参与了 sfGFP蛋白中发色团的形成，且HqAla的喹啉环和发色团中的咪唑啉酮环基本共平 面，这为突变蛋白质的红移现象提供了结构基础。
[0126] 实施例4 :表达HqAla-荧光蛋白突变体进行激发/发射光谱研究
[0127] 我们用基因工程方法构建了超容易折叠黄色荧光蛋白sfYFP(SEQ ID NO :8)，光转 换单体橙色荧光蛋白PsmOrange(SEQ ID N0:9)和深红色荧光蛋白eqFP650(SEQ ID N0:10) 突变体，然后用实施例3中的相同方法在荧光蛋白突变体的特定定点特异性插入HqAla，表 达产生突变蛋白 sfYFP-66-HqAla，Psm0range-72_HqAla 和 eqFP650-67_HqAla，然后分别测 量了这些突变蛋白的激发/发射光谱，结果如图9所示，定点特异地插入8-羟基喹啉丙氨 酸后导致这几种突变蛋白的发射波长均红移30nm左右，尤其是eqFP650突变体，激发和发 射波长分别为622和680nm，这是迄今为止报道的类绿色荧光蛋白中远红外区的最大发射 波长。
[0128] 实施例5 :表达HqAla-绿色荧光蛋白进行铜离子亲和力测定
[0129] 我们用与实施例3相同的方法表达产生了突变蛋白sfGFP-151-HqAla并测定了 其铜离子结合能力。在60mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液中加入ΙμΜ sfGFP-151-HqAla和 ΙμΜ Cu(II)，对照不加入Cu(II)，然后进行荧光强度测定。结果显示加入ΙμΜ Cu(II) 可导致65 %的荧光淬灭，表明8-羟基喹啉丙氨酸和3-吡唑酪氨酸（参见申请号为 201210285659. 7,发明名称为"3-吡唑基酪氨酸翻译系统及其应用"的专利申请）结合铜 离子后均可作为电子受体，与作为电子供体的GFP发色基团产生光诱导电子传递从而导致 荧光淬灭。但是sfGFP-151-HqAla拥有更强的铜离子结合能力，其对铜离子的亲和力为 0· lfM，是 GFP-151-pyTyr 的九百万倍。
[0130] 实施例6 :表达HqAla-绿色荧光蛋白突变体作为锌离子传感器
[0131] 为了验证sfGFP定点插入HqAla后是否可以作为锌离子传感器，我们在60mM Tris-HCl，pH7. 0缓冲液中加入2 μ Μ sfGFP-66-HqAla和100 μ Μ氯化锌，但是没有检测到 任何荧光信号变化。于是，我们将sfGFP-66-HqAla进行进一步的改造，在蛋白的Ν末端和C 末端分别加入一段六肽的接头GGTGGS，形成突变蛋白cpsfGFP-66-HqAla (图10C，图10D)， 然后再加入氯化锌，发现荧光信号增强了 7. 2倍。接着，我们检测了 cpsfGFP-66-HqAla结合 其他金属离子的能力，往突变蛋白中分别加入1〇〇μ Μ的Cu(II)，Fe(II)，Co(II)和Ni (II) 等多种金属离子，结果如图l〇A所示，除了锌离子，其他金属离子均没有显著增加突变蛋白 的荧光强度，证明cpsfGFP-66-HqAla可以作为特异性锌离子传感器。
[0132] 为了检测cpsfGFP-66-HqAla在活细胞内是否也可以作为锌离子传感器，我们 将cpsfGFP-66-HqAla和pEOV-HqAlaRS质粒共转化到大肠杆菌细胞内，在含有50 μ g/ mL氨苄霉素和30 μ g/mL氯霉素的培养基中，37 °C培养到0D_约等于1. 1时，向LB培养 基中加入0. 5mM HqAla，lmM IPTG及0. 2%阿拉伯糖，继续培养12小时之后，收菌，加入 100 μ Μ Zn(II)，同时以不加入Zn(II)的菌液作为对照，在荧光显微镜下观察，发现没有 加入Zn(II)的细胞荧光强度很弱，而加入Zn(II)后，荧光强度显著增强（图10B)，证明 cpsfGFP-66-HqAla在活细胞内也可有效地结合锌离子。
[0133] 应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述， 但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求所定义的本发明的精神和范围 的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
[0001] IB130369序列表，txt 序列表 <11〇)中国科学院生物物理研究所 <120〉8-羟苺晗咐丙氨酸翻译系统及其应用 <130> IB130369 <160^ 11 <170> Patentln version 3. 1 <210> 1 <211> 77 <212> DNA <213〉正交 tRNA <400> 1 tggtccggcg ggccggattt gaaccagcgc catgcggatt tagagtccgc cgttctgccc 60 tgctgaacta ccgccgg 77 <210> 2 <211〉 312 <212> PRT <213〉野土型酪氨酰tRNA合成酶（MjTyrRS)，来源于詹氏甲烷球菌 <400> 2 Met Asp Glu Phe Clu Met lie Lvs Arg Asn Thr Ser Glu lie Tie Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lvs Ser Ala Tyr 20 25 30 lie Glv Phe Glu Pro Ser Glv Lvs lie His Leu Glv His Tvr Leu Gin 35 40 45 lie Lvs Lvs Met lie Asp Leu Glu Asn Ala Gly Phe Asp lie lie lie 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lvs Glv Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu lie Arg Lvs lie Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95
[0002] IB130369序列表.txt GIy Leu Lys Ala Lys Tvr ￥al Tyr Glv Ser Glu Phe Gin Leu Asp Lvs 100 105 110 Asp Tyr Thr Lou Asn Val Tvr Arg Lou A]a Leu Lvs Thr Thr Leu Lys 115 120 ' 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu lie Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lvs Val Ala Glu Val Ilo Tvr Pro Ilo Mot Gin Val Asn Asp lie His 145 150 155 160 Γτγ Leu Gly Val Asp Val Ala Val G1t Glv Met Glu Gin Arg Lvs lie ' 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys lie His 180 185 ' ' 190 Asn Pro Val Leu Thr Glv Leu Asp Glv Glu Glv Lvs Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lvs Glv Asn Phe lie Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu lie Arg Ala 210 215 220 Lts lie L'rs Lys Ala Tvr C\ts Pro Ala Glv Val Val Glu Glv Asn Pro 225 230 235 240 lie Met Glu lie A_La Lvs Tvr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr lie Lvs 245 ' 250 255 Arg Pro Glu Lts Phe Glv Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 ' 280 285 ' Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu lie Lys lie Leu Glu Pro lie Arg Lvs 290 295 300 Arg Leu His His His His His His 305 310 <210> 3 <211> 921 <212> DNA <213>本发明的正交氨酰基HRNA合成酶（HijAlaRS) <400 3 atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60 agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gctcatatag gttttgaacc aagtggtaaa 120 atacacttag ggeattatet ccaaataaaa aagatggttg atttacaaaa tgctggattt 180 gatataatta tacatttggc tgatttaggt goctatttaa accagaaagg agagttggat 240 gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300
[0003] IB130369序列表.txt aaatatgttt atggaagtga acgtgttctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaaotacctt aaaaagagca agaaggagta iggaacttat agcaagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa taatattcat 480 ta.tgatggcg gtgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaaraca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagattata a 921 <210> 4 <211> 306 <212> PRT 〈213〉本发明的正交氨酰棊-tRNA合成酶tHqALaRS) <400> 4 Met Asp Glu Phe Glu Met lie Lys Arg Asn Thr Ser Glu lie lie Ser 1 5 ^ 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lvs Lys Asp Glu Lvs Ser Ala His 20 25 ^ 30 lie Gly Phe Glu Pro Ser Glv Lys lie His Leu Gly His T^r Leu Gin 35 40 45 lie Lys Lys Met Val Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp Ele lie lie 50 55 60 His Leu Ala Asp Leu Glv Ala Tvr Leu Asn Gin L) ts Glv Glu Leu Asp 65 70 75 ' 80 Glu 丄丄e Arg hys i_Le G_Lv Asp IVr Asn Lys Lvs Val Phe Glu Ala Met ^ 85 ' ' 90 ' 95 Gly Leu Lvs Ala Lvs Tvr Val Tvr Glv Ser Glu Arg Val Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tvr Thr Leu Asn Val Tvr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu lie Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val lie Tvr Pro lie Met G丄n Val Asn Asn lie His ]45 150 155 160
[0004] IB130369序列表.txt Τυγ Asp G1y Glv Asp Val Ala Val G1y G1y Met Glu Gin Arg Lys He 165 170 175 His Met Leti Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lvs Val Val Cvs Tie His 180 185 ' 190 Asn Fro Val Leu Thr G1y Lcu Avsp Glv Glu Glv Lys Met Ser Ser Ser 195 200 ' 205 Lvs Glv Asn Phe lie Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu lie Arg Ala ' 210 215 220 Lvs lie Lvs Lvs Ala Tvr Cvs Pro Ala Gly Val Val Glu Glv Asn Pro 225 ' 230 235 ' 240 lie Met Glu lie Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tvr Pro Leu Thr lie Lvs 245 250 255 Arg Pro Glu Lvs Phe Glv Glv Asp Leu Thr Val Asn Ser Tvr Glu Glu 260 ' ' 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lvs Asn Lvs Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lvs 275 ' 280 285 ' Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu lie Lys lie Leu Glu Pro lie Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 5 <211> 456 <212> PRT <213>酪氨酸酚裂解酶(TPL)突变体 (400> 5 Met Asn Tyr Pro Ala Glu Pro Pile Arg lie Lys Ser Val Glu Thr Yal 15 10 15 Ser Met 丄丄e Pro Arg Asp G丄u Arg Leu Lys Lys Met Gin G丄u A_La Gly 20 25 30 Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Asn Ser Lvs Asp lie Tvr lie Asp Leu Leu 35 40 45 Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gin Trp Ala Glr Met 50 55 60 ' Met Met Glv Asp Glu Ala Tvr Ala Glv Ser Glu Asn Phe Tvr His Leu 65 70 75 80 Glu Arg Thr Val Gin Glu Leu Phe Gly Phe Lvs His lie Val Pro Thr 85 90 95
[0005] IB130369序列表.txt His Gin Gly Arg Gly Ala Glu Asn Leu Leu Ser Gin Leu Ala lie Lvs 100 ' 105 110 ' Pro G1 v (iln Tyr Val Ala Glv Asn Met Tvr Phe Thr Thr Thr Arg Tvr 115 120 ' 125 ' His Gin Glu Lys Asn Glv Ala Val Phe \al Asp lie Val Arg Asp Glu 130 135 140 Ala His Asp Ala Glv Leu Asn lie Ala Phe Lvs Gly Asp lie Asp Leu 145 150 155 ' 160 Lvs Lvs Leu Gin Lvs Leu lie Asp Glu Lvs Glv Ala Glu Asn lie Ala ' ' 165 170 ' 175 Tvr lie Cvs Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Glv Gin Pro Val ' 180 185 ' 190 Ser Met Ala Asn Met Arg Ala Val Arg Glu Leu Thr Glu Ala His Gly 195 200 205 lie Lvs Val Phe Tvr Asp Ala Thr Arg Cvs Val Glu Asn Ala Tvr Phe 210 ' 215 ' 220 ' lie Lys Glu Gin Glu Gin Gly Phe Glu Asn Lvs Ser lie Ala Glu lie 225 230 235 240 Val His Glu Met Phe Ser Tvr Ala Asp Gly Cvs Thr Met Ser Gly Lys 245 ' 250 255 Lys Asp Cys Leu Val Asn lie Gly Glv Phe Leu Cvs Met Asn Asp Asp ' ' 260 265 ' 270 Glu Met Phe Ser Ser Ala Lys Glu Leu Val Val Val Tyr Glu Gly Ser 275 ' 280 285 ' Pro Ser Tyr Gly Gly Leu ALa Glv Arg Asp Met Glu Ala Met A La Ele 290 295 300 Gly Leu Arg Glu Ala Met Gin Tyr Glu T' rr lie Glu His Arg Val Lys 305 310 315 320 G_Ln Va_L Arg Γν? 1 Leu Glv Asp Lvs Leu Lys A_La A丄a Giv Val Rro lie ' 325 330 ' 335 Val Glu Pro Val G1y Glv His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Aig Phe 340 345 350 Cvs Glu His Leu Thr Gin Asp Glu Phe Pro Ala Gin Ser Leu Ala Ala ' 355 360 365 Ser lie Tvr Val Glu Thr Glv Val Arg Ser Met Glu Arg Glv lie lie 370 375 380 ' Ser Ala Glv Arg Asn Asn \al Thr Gly Glu His His Arg Pro Lys Leu 385 390 395 400
[0006] IB130369序列表.txt &lu Thr Val Arg Leu Thr II? Pro Arg Arg Val Tvr Thr Tvr Ala His 405 410 415 Met Asp Val Viil Ala Asp Glv Tic lie Lys Leu Tvr Gin His Lys Glu 420 425 430 Asp lie Arg Glv Leu Lvs Phe lie Tyr Glu Pro Lys Gin Leu Arg Cvs 435 440 445 Phc Thr Ala Arg Phe Asp Tvr lie 450 4^5 <210^ 6 <2il> 726 <2125 DM <213> g?有β6位8-羟基喹啉両氨酸的绿色荧光蛋白突变体（sfGFP-66- HqAla) <400> 6 atgtccaagg gegaagaget cttcaccgga gttgttccaa tcctcgtaga actggacggt 60 gatgttaacg gccacaaatt ttctgtgcgt ggtgagggcg aaggtgacgc taccaacggc 丄20 aaactgactc tgaaatttat ctgcaccacc ggcaaactgc cggttccgtg gccgaccctg 180 gtaactaccc teaettaggg tgtccagtgc ttctctcgtt accccgacca catgaaacgt 240 cacgacttct tcaaaagcgc tatgeeggag ggttacgttc aggaacgtac gattagette 300 anggatgarg gtacrtaraa aactrgtgrg gaagttaaat trgagggaga carrctggtg 360 aaccgtaccg aactgaaagg tattgac ttc aaggaggatg gcaatatcct gggtcacaag 420 ctggagtata acttcaatag ccacaacgtg tacatcactg ctgataaaca gaaaaacggt 480 atcaaggcta acttcaaaat tcgccacaao gtagaagacg gctccgttca gctggctgac 540 cactaccagc agaacacccc gateggegae ggtccagtac tgctgcctga caaccactat 600 ctgtccacgc agreegttet gtctaaagac ccgaacgaga aaegegatea catggttctg 660 ctggaattcg ttactgctgc tggcatcact cacggtatgg acgaactcga gcaccaccac 720 caccac 726 <210> 7 C2il> 243 C212> PRT χ213> S'有Γ>6位S-羟茧Pf啉両氨酸的绿色荧光蛋白突变体（sfGFP-66- HqAla), 其中*表示引入的8-羟基喹啉丙氨酸， <400> 7 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Glv Val Val Pro lie Leu Val 1 " 5 Ui 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu 20' 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe lie Cys
[0007] IB130369序列表，txt 35 40 45 Thr Thr Gly Lvs Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu 50 ' 55 60 Thr Gly Val Gin Cvs Phe Ser Arg Τυγ Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 '75 ' 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Clu Gly Tyr Val Gin Glu Arg 85 90 95 Thr Tip Ser Pile Τ,γκ Asp Asp G1 v Thr Tyr Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glii Glr Asp Thr Leu Val Asn Arg lie Glu Leu Lvs Gly lie 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn lie Leu Glv His Lvs Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Phe Asn Scr His Asn Val Tyr lie Thr Ala Asp Lys Gin Lys Asn Gly 145 150 155 ' 160 lie Lvs Ala Asn Phe Lvs lie Arg His Asn Yal Glu Asp Glv Ser Val 165 170 175 Gin Leu Ala Asp His Tyr Gin Gin Asn Thr Pro lie Glv Asp Gly Pro 180 ' 185 190 ' Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tvr Leu Ser Thr Gin Ser Val Leu Ser 195 200 205 Lvs Asp Pro Asn Glu Lvs Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Yal 210 ' 215 220 Thr Mu Ala Glv He Thr His Glv MeL Ακρ Glu Leu Glu His His His 225 230 235 240 His His His <210> 8 <211> 246 Q12> PRT <213〉黄色荧光蛋白sfYFP <100> 8 Met Ser Lvs Glv Glu Glu Leu Phe Thr Glv Yal Val Pro lie Leu Val 1 ^ ' 5 10' 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lts Phe Ser Val Arg Gly Glu 20' 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr lie Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe lie Cys
[0008] IB130369序列表，txt 35 40 45 Thr Thr Gly Lvs Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu 50 … 55 60 Glv Tvr Gly Leu Gin Cvs Fhe Ala Arg Trr Pro Asp His Met Lvs Gin 65 70 75 ' 80 His Asp Phe Phe Lvs Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gin Glu Arg 85 90 95 Thr Tie Ser Fhe, T,vs Asp Asp Glv Lys Tyr Lvs Thr Arg Ala VrI Val 100 ^ 105 ' 110 Lvs Phe Glu Glv Asp Thr Leu Val i\sn /Vrg lie Glu Leu Lvs Gly Thr ' 115 ^ 120 125 Asp Phe Lvs Glu Asp Glv Asn lie Leu Glv His Lvs Leu Glu Tvr Asn 130 135 ' 140 Phe Asn Sor His Asn Val Tvr Ilo Thr Ala Asp Lvs Gin Lvs Asn Gly 145 150 155 160 lie Lvs Ala Asn Phe Thr Val krg His Ash Val Glu Asp Glv Ser Val 165 170 175 Gin Leu Ala Asp His Tyr Gin Gin Asn Thr Pro lie Glv Asp Glv Pro 180 ' 185 190 ' Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tvr Leu Ser Tvr Gin Thr Val Leu Ser 195 200 205 Lvs Asp Pro Asn Glu Lvs Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 ' 215 220 Thr Ala Ma Glv He Thr Leu Glv MeL Asp Glu Leu Tvr L\ s Leu Glu 225 230 235 240 His His His His His His 245 <210> 9 <211> 244 <212> PKT <213〉澄色黃光.蛋白PsinOrange <·100> 9 Met Val Ser Lts Gly Glu Glu Asn Asn Met Ala lie lie Lvs Glu Phe 1 5 10 15 Met Arg Phe Lvs Yal Arg Met Glu Gif Thr Val Asn Glv His Glu Phe 20 25 30 Glu He Glu Gly Glu Gly Glu Glj Arg Pro Tyr Glu Gly Phe Gin Thr
[0009] IB130369序列表，txt 3?5 40 45 Ala Lys Leu Lvs Val Thr Lvs Glv G1y Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp 50 55 60 lie Leu Ser Pro Leu Phe Thr Tyr 61y Ser Lvs Ala Ttx^ Yal Lys His 65 70 75 80 Pro Ala Asp lie Pro Asp Tyr Phe Lys Leu Ser Phe Pro Glu Glv Phe 85 ' 90 95^ Lys Trp Glu Arg ￥a.l Met Asn Tvr filn Asp Gly Gly Va.l Yal Thr Va.l ' 100 105 ' 110 Thr Gin Asp Ser Ser Leu Gin Asp (ily Glu Phe lie Tyr Lvs Val Lvs 115 120 125 ' Met Arg Glv Thr Asn Phe Pro Ser Asp G1y Pro Val Met, Gin Lvs Lvs 130 135 ' 140 ' Thr Met Glv Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly 145 ' 150 155 160 Ala Leu Lvs Glv Glu lie Arg Met Arg Leu Lvs Leu Lys Asp Glv Glv 165 170 175 His Tvr Thr Ser Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lvs Ala Lvs Lvs Ser Val ' 180 ' 185 ' 190 Gin Leu Pro G丄v Ala ?>γ lie Val Glv lie Lvs Leu Asp lie Thr Ser 195 ' ' 200 205 His Asn Glu Asp Tvr Thr lie Val Glu Gin Tvr Glu Arg Ala Glu Gly 210 215 220 Arg His Ser Tlir Glv Glv Met lisp Glu Leu Tvr Lvs Leu Glu Ills His 225 230 235 240 His His His His <210> 10 <211> 242 <212> PRT <213>深红色荧光蛋白eqFP650 <400> 10 Met Glv Glu Asp Ser Glu Lett lie Ser Glu Asn Met His Met Lys Leu 1 ' 5 10 15 T^r Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His His Phe Lys Crs Tlir Ser Glu . 20 25 30 Glv Glu Gly Lys Pro Tyr Gly Thr Gin Thr Ala Lys He Lys Val
[0010] IB130369序列表，txt 35 40 45 Val Glu Gly G1y Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp lie Leu Ala Thr Ser 50 ^ ' 55 60 Phe Met Tvv Gly Ser Lvs Thr Phe lie Asn His Thr Gin Gif He Pro 65 ' 70 75 80 Asp Phe Phe Lys Gin Ser Phe Pro Glu Glv Phe Thr Trp Glu Arg lie 85 90' 95 Thr Tin· Tvr Glu Asp Gly Γτ?ν Val Lmi Thr Ala Thr Gin Asp Thr Ser ^ 100 ' 105 110 Leu Gin Asn Glv Cvs Leu lie Tyr Asn Val Lys lie Asn Glv Val Asn 115 ^ ' 120 125 ' Phe Pro Ser Asn Glv Pro Val Met Gin Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu 130 135 ' 140 ' Ala Scr Thr Glu Mot Leu Tyr Pro Ala Asp Ser Gly Leu Arg Gly His 145 150 155 160 Ser Gin Met Ala Leu Lvs Leu Val Gly Glv Gly Tvr Leu His Cys Ser 165 170 1T5 Leu Lvs Thr Thr Tvr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lvs M^t ' 180 185 ' 190 Pro G1t Phe Tvr Phe Val Asp Axg Lvs Leu Glu Arg 1丄e Lvs Glu Ala 195 200 205 Asp Lvs Glu Thr TVr Val Glu Gin His Glu Met Ala Val Ala Arg Tvr 210 215 220 Cvs Asp Leu Pro Ser Lw Leu GL· His Ser Leu Glu His His His 225 230 235 240 His His <210> 11 <211> 456 <212> PRT <213>野生型酪氨酸酚裂解酶 <100> 11 Met Asn TVi· Pro Ala Glu Pro Phe Arg lie Lvs Ser Val Glu rhr Val 1 ' 5 10 15 Ser Met lie Pro Ai'g Asp Glu Arg Leu Lrs Lvs Met Gin Glu Ala G1t 20 25 ' 30 Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Asn Ser Lys Asp lie Tyr lie Asp Leu Leu
[0011] IB130369序列表，txt 35 40 45 Thr Asp Ser G1y Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gin Trp Ala GIt Met 50 ' 55 60 ' Met Met Gly Asp Glu Ala Tvr Ala Gly Ser Glu Asn Phe Tvr His Leu 65 70 75 80 Glu Arg Thr Val Gin Glu Leu Phe Gly Phe Lys His lie Val Pro Thr 85 90 95 His Gin Glv Arg Glv Ala Glu Asn Leu Leu Sev Gin Leu Ala Tie Lvs 100 ' 105 110 ' Pro Glv Gin Tvr Val Ala Glv Asn Met Trr Phe Thr Thr Thr Arg Tvr 115 120 ' 125 ' His Gin Glu Lys Asn Glv Ala Val Pile Val Asp lie Val Arg Asp Glu 130 135 140 Ala His Asp Ala Gly Leu Asn Ilo Ala Pho Lvs Gly Asp lie Asp Leu 145 150 155 ' 160 Lys Lys Leu Gin Lvs Leu lie Asp Glu Lvs Glv Ala Glu Asn lie Ala 165 170 175 Tvr lie Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Glv Glv Gin Pro Val ' 180 185 ' 190 Ser Met Ala Asn Met Arg Ala Val A_rg G丄u Leu Thr G丄u A丄a His GIy 195 200 205 lie Lvs Val Phe Tvr Asp Ala Thr Arg Cys Yal Glu Asn Ala Tvr Phe 210 - 215 ' 220 ' He Lvs Glu Gin Glu Gin Glv Phe Glu Asn Lvs Ser lie Ala Glu He 225 230 235 240 Val His Glu Met Phe Ser Tvr Ala Asp Glv Cvs Thr Met Ser Gly Lvs 245 ' 250 255 Lvs Asp Cvs Leu Yal Asn lie Glv Gly Phe Leu Cys Met Asn Asp Asp 260 265 270 Glu Met Phe Ser Ser Ala Lys Glu Leu Val Val Val Tvr Glu Gly Met 275 ' 280 285 ' Pro Ser Tyr G1y Gly Leu Ala Glj Ai'g Asp Met Glu Ala Met Ala lie 290 ' 295 " 300 Gly Leu Arg Glu Ala Met Gin Tyr Gilt Tvr lie Glu His Arg Val Lvs 305 310 ' ' 315 320 Gin Val Arg Tvr Leu Glv Asp Lvs Leu Lvs Ala Ala Glv Val Pro lie 325 330 335 Val Glu Pro Val Gly Gly His Ala Val Plie Leu Asp Ala Arg Arg Phe
[0012] IB130369序列表.txt 340 345 350 Cvs Glu His Leu Thr Gin Asp Glu Phe Pro Ala Gin Ser Leu Ala Ala ' 355 360 365 Ser lie Tvr Val Glu Thr Glv Yal Arg Ser Met Glu Arg G1y He lie 370 375 380 Ser A La GLv Arg Asn Asn VaL Thr Glv Glu His His Arg Pro Lvs Leu 385 ' 390 ' 395 ' 400 Glu Thr Val Arg Leu Thr lie Pro Arg Arg Val Tvr Thr Tvr Ala His 405 410 ' ' 415 Met Asp Val \al Ala Asp Glv lie lie Lys Leu Tyr Gin His Lvs Glu 420 ' 425 ' 430 Asp lie Arg Glv Leu Lvs Phe lie Tvr Glu Pro Lvs Gin Leu Arg Phe 435 ' 440 ' 445 Phe Thr A La Arg Phe Asp Tvr lie 450 455
【权利要求】
1. 一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO :4所示氨基 酸序列和SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与 SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列相同的酶活性。
2. -种翻译系统，所述系统包含： (i) 8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物； (ii) 权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶； (iii) 正交tRNA，其包含SEQ ID N0:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰 基-tRNA合成酶用所述8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物优先氨酰化所述正交tRNA ;和 (iv) 编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一 个选择密码子， 其中所述8-羟基喹啉丙氨酸的结构类似物选自8-羟基喹啉丙氨酸的盐或酯、对羟基 苯基丙氨酸或对羟基苯基丙氨酸的盐或酯。
3. 如权利要求2所述的翻译系统，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，所 述选择密码子是琥拍密码子。
4. 如权利要求2所述的翻译系统，其中所述翻译系统还包含编码正交氨酰基-tRNA合 成酶的核苷酸序列。
5. -种宿主细胞，其包含编码权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序 列和相对应的正交tRNA序列，其中所述宿主细胞是真细菌细胞，优选大肠杆菌细胞。
6. -种产生在至少一个所选位置定点特异性插入8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物 的突变蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤： (a) 提供权利要求2所述的翻译系统，该系统包含： (i) 8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物； (ii) 权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶； (iii) 正交tRNA，其包含SEQ ID N0:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰 基-tRNA合成酶用所述8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物优先氨酰化所述正交tRNA ;和 (iv) 编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸在所选的位置包含所述正交tRNA特 异性识别的至少一个选择密码子；和 (b) 将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码 所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入8-羟基喹 啉丙氨酸或其结构类似物，在所述目标蛋白质的翻译期间，8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类 似物氨酰化的正交tRNA识别编码所述目标蛋白质的mRNA上的选择密码子以及8-羟基喹 啉丙氨酸，从而介导8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物定点特异性插入所述选择密码子 对应的氨基酸位置，从而产生在所选位置含8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的所述目 标蛋白质， 其中所述8-羟基喹啉丙氨酸的结构类似物选自8-羟基喹啉丙氨酸的盐或酯、对羟基 苯基丙氨酸或对羟基苯基丙氨酸的盐或酯。
7. -种通过遗传编码包含8-羟基喹啉丙氨酸或其结构类似物的突变蛋白质来拓展蛋 白功能的方法，所述方法包括：利用权利要求6所述的方法生产包含8-羟基喹啉丙氨酸或 其结构类似物的突变蛋白质，所产生的突变蛋白质具有螯合金属离子的能力，并且能够作 为特异性金属离子传感器。
8. -种酪氨酸酚裂解酶突变体，所述酪氨酸酚裂解酶突变体催化8-羟基喹啉生成 8-羟基喹啉丙氨酸，其氨基酸序列为： (1) SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列，或 (2) 将SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且 具有与SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列相同的催化8-羟基喹啉生成8-羟基喹啉丙氨酸的 酶活性的由SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
9. 编码权利要求8的酪氨酸酚裂解酶突变体的核苷酸序列。
10. -种制备8-羟基喹啉丙氨酸的方法，所述方法包括用权利要求8的酪氨酸酚裂解 酶突变体催化8-羟基喹啉，生成所述的8-羟基喹啉丙氨酸。
【文档编号】C12R1/19GK104059891SQ201310093794
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月22日 优先权日:2013年3月22日
【发明者】王江云, 刘晓红, 李家松, 胡诚, 周庆, 张维, 胡美荣, 周娟作, 江欢欢 申请人:中国科学院生物物理研究所