纳豆激酶的提纯方法及制备方法

纳豆激酶的提纯方法及制备方法
【专利摘要】本发明涉及纳豆激酶的提纯方法及制备方法，其中，纳豆激酶的提纯方法包括以下步骤：1）提取，2）超过滤，3）葡聚糖凝胶G-50柱层析，4）Amberlite?IRC-50阳离子交换柱层析，5）DEAE-CelluloseDE-52阴离子交换柱层析，6）纳豆激酶酶蛋白结晶。纳豆激酶的提纯方法具有纯化度高及回收率高的优点。
【专利说明】纳豆激酶的提纯方法及制备方法
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及纳豆激酶的提纯方法、纳豆激酶的制备方法。
【【背景技术】】
[0002]纳豆(Natto)是日本传统发酵豆制品，由纳豆菌(Bacillus natto)以大豆为主要培养基成分发酵而成。主要用于心脑血管疾病的预防与控制。1987年，日本学者Sumi等人从纳豆中发现了一种丝氨酸蛋白酶，定名为纳豆激酶(Nattokinase, NK, PhaseolusVulgaris L.)[1]0大量研究表明，纳豆激酶经小肠吸收进入血浆[2]，能显著降低血浆优球蛋白的溶解时间，降低血浆纤维蛋白原的含量，同等剂量的纳豆激酶与尿激酶(Urokinase;UK)相比，前者纤溶性大于后者[3]，而且对血浆纤维蛋白的专一性比UK高，临床上不引起出血。可见，纳豆激酶安全性好，易被人体吸收，溶栓效率高，药效持久，有望开发成新型口服溶栓剂，各地竞相生产，大多采用从固体发酵产物纳豆中制备。
【
【发明内容】
】
[0003]本发明要解决的第一个技术问题是提供一种纳豆激酶的提纯方法，其纯化度高及回收率高。
[0004]本发明要解决的第二个技术问题是提供一种纳豆激酶的制备方法，其获得纯度较高的纳豆激酶。
[0005]上述第一个技术问题由以下方案解决:
[0006]一种纳豆激酶的提纯方法，包括以下步骤:
[0007]I)提取:将纳豆菌发酵液或粗纳豆激酶溶液进行2000r/min离心，收集上清液，得粗酶液；
[0008]2)超过滤:将所述粗酶液进行超过滤，收集排阻相对分子质量为10000以上的物质，得超滤浓缩液；
[0009]3)葡聚糖凝胶G-50柱层析:
[0010]用pH值为7.5、浓度为0.lmol/L的磷酸钠缓冲液平衡并装柱，取所述过超滤浓缩液上样，用PH值为7.5、浓度为0.lmol/L的磷酸钠缓冲液洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，并浓缩至原体积的1/3，得第一浓缩液；
[0011]4) Amberlite IRC-50阳离子交换柱层析:
[0012]装柱，取所述第一浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为l/15mol/L的磷酸钠缓冲液与PH值为8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用PH值为7.5、浓度为0.lmol/L的磷酸钠缓冲液透析，并浓缩至原体积的1/3，得第二浓缩液；
[0013]5) DEAE-CelluloseDE-52 阴离子交换柱层析:
[0014]装柱， 取所述第二浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为l/15mol/L的磷酸钠缓冲液与PH值为pH8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.lmol/L磷酸钠缓冲液透析，并浓缩至原体积的1/3，得第二浓缩液；
[0015]6)将所述第三浓缩液装在无盖培养皿中，放置在4°C下，直至出现结晶，取结晶在干燥器中进行干燥，收集结晶粉末，得納豆激酶酶蛋白結晶。
[0016]本方法采用凝胶过滤、阳、阴离子交换柱层析等纯化方法，首次分别获得层析纯、电泳纯度的酶制剂，为该酶制剂的深度开发利用奠定了广阔基础；本方法具有纯化度高及回收率高的优点。
[0017]上述第二技术问题由以下方案解决:
[0018]ー种纳豆激酶的制备方法，包括以下步骤:
[0019]1)种子菌制备:
[0020]101)菌种活化:将纳豆菌转移至斜面培养基,35°C培养24h ；
[0021]102)种子液制备:取ー环活化菌种，接入装有500mL种子培养基的1000mL锥形瓶，在温度为35°C和摇床转速为140r/min的条件下培养24h，得种子液；
[0022]103)种子扩大培养:在IOL种子罐中装入5L种子培养基，灭菌并冷却后接入750mL种子液，并加入2-3mL豆油，通入无菌空气，控制温度在35°C，培养24h，得二级种子菌；
[0023]2)纳豆菌液体发酵:
[0024]在100L发酵罐中装入40L发酵培养基，灭菌冷却后接入6L 二级种子菌，并加入20mL豆油，通入无菌空气，控制温度在35°C,培养24h，得纳豆菌发酵液；
[0025]其中，所述斜面培养基为营养琼脂；种子培养基的组分为:蛋白胨1.5%、葡萄糖1.5%、氯化钠0.5%，种子培养基的pH值为7.5 ;发酵培养基的组分为:蛋白胨1.5%、葡萄糖2%、磷酸氢二钾0.4%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、大豆1%、玉米0.2%、蚕蛹粉0.2%，发酵培养基的pH值为7.5 ;
[0026]3)提取:将纳豆菌发酵液进行2000r/min离心，收集上清液，得粗酶液；
[0027]4)超过滤:将所述粗酶液进行超过滤，收集排阻相对分子质量为10000以上的物质，得超滤浓缩液；
[0028]5)葡聚糖凝胶G-50柱层析:
[0029]用pH值为7.5、浓度为0.lmol/L的磷酸钠缓冲液平衡并装柱，取所述超滤浓缩液上样，用PH值为7.5、浓度为0.lmol/L的磷酸钠缓冲液洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，并浓缩至原体积的1/3，得第一浓缩液；
[0030]6) Amberlite IRC-50阳离子交换柱层析:
[0031]装柱，取所述第一浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为l/15mol/L的磷酸钠缓冲液与PH值为8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用PH值为7.5、浓度为0.lmol/L的磷酸钠缓冲液透析，并浓缩至原体积的1/3，得第二浓缩液；
[0032]7) DEAE-CelluloseDE-52 阴离子交换柱层析:
[0033]装柱，取所述第二浓缩液上 样，用pH值为6.0、浓度为l/15mol/L的磷酸钠缓冲液与PH值为pH8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用PH值为7.5、浓度为0.lmol/L磷酸钠缓冲液透析，并浓缩至原体积的1/3，得第二浓缩液；
[0034]8)将所述第三浓缩液装在无盖培养皿中，放置在4°C下，直至出现结晶，取结晶在干燥器中进行干燥，收集结晶粉末，得納豆激酶酶蛋白結晶。
[0035]本发明结合从选用納豆菌进行高效地发酵产酶及对纳豆菌发酵液进行质量地提纯，得出纯度较高的納豆激酶，为该酶制剂的深度开发利用奠定了广阔基础。
【【专利附图】

【附图说明】】
[0036]图1为实施例二的菌种生长曲线图；
[0037]图2为实施例二的酶活力随温度的变化曲线图；
[0038]图3为实施例二的酶活力随转速的变化曲线图；
[0039]图4为实施例三的S印hadex G-50柱层析洗脱曲线图；
[0040]图5为实施例三的Amberlite柱层析洗脱曲线图；
[0041]图6为实施例三的DEAE-纤维素DE-52柱层析洗脱曲线图；
[0042]图7为实施例二的纳激酶的蛋白结晶图；
[0043]图8为实施例四的纳豆激酶的SDS-PAGE电泳的实验结果图；
[0044]图9为实施例四的蛋白质相对分子质量的标准曲线图；
·[0045]图10为实施例五的纳豆激酶溶血效果图。
【【具体实施方式】】
[0046]实施例一
[0047]本实施例提供的一种纳豆激酶的液体发酵方法，包括以下步骤:
[0048]I)种子菌制备:
[0049]101)菌种活化:将纳豆菌转移至斜面培养基,35°C培养24h ;纳豆菌,英文名称为Bacillus natto,由中科院广东分院微生物研究所提供；
[0050]102)种子液制备:取ー环活化菌种，接入装有500mL种子培养基的1000mL锥形瓶，在温度为35°C和摇床转速为140r/min的条件下培养24h，得种子液；
[0051]103)种子扩大培养:在IOL种子罐中装入5L种子培养基，灭菌并冷却后接入750mL种子液，并加入2.5mL豆油以防止冒泡，通入无菌空气，控制温度在35°C，培养24h，即得二级种子菌；
[0052]2)纳豆菌液体发酵:
[0053]在100L发酵罐中装入40L发酵培养基，灭菌冷却后接入6L 二级种子菌，并加入20mL豆油防止冒泡，通入无菌空气，控制温度在35°C,培养24h，得纳豆菌发酵液。
[0054]其中，所述斜面培养基为市售营养琼脂；种子培养基的组分为:蛋白胨1.5%、葡萄糖1.5%、氯化钠0.5%，即种子培养基包括以下比例组分:水100ML、蛋白胨1.5g、葡萄糖
1.5g、氯化钠0.5g，种子培养基的pH值为7.5 ;发酵培养基的组分为:蛋白胨1.5%、葡萄糖2%、磷酸氢二钾0.4%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、大豆1%、玉米0.2%、蚕蛹粉0.2%，即发酵培养基包括以下比例组分:水100ML、蛋白胨1.5g、葡萄糖2g、磷酸氢二钾0.4g、磷酸二氢钾0.2g、硫酸镁0.05g、大豆lg、玉米0.2g、蚕蛹粉0.2g，发酵培养基的pH值为7.5。
[0055]经检测，上述纳豆菌液体发酵液进行2000r/min离心，上清液的酶活力达1320U/mL0
[0056]酶活力的測定方法參见由中国农业出版社出版、徐凤彩为主编、姜涌明为副主编的《酶工程》;酶活力単位定义为:在酶活力測定条件下，于275nm波长下光吸收值每分钟增加0.001个单位的酶量为I个酶活力单位(U)。
[0057]实施例二
[0058]在本实施例中，进行陈述探讨实施例一中的纳豆菌发酵产酶エ艺条件。在本实施例中，酶活力的測定方法參见由中国农业出版社出版、徐凤彩为主编、姜涌明为副主编的《酶工程》；酶活力単位定义为:在酶活力測定条件下，于275nm波长下光吸收值每分钟增加
0.001个单位的酶量为I个酶活力单位(U)。
[0059]菌种生长曲线:在装有400mL种子培养基的1000mL锥形瓶中接入5%的种子液，在温度为35°C、摇床转速为140r/min的条件下培养；每隔2h取样，直到28h，测菌浓度(0D_)与酶活力；以时间(h)为横坐标，0D_值与酶活力为纵坐标，作图为纳豆菌生长曲线。菌浓度(OD6tltl)的概念见于《納豆激酶摇床发酵条件的优化》，该文章发表于《药物生物技木》，2005，12 (1):19~21。由图1可见，在0~8h时，納豆菌生长处于调整期；10~22h后处于对数生长期，22~24h处于稳定期，而后快速下降，进入衰退期。本研究采用发酵最佳时间为24h。
[0060]培养温度对产酶的影响:在装有400mL种子培养基的1000mL锥形瓶中接入5%的种子液，温度分别为25°C、28°C、35°C、39°C，摇床转速为140r/min，培养24h后测定酶活力；以温度为横坐标，酶活力为纵坐标，作图为培养温度对纳豆菌产酶的影响曲线。由图2可见,在35°C下酶活力最高,酶 活力为173.2U/mL。因此纳豆菌发酵产酶的最适温度为35°C。本研究采用35°C下发酵生产酶。
[0061]不同转速对产酶的影响:在装有400mL种子培养基的1000mL锥形瓶中接入5%的种子液，温度为35°C，摇床转速分别为100r/min、140r/min、170r/min、200r/min，培养24h后测定酶活力；以摇床转速为横坐标，酶活力为纵坐标，作图为摇床转速对納豆菌产酶的影响曲线。由图3可见，摇床转速为170r/min为纳豆菌产酶的最适转速。因此本研究采用摇床转速170r/min发酵生产酶。
[0062]L9 (34)正交设计:在单因素确定的基础上，采用L9 (34)正交实验对pH、接种量、装液量3个因素进行优化，从而确定纳豆菌产酶的最适条件；三因素分别是:A---pH:Al (pH6)，A2 (pH7)，A3 (pH8) ；B接种量:BI (5%)，B2 (10%)，B3 (15%) ；C装液量:Cl (40%)，C2 (50%)，C3 (60%);培养条件具体为:采用1000mL锥形瓶装液，摇床转速为170r/min，温度为35°C,培养时间为24h ;分别测定酶活力。结果如表1,从表1中看出，对纳豆菌发酵的影响程度为A > B > C ;而最佳组合为A2B3C1,即:pH7，接种量15%，装液量40%。
[0063]表1纳豆菌液体发酵正交试验分析表
[0064]
【权利要求】
1.一种纳豆激酶的提纯方法，包括以下步骤: 1)提取:将纳豆菌发酵液或粗纳豆激酶溶液进行2000r/min离心，收集上清液，得粗酶液； 2)超过滤:将所述粗酶液进行超过滤，收集排阻相对分子质量为10000以上的物质，得超滤浓缩液； 3)葡聚糖凝胶G-50柱层析: 用PH值为7.5、浓度为0.lmol/L的磷酸钠缓冲液平衡并装柱，取所述超滤浓缩液上样，用PH值为7.5、浓度为0.lmol/L的磷酸钠缓冲液洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，并浓缩至原体积的1/3，得第一浓缩液； 4)Amberlite IRC-50阳离子交换柱层析: 装柱，取所述第一浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为l/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液,合并含酶的洗脱液，用PH值为7.5、浓度为0.lmol/L的磷酸钠缓冲液透析，浓缩至原体积的1/3，得第二浓缩液； 5)DEAE-CelluloseDE-52阴离子交换柱层析: 装柱，取所述第二浓缩液上样，用PH值为6.0、浓度为l/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为pH8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用PH值为7.5、浓度为0.lmol/L磷酸钠缓冲液透析，浓缩至原体积的1/3，得第三浓缩液； 6)将所述第三浓缩液装在无盖培养皿中，放置在4°C下，直至出现结晶，取结晶在干燥器中进行干燥，收集结晶粉末，得纳豆激酶酶蛋白结晶。
2.—种纳豆激酶的制备方法，包括以下步骤: 1)种子菌制备: 101)菌种活化:将纳豆菌转移至斜面培养基，35°C培养24h； 102)种子液制备:取一环活化菌种，接入装有500mL种子培养基的1000mL锥形瓶，在温度为35°C和摇床转速为140r/min的条件下培养24h，得种子液； 103)种子扩大培养:在IOL种子罐中装入5L种子培养基，灭菌并冷却后接入750mL种子液，并加入2-3mL豆油，通入无菌空气，控制温度在35°C，培养24h，得二级种子菌； 2)纳豆菌液体发酵: 在100L发酵罐中装入40L发酵培养基，灭菌冷却后接入6L 二级种子菌，并加入20mL豆油，通入无菌空气，控制温度在35°C,培养24h，得纳豆菌发酵液； 其中，所述斜面培养基为营养琼脂；种子培养基的组分为:蛋白胨1.5%、葡萄糖1.5%、氯化钠0.5%，种子培养基的pH值为7.5 ;发酵培养基的组分为:蛋白胨1.5%、葡萄糖2%、磷酸氢二钾0.4%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、大豆1%、玉米0.2%、蚕蛹粉0.2%，发酵培养基的PH值为7.5 ； 3)提取:将纳豆菌发酵液进行2000r/min离心，收集上清液，得粗酶液； 4)超过滤:将所述粗酶液进行超过滤，收集排阻相对分子质量为10000以上的物质，得超滤浓缩液； 5)葡聚糖凝胶G-50柱层析:用pH值为7.5、浓度为0.lmol/L的磷酸钠缓冲液平衡并装柱，取所述超滤浓缩液上样，用PH值为7.5、浓度为0.lmol/L的磷酸钠缓冲液洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，并浓缩至原体积的1/3，得第一浓缩液； 6)Amberlite IRC-50阳离子交换柱层析: 装柱，取所述第一浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为l/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液,合并含酶的洗脱液，用PH值为7.5、浓度为0.lmol/L的磷酸钠缓冲液透析，并浓缩至原体积的1/3，得第二浓缩液； 7)DEAE-CelluloseDE-52阴离子交换柱层析: 装柱，取所述第二浓缩液上样，用PH值为6.0、浓度为l/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为pH8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用PH值为7.5、浓度为0.lmol/L磷酸钠缓冲液透析，浓缩至原体积的1/3，得第三浓缩液； 8)将所述第三浓缩液装在无盖培养皿中，放置在4°C下，直至出现结晶，取结晶在干燥器中进行干燥，收集 结晶粉末，得納豆激酶酶蛋白結晶。
【文档编号】C12R1/07GK103589706SQ201310149128
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年4月25日 优先权日:2013年4月25日
【发明者】马义福, 胡永刚, 徐凤彩, 邵玉珠 申请人:珠海市御品堂生物科技有限公司