一种苹果酸酶基因SgME1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种编码苹果酸酶的基因SgME1及其应用。该苹果酸酶基因SgME1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。SgME1基因调控柱花草苹果酸的合成，过量表达SgME1促进酵母、菜豆毛根和拟南芥苹果酸的合成，并增加其耐铝性。
【专利说明】一种苹果酸酶基因SgMEI及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物【技术领域】，具体涉及苹果酸酶基因没#万7及其应用。
【背景技术】
[0002]铝毒害是酸性土壤上限制作物生长的主要障碍因素之一(Kochian et al.，2004)。pH小于5时，土壤中的铝就以活性形式存在，能够快速地被植物根系吸收(Kinraide, 1991)，对根尖的生长产生毒害作用，最终导致作物产量的降低。
[0003]铝离子可以与细胞壁和共质体相互作用，进而扰乱植物细胞正常的生理生化反应(Kochian et al.，2005)。研究表明，招容易结合在带负电荷的细胞壁果胶质上,从而降低细胞壁的延展性，限制细胞的伸长(Yang et al.，2011)。铝除了与细胞壁结合之外，还能够累积在共质体内，扰乱细胞骨架的形成(Sivaguru et al.，1999)和抑制细胞的分裂(Roy et al.，1989)等，并能够使脂质过氧化(Yamamoto et al.，2001),从而影响根系生长发育。
[0004]植物适应铝毒的机制主要包括内部忍耐和外部排斥机制(Kochian et al.，2005; Ma et al.，2001)。内部忍耐机制主要是指进入到细胞质中的铝与有机酸或其它化合物螯合，形成稳定的络合物，并隔离在液泡中，起到解除铝毒害的作用(Ma et al.,1998)。外部排斥机制主要是通过根系分泌有机酸螯合铝离子，形成稳定的有机酸-铝复合物，减少对铝的吸收，从而起到缓解铝毒害的作用。大量的证据表明，苹果酸、柠檬酸和草酸等的分泌能够有效降低铝的毒 害能力。目前，介导苹果酸和柠檬酸分泌的转运蛋白苹果酸转运子ALMTl和柠檬酸转运子MATE已成功分离克隆，这些基因的表达受到铝的调控，过量mkALMTl与姻招分别促进苹果酸和柠檬酸的分泌，并能够提高植物的耐铝性(Sasaki etal., 2004; Magalhaes et al., 2007)。同时，在铝胁迫下，通过调控编码三羧酸循环关键酶基因(PEPC'CSJtDH^ICDH)的表达，有利于柠檬酸和苹果酸的合成与分泌，通过有机酸的分泌缓解铝毒害(Rangel et al.，2010 ；ffang et al.，2010)。
[0005]柱花草是公认的适应热带和亚热带生长的先锋豆科作物，是我国南方重要的优质豆科牧草(Liu et al.，1997),属于豆科柱花草属{Stylosanthes spp.),因富含蛋白质、糖类和纤维，在澳大利亚、南美、南非、东南亚等热带和亚热带地区大面积种植，并具有较高的产量和品质(Noble et al., 2000)。据报道,世界上60%的酸性土壤分布于热带和亚热带地区，因此，适应于热带和亚热带生长的植物有可能具有独特的耐铝机制(Metali etal.，2012)，长期种植于热带和亚热带酸性土壤上的柱花草可能具有潜在的适应酸性土壤生长的能力。
[0006]通过早期的耐铝性筛选，我们发现磷低效柱花草基因型Fine-stem对铝胁迫敏感，磷高效柱花草基因型TPRC2001-1对铝毒具有良好的忍耐能力(Du et al.，2009)，并且TPRC2001-1的耐铝能力与耐铝作物水稻相当，然而鲜有对柱花草耐铝机制的研究。
[0007]针对上述研究背景， 申请人:通过蛋白质双向电泳的方法，从柱花草耐铝基因型TPRC2001-1中分离到一个受铝调控的编码苹果酸酶的蛋白SgMEl，并利用RACE技术，获得编码该蛋白的基因全长序列。利用酵母、菜豆毛状根和拟南芥等表达体系，证明没#万7基因编码的蛋白具有合成苹果酸的功能，最终提高转基因材料耐铝毒的能力。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种苹果酸酶基因没#万7，本发明的另一个目的是提供上述基因编码的蛋白质，本发明的进一步目的是提供上述基因及其编码的蛋白质的应用。
[0009]本发明上述目的通过以下技术方案予以实现:
本发明所提供的苹果酸酶基因没#万7，可以来源于柱花草，其包含或具有选自如下的核苷酸序列:
(1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
(2)与(I)的核苷酸序列的互补序列在低等严格条件、中等严格条件、优选高严格条件下杂交的核苷酸序列；
(3)与(I)的核苷酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、特别优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的核苷酸序列；
(4)与(I)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但在序列上不同的核苷酸序列；
(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列:SEQID N0:2所示的氨基酸序列，或者，由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQID NO: 2所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的氨基酸序列；
(6)(I) - (5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；
(7)与(I)- (5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0010]SEQ ID NO:1由1758个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为第1-1758位碱基，编码具有序列SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述氨基酸序列组成的蛋白质在本发明中称为SgMEl蛋白。
[0011]本发明提供的苹果酸酶基因没《?7编码的蛋白质，其包含或具有选自如下的氨基酸序列:
(1)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列；
(2)由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列；
(3)与SEQID NO: 2中所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、特别优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的
氨基酸序列；
(4)(I)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段；
(5)本发明的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。
[0012]本发明提供的基因没#万7和蛋白质能够调控包含它的转基因生物体内苹果酸的合成。[0013]扩增上述没#万7基因全长或其任一片段的引物对属于本发明的保护范围。
[0014]本发明还提供含有上述没#万7基因的表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有SgMEl基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体等，如pYLRNAi (由刘耀光研究员实验室惠赠，具体描述见文献:胡旭霞和刘耀光，2006，分子植物育种)或其它衍生植物表达载体。[0015]本发明还提供一种基因工程菌，其含有上述的表达载体。
[0016]本发明还涉及细胞，其包含本发明的没#万7基因或重组载体。所述细胞可以是植物细胞，例如豆科植物细胞，或者微生物细胞，例如细菌或真菌细胞，例如酵母细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。
[0017]本发明还涉及植物或者植物部分，植物材料，植物种子，其包含本发明的细胞。所述植物可以是豆科植物，例如大豆，也可以是其它植物，例如单子叶植物如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、燕麦、或黑麦等，或者其他双子叶植物如烟草、向日葵、甜菜、辣椒、马铃薯、番茄等。还涉及来自所述植物的转基因种子。
[0018]本发明还涉及生产植物的方法，该方法包括:从本发明的植物细胞再生转基因植物，或者将本发明的植物与另一植物杂交。
[0019]本发明还涉及本发明的方法生产的植物。
[0020]本发明还涉及本发明的没《?7基因或重组载体在调控植物苹果酸的合成中的用途，包括制备转基因植物以及制备促进植物适应酸性土壤的制剂。
[0021]本发明还涉及调控植物适应酸性土壤的方法，该方法包括制备含有本发明的没#万7基因或重组载体的植物，例如，所述方法可以包括从本发明的植物细胞再生转基因植物或者将本发明的植物与另一植物杂交。
[0022]本发明所提供的一个优选实施方案是将上述基因SgMEl导入菜豆毛根和拟南芥中，得到转基因材料；所述转基因材料耐铝能力等高于所述目的对照植物。
[0023]所述基因SgMEl可以例如是通过所述重组表达载体导入受体植物的。
[0024]携带有本发明的基因SgMEl的植物表达载体可通过例如农杆菌介导的下胚轴转化法转化到菜豆毛状根和拟南芥中。
[0025]本发明的优点和效果:
1.基因没#万7所属的苹果酸酶家族在拟南芥，小麦和水稻中虽已被克隆及报道，但其在参与苹果酸合成方面的生物学功能并不清楚。本发明克隆的基因没#^7对柱花草苹果酸合成有显著的影响，这对阐明苹果酸酶基因在豆科作物适应酸性土壤的生物学功能有着重要意义。
[0026]2.基因没#万7不仅影响了苹果酸的合成，超量表达该基因还增加了酵母、菜豆毛根和拟南芥对铝毒的忍耐能力。该基因的功能研究对于解析豆科作物适应酸性土壤的分子机理有着深远的研究意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1:50剛铝处理对柱花草和水稻根伸长的影响；试验中每个处理设4个重复，图中柱子和误差线分别为4个重复数据的平均值和标准误差(下同)。大小写字母分别表示24和72小时根相对伸长量的显著性分析，不同字母表示在P =0.05水平基因型间差异显著。[0028]图2:铝处理对柱花草根部铝含量的影响；*号表示同一处理在不同基因型之间进行差异显著性比较的结果，**表示显著水平0.001〈P〈0.01时，差异极显著。
[0029]图3:铝处理对根部苹果酸浓度和苹果酸分泌的影响；A，100 μΜ AlCl3处理24小时后根部苹果酸浓度；Β，铝处理72小时后根部苹果酸浓度；C，铝处理24小时后苹果酸分泌速率；D，铝处理72小时后苹果酸分泌速率；图中柱子和误差线分别为试验各处理4个重复数据的平均值和标准误差；星号表示同一基因型在不同处理间差异显著性比较的结果，**表不显者水平0.001 KP〈0.01时，差异极显者。
[0030]图4:通过双向电泳技术分离鉴定获得苹果酸酶SgMEl ；A,不加铝处理24小时后，SgMEl蛋白点在TPRC2001-1根部的蛋白图；B，加铝处理24小时后SgMEl的蛋白图；C，不加铝处理72小时后SgMEl的蛋白图；D，加铝处理72小时后SgMEl的蛋白图；方框表示SgMEl蛋白点。
[0031]图5 =SgMEl融合GFP洋葱表皮亚细胞定位分析；前两排分别显示的是pBEGFP空载体转化洋葱表皮细胞质壁分离前后的图片；后两排分别显示SgMEl融合GFP载体转化洋葱表皮细胞质壁分离前后的图片；显微镜观察的内容分别有绿色荧光通道(GFP荧光)、光镜通道(明场)、红色荧光通道(PI染色)和重叠后的图片(融合)。
[0032]图6 'SgMEl转化酵母、菜豆毛根和拟南芥对内源苹果酸浓度的影响；A，pYES2空载体和m泣-SgMEI转化酵母后的内源苹果酸浓度；B，PYL空载体和肌-SgMEI转化菜豆毛根后的内源苹果酸浓度；C，pYL空载体和肌SgMEI转化拟南芥的内源苹果酸浓度。CK，转化空载的对照株系；0X，5kiffi7基因的超表达株系。星号表示同一指标在不同转化株系间差异显著性比较的结果， *表示显著水平P〈0.05时，差异显著，**表示显著水平0.001 <P〈0.01时，差异极显著。
[0033]图7:铝处理对5^歷7表达量的影响；A，铝处理24小时对5^歷7在柱花草根部表达量的影响；B，铝处理72小时对5^量7在柱花草根部表达量的影响；*表示显著水平P〈0.05时，差异显著。
[0034]图8:超量表达没#万7对酵母、菜豆毛根与拟南芥转化株系耐铝性的影响；A，转化PYES2空载体和pYES2-5^iffi7的酵母在铝处理条件的表型分析不同菜豆毛根转基因株系和空载体对照在铝处理条件下的表型分析；C，SgMEl不同菜豆毛根转基因株系和空载体对照相对根伸长量的比较。XhSgMEl不同拟南芥转基因株系和空载体对照在铝处理条件下的表型分析疋，SgMEl不同拟南芥转基因株系和空载体对照相对根伸长量的比较。CK，转化空载的对照株系；0X，5kiffi7基因的超表达株系。星号表示同一指标在不同转化株系间差异显著性比较的结果，*表示显著水平P〈0.05时，差异显著。
【具体实施方式】
[0035]下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0036]实施例1 SgMEl基因的克隆
1.SgMEl蛋白的分离与鉴定
参照陈志坚等(2011)方法提取柱花草根系蛋白质，进行双向电泳。每个试验处理设置3个重复，筛选不加铝对照与加铝处理间显著差异表达的蛋白点，并用ABI 4700 TOF-TOF(Applied Biosystems 公司，美国)进行 MALD1-TOF /TOF MS 质谱分析。
[0037]结果如图4所示，由结果可知:与对照相比，在铝胁迫24小时柱花草根部的SgMEl蛋白的累积量没有显著的变化。但是在铝胁迫72小时后，SgMEl蛋白的累积量显著在根部增加，说明SgMEl蛋白的表达量受长期铝胁迫的加强。
[0038]2.没?歷7基因的克隆
根据菜豆(J03825.1)，大豆(XM_003526456.1)，葡萄(XM_003631725.1)和苜蓿(XM_003630679.1) ME基因的保守结构域设计引物5^#^7-EST_F (SEQ ID NO: 3)和SgMBl-EST-R (SEQ ID NO:4) ? 20 u L PCR 反应体系为，灭菌 ddH20 13.68 u L, IOXPCRbuffer 2 u L,2.5 mM dNTP 1.6 u L, 10 U M 正反向引物各 0.8 yL，ExTaq 酶(TAKARA 公司，日本)0.12 iiL，cDNA模板I UL。反应程序为，95 °C变性I min，然后94 V 30 s，58V 30 s，72 V 30 s，进行30次循环，最后72 °C延伸10 min。PCR扩增后获得443 bp的片断，通过加有Golder view核酸染料(鼎国公司，中国)的1%琼脂糖凝胶(Genetech公司，美国)电泳和凝胶成像系统成像确认片断大小正确后，参照Tiangen公司(德国)凝胶回收试剂盒说明将目的片断切胶回收，连入PGEM-T载体(Promega公司，美国)并测序。
[0039]根据SgMEl EST 序列设计 5’端 RACE 引物货歷7-RACE5’ -R (SEQ ID NO:5)和3’端特异引物没?歷7-RACE3’ -F (SEQ ID NO: 6)，以铝处理后的柱花草TPRC2001-1根系的cDNA 为模板，采用 Clotech 公司(美国)的 SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 试剂盒进行cDNA末端快速扩增，获得5’端和3’端cDNA序列。采用MEGA 4.1软件，将两端序列与EST序列拼接，获得全长序列。
[0040]SEQ ID N0:3:5’ - GTTTGAAGACTTCGCGAATCATAATG -3，
SEQ ID N0:4:5’ - CT TTGGTAAATGTCTTCCCTACTCC -3，
SEQ ID NO:5:5’ - CCACTTCTTTGGTAAATGTCTTCCCTACTCCAG -3’
SEQ ID N0:6:5’ - CTTATACAGTTTGAAGACTTCGCGAATCATAATG -3’
3.载体的构建
(I)亚细胞定位分析表达载体的构建
瞬时表达载体采用 35S驱动的pBEGFP，用5^iffi7-GFP-F (SEQ ID NO: 7)和5^iffi7-GFP-R(SEQ ID NO:8)扩增SgMEl全长ORF，分别在引物的5’端加命n I热BamH I两个酶切位点及ATG前加4个保护碱基，确保编码的目的蛋白与GFP蛋白能正确融合。PCR产物切胶回收并成功连入pGEM-T载体后,采用质粒小量提取试剂盒(Tiangen公司，德国)提取质粒。用Kpn I和BamH I双酶切pBEGFP和装载有SgMEl基因的T载体质粒，回收目的片段后连接转化DH10B,测序确认SgMEl基因的序列正确。
[0041](2)酵母表达载体的构建
用分别含有BamHl和酶切位点的5^M7-pYES2-F (SEQ ID NO:9)和SgMEl~pYES2~R (SEQ ID NO: 10)，通过 PCR 扩增 SgMEl 的 ORF 序列，并连入 pGEM_T 载体。用BamHl和EcoRl对pYES2 (Invitrogen公司，美国)和装载有SgMEl基因的T载体质粒进行双酶切，回收目的片段后连接转化DH10B。测序准确后，挑选阳性克隆大量摇菌抽提质粒，获得装载有SgMEl基因的pYES2载体。
[0042](3) SgMEl过量表达载体的构建
用分别含有SacI和#7wI酶切位点的货歷7-pYL-F (SEQ ID NO: 11)和5^#^7-pYL_R(SEQ ID N0:12)，通过PCR扩增?.iffi7的0RF序列，并连入pGEM-T载体。用feci和
【权利要求】
1.一种编码苹果酸酶的基因没#…，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.—种权利要求1所述的苹果酸酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.—种表达载体，其特征在于含有权利要求1所述编码苹果酸酶的基因没#万7。
4.一种基因工程菌，其特征在于含有权利要求3所述的表达载体。
5.权利要求1所述苹果酸酶基因SgMEl在制备转基因植物中的应用。
6. 权利要求1所述苹果酸酶基因没#万7在制备促进植物适应酸性土壤的制剂或提高植物耐铝能力上的应用。
7.权利要求3所述的表达载体在制备转基因植物中的应用。
8.权利要求3所述的表达载体在制备促进植物适应酸性土壤的制剂或提高植物耐铝能力上的应用。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的应用，其特征在于所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述双子叶植物为豆科植物、烟草、向日葵、甜菜、辣椒、马铃薯或番茄；所述的单子叶植物为水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、燕麦或黑麦。
【文档编号】C12N5/10GK103525838SQ201310290850
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年7月11日 优先权日:2013年7月11日
【发明者】田江, 廖红, 孙丽莉 申请人:华南农业大学