去甲氯胺酮蛋白结合化合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供能够结合至去甲氯胺酮的适体，其可用于涉及去甲氯胺酮的药物滥用的诊断中。
【专利说明】去甲氯胺酮蛋白结合化合物
【背景技术】
[0001]氯胺酮[ketamine, R, S-2 (O-氯苯基)_2_ (甲氨基)环己酮]是分离麻醉剂，已广泛用在临床实践中长达25多年。氯胺酮在亚麻醉剂量下还是有效的镇痛剂。氯胺酮经由CYP-450N-去甲基经历强的肝脏代谢，成为去甲氯胺酮(norketamine，NK)0细胞色素P4503A4是引起氯胺酮N-去甲基成为去甲氯胺酮的主要酶。环己酮环还进行氧化代谢，形成第二代谢物去氢去甲氯胺酮(DHNK)。这两种代谢物，特别是NK，可有助于氯胺酮的药物作用。
[0002]盐酸氯胺酮作为人和兽医用途的麻醉剂而销售。氯胺酮，也称为“K”，产生与苯环己哌啶(PCP)所产生作用相似的作用，具有LSD的视觉作用。结果，氯胺酮滥用的潜在性并不令人惊讶。氯胺酮在受试者中的浓度在约6~7700ng/mL的范围内。去甲氯胺酮在尿中的浓度在约7~8000ng/mL的范围内。可在约3天时间的尿中检测出氯胺酮使用。在接受药物治疗的人中，血液或血浆氯胺酮的浓度通常在0.5~5.0ug/mL的范围内，在因不清醒驾驶而被捕的人中通常为I~2ug/mL，在急性致死超剂量的受害者中通常为3~20ug/mL。去甲氯胺酮产生与氯胺酮相似的作用。去甲氯胺酮这种药学活性代谢物的存在，可用于氯胺酮摄取的确定。
【发明内容】
[0003]本发明涉及适体和使用方法。更具体地，本发明涉及与去甲氯胺酮相关的适体和检测方法。本发明提供能够与去甲氯胺酮结合并可用作去甲氯胺酮和氯胺酮摄取诊断的适体。本发明还提供复合物 、治疗剂、试剂盒及前述这些的制备方法和使用方法(例如，诊断、治疗方法)。
[0004]一方面，本发明是包括一个以下核苷酸序列的适体:
[0005]5’-GAGGTGGGTGGGTGGGGCGGTTTTC-3’ , (SEQ ID NO:1)
[0006]5’-GAGGTGGGTGGGTGGGGCGTTGTTT-3’ ， (SEQ ID NO:2)
[0007]5’-GAGGGGGGCGGGTGGGGCGTTATTC-3’ ， (SEQ ID NO:3)
[0008]在另一个方面，本发明是本文中与去甲氯胺酮特异结合的适体。
[0009]在另一个方面，本发明是本文中的适体，其中适体与去甲氯胺酮之间的离解常数(Kd)在10.6纳摩尔(nM)至134.6nM的范围内。
[0010]在另一个方面，本发明是本文中5’端被硫醇基、生物素(例如，生物素基)、发光标签(包括荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶)、荧光标签(异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE), Cy3、和Cy5)、或酶(包括碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP))修饰的适体。
[0011]在另一个方面，本发明是包括10~80个核苷酸的本文中的适体。
[0012]另一个方面，本发明是用于检测样品中去甲氯胺酮的检测方法，检测方法包括:提供本文中的适体；将样品与适体混合，从而使样品中的去甲氯胺酮与适体结合而形成去甲氯胺酮-适体复合物；以及检测去甲氯胺酮-适体复合物中的去甲氯胺酮或适体。
[0013]在另一个方面中，本发明是本文中的检测方法，还包括对所检测的去甲氯胺酮的水平进行传达(例如，口头、书面、电子介质)。在另一个方面，传达是针对卫生保健提供者。
[0014]在另一个方面，本发明是本文中的检测方法，其中适体用硫醇、生物素标签、发光标签(包括荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶)、荧光标签(异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、Cy3、和Cy5 )、或酶(包括碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP))标记。
[0015]本发明还涉及去甲氯胺酮的检测方法，其中，与常规的比色检测方法例如ELISA相比，使用Luminex检测系统的检测方法高度灵敏。
[0016]用于去甲氯胺酮的检测方法，适合于检测样品中的去甲氯胺酮，检测方法包括:提供多个与去甲氯胺酮共价结合的珠；使珠与标记的本文适体混合，从而使珠上的去甲氯胺酮与标记的适体结合；将链霉亲和素-藻红蛋白结合物加到与珠混合的样品中，从而使链霉亲和素-藻红蛋白结合物与标记的适体结合；除去未结合的链霉亲和素-藻红蛋白结合物；以及通过标记的适体来检测与珠结合的链霉亲和素-藻红蛋白结合物。
[0017]在另一个方面，本发明是本文中的检测方法，其中标记的适体用生物素标签(即，生物素化)标记。
[0018]另一个方面是包括本文适体的适体-珠复合物。在本发明的一个实施方式中，去甲氯胺酮与珠共价结合。
[0019]在另一个方面，本发明是还包括标签部分的适体-珠复合物。
[0020]另一个方面是制备本文中的适体-珠复合物的方法，包括使珠与本文的适体混
八
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[0021]在另一个方面中，本发明是制备本文中的适体-珠复合物的方法，还包括混合在链霉亲和素-藻红蛋白结合物中。
[0022]另一个方面是包括用于检测去甲氯胺酮的本文适体和说明书的试剂盒。
[0023]在另一个方面，本发明是试剂盒，其中适体与珠结合。
[0024]另一个方面是包括珠上的去甲氯胺酮、本文的适体以及链霉亲和素-藻红蛋白结合物的组合物。
[0025]在另一个方面，本发明是组合物，其中适体被生物素化。
[0026]另一个方面是在受试者中检测疾病或病症的方法，包括:将受试者样品与本文适体混合,从而使样品中的去甲氯胺酮与适体结合以形成去甲氯胺酮-适体复合物；以及检测去甲氯胺酮-适体复合物中的去甲氯胺酮或适体。
[0027]在另一个方面，本发明是本文的方法，其中疾病或病症是氯胺酮使用或滥用。
[0028]在另一个方面，本发明是本文的方法，还包括对卫生保健提供者传达该方法的结果O
[0029]按照以上，本发明的适体能够与去甲氯胺酮特异结合，因此，采用适体的去甲氯胺酮检测方法具有高灵敏度。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]纳入附图来提供进一步的理解，其并入到本说明书中并构成本说明书的一部分。附图图解示例性实施方式，并与说明书一起解释本公开的原理。
[0031]图1示出根据本发明实施方式的去甲氯胺酮检测方法的示意性流程图。
[0032]图2示出在竞争测试之后从适体池中得到的聚合酶链式反应(PCR)产物的琼脂糖凝胶电泳结果。在14轮竞争测试之后，使用PCR法扩增适体池。为获得最优的扩增循环，在不同的PCR循环中收集PCR扩增子并进行凝胶电泳分析。使用2.5%的琼脂糖凝胶分离PCR 扩增子，并在 GE ImageQuant350 成像系统(GE Healthcare, USA)下使用 Gel-Red 进行可视化。第I道:DNA梯带；第2道:无模板对照；第3道:阳性对照；第4~9道:分别为第
14、16、18、20、22 和 24 个 PCR 循环。bp:碱基对。
[0033]图3是使用Luminex2003.1xPONENT系统(Millipore，USA)检测的，在指示的适体浓度下测量的受体-配体结合曲线。简单而言，MagPlex微球涂覆有去甲氯胺酮。之后，将微球与指示量的生物素化适体一起孵育。接着，加入链霉亲和素-藻红蛋白结合物，并检测经生物素化适体与珠结合的链霉亲和素-藻红蛋白结合物的量。A)SEQ ID N0:1，离解常数(Kd)为 70.6nM ；B) SEQ ID NO:2，Kd 为 10.6nM ；C) SEQ ID NO:3，Kd 为 134.6nM。示出的结果是平均荧光强度，收集100项的最小值。人类血清白蛋白用作阴性对照。 【具体实施方式】
[0034]如本文中使用的术语“适体”、“化合物”、“蛋白”、“核苷酸序列”、“核酸”(包括本文具体描述的那些)包括所述化合物的药学可接受盐、其水合物和溶剂化物。
[0035]术语“患者”或“受试者”包括接受预防或治疗处理的人和其他哺乳动物受试者。
[0036]本文中使用的“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、羊、猴、山羊、兔、仓鼠、马、牛或猪。
[0037]此外，本发明的一些化合物具有一个或多个双键、或者一个或多个不对称中心。这样的化合物可以作为外消旋体、外消旋混合物、单一对映异构体、单独非对映异构体、非对映异构混合物以及顺式或反式或E或Z双异构形式。这些化合物的所有这些异构形式都明确地包括在本发明中。本发明的化合物将不仅包括立体异构混合物，还包括几乎不含另一立体异构体的单独的各立体异构体。本文中使用的术语“几乎不含”是指存在少于25%的其他立体异构体，优选少于10%的其他立体异构体，更优选少于5%的其他立体异构体，最优选少于2%的其他立体异构体。获得或合成非对映异构体的方法在领域内已知，其可以实际应用到最终化合物或起始化合物或中间体。其他实施方式是其中化合物是分离的化合物的那些。
[0038]通常用于形成药学上可接受的盐的酸包括无机酸，比如二硫化氢、氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸和磷酸；以及有机酸，比如对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、酸式酒石酸(bitartaric)、抗坏血酸、马来酸、苯磺酸(besylic)、延胡索酸、葡糖酸、葡糖醒酸、甲酸、谷氨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸(benzenesulfonic)、乳酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥拍酸、柠檬酸、苯甲酸和乙酸；以及相关的无机和有机酸。这些药学上可接受的盐因此包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、醋酸盐、丙酸盐、癸酸盐(decanoate)、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酸盐(caprate)、庚酸盐、丙炔酸盐(propiolate)、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4- 二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯代苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、β -羟基丁酸盐、羟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐和类似盐。
[0039]存在多种方法可用于候选化合物的化学合成。这些化合物可以使用本领域普通技术人员已知的标准合成技术和方法由方便可得的起始化合物合成。可用于合成由本文所述方法识别的化合物的合成化学转化和保护基团方法论(保护和去保护)在本领域已知，包括，例如，在 R.Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCHPublishers(1989) ；T.ff.Greene and P.G.M.ffuts, Protective Groups in OrganicSynthesis, 2nd ed., John Wiley and Sons(1991) ；L.Fieser and M.Fieser, Fieserand Fieser's Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons (1994)；L.Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley andSons (1995)及其后续版本中记载的方法。
[0040]本发明的化合物可以经由任何常规途径作为药物组合物而给药，特别是肠道外给药例如静脉内或皮下或肌内注射；经肠道给药，例如口服，例如以片剂或胶囊剂的形式；局部给药，例如，以洗剂、凝胶、软膏或乳膏的形式，或用于局部递送的鼻或栓剂形式。包括游离形式或药学可接受盐形式的本发明化合物以及至少一种药学可接受载体或稀释剂的药物组合物，可以以常规方式通过混合、成颗粒或涂覆方法进行制备。例如，口服组合物可以是包含活性成分连同以下成分的片剂或明胶胶囊剂，a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如硅石、滑石、硬脂酸、其镁或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂还有c)结合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要的话，还有d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、褐藻酸、或其钠盐，或起泡混合物；和/或e)吸收剂、着色剂、调味剂和甜味剂。可注射的组合物可以是等渗水溶液或悬浮液，且栓剂可以从脂类乳剂或悬浮液制备。这些组合物可以是无菌的和/或包含佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液助催化剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲液。此外，它们还可以包括其他药学上有价值的物质。用于经皮施用的合适制剂包括有效量 的本发明化合物和载体。载体可以包括可吸收的药学可接受的溶剂，以帮助通过宿主的皮肤。例如，经皮设备为包括背衬件、含有化合物任选连同载体的储库、任选地速率控制屏障的绷带形式，以将化合物在长时间段内以受控和预定的速率递送至宿主皮肤，并且是保证设备对皮肤安全的工具。
[0041]术语“样品”是指体液的样品、分离细胞的样品或来自组织或器官的样品。体液的样品可以通过已知的技术得到，优选包括血液、血浆、血清或尿的样品，更优选血液、血浆或血清的样品。组织或器官样品可以通过例如活组织检查而从任何组织或器官处得到。分离的细胞可以通过分离技术例如离心或细胞分选从体液或组织或器官处得到。优选地，细胞、组织或器官样品得自表达或产生本文所提及肽类的那些细胞、组织或器官。
[0042]对本文以变量的任意定义对列举元素的表述包括对作为任意单独元素或所列元素的组合(或亚组合)的变量的定义。对本文实施方式的表述包括作为任意单独实施方式或与任意其他实施方式或其部分的组合的实施方式。
[0043]本发明涉及与去甲氯胺酮特异结合的适体。在公开内容中公开的序列列表编辑在“序列表”部分中。适体包括以下核苷酸序列:5’ -GAGGTGGGTGGGTGGGGCGGTTTTC-3’，(SEQ ID NO:1)；5'-GAGGTGGGTGGGTGGGGCGTTGTTT-3',(SEQ ID NO:2);5’-GAGGGGGGCGGGTGGGGCGTTATTC-3’，(SEQ ID NO:3)。[0044]换言之，适体是与去甲氯胺酮特异结合的单链的脱氧核糖核酸(DNA)片段。在一个实施方式中，全长的适体包括10~80个核苷酸。
[0045]本发明的适体能够特异地结合去甲氯胺酮，且适体与去甲氯胺酮之间的离解常数(Kd)在10.6纳摩尔(nM)至134.6nM的范围内，例如，包括在范围内的任意数字。在一个实施方式中，适体和去甲氯胺酮之间的离解常数(Kd)是，例如10.6nM。换言之，适体和去甲氯胺酮之间具有高亲和性和高特异性。因此，本发明的适体适合于检测去甲氯胺酮。Kd可以通过领域内已知的任何工具来计算。在一个实施方式中，根据对平均荧光强度(MFI)相对于不同适体浓度进行制图而建立的受体-配体结合曲线来计算Kd。基于以下等式计算Kd，假设单址饱和(one-site saturation):
[0046]MFI= (BmaxX [适体])/ (Kd+[适体])
[0047]其中MFI为平均荧光强度；Bmax为最大MFI读数；[适体]为生物素化适体的浓度；Kd为离解常数。
[0048]特别地，因为本发明的适体通过化学合成而制备，例如，适体与抗体相比具有以下优点:不需要在细胞或动物内制备，因此制备简单、便宜且具有最小的批次差异；靶标可以是没有免疫源的毒素或分子，不受到生物体自身的毒性耐受度和免疫能力的影响；不容易被环境因素例如外部温度、湿度等影响，且可以长期存储(例如，数天、数周、数月)。此外，在一个实施方式中，适体的5’端可以用硫醇基、生物素、荧光标签、发光标签、酶或其他物质进行修饰，从而5’端可以与特定物质结合或具有例如发光的标记特性。其他方面包括，适体用发光标签(包括荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶)、荧光标签(异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、Cy3、和Cy5 )、或酶(包括碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP))进行修饰。
[0049]本发明还涉及去甲氯胺酮的检测方法。检测方法适合于检测样品中的去甲氯胺酮，并包括以下。提供本发明的适体。混合样品和适体，从而使去甲氯胺酮与适体结合而形成去甲氯胺酮-适体。之后，检测去甲氯胺酮-适体中的去甲氯胺酮或适体。在实施方式中，去甲氯胺酮的检测方法是基于荧光的方法等。此外，与常规的检测方法相比，这种去甲氯胺酮检测方法可以增加稳定性和便利度。换言之，在一个实施方式中，因为可以使用适体代替去甲氯胺酮抗体，因此本发明中的去甲氯胺酮检测方法可以是采用去甲氯胺酮抗体与抗原的结合原理的任何检测方法。例如，去甲氯胺酮经1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)结合到微球上。之后，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，将本文记载的适体与去甲氯胺酮涂覆的珠一起孵育。在室温下孵育一小时后，将形成适体-珠复合物。为检测复合物的存在，将适体-珠复合物与链霉亲和素-藻红蛋白结合物一起孵育，使用LumineX2003.1xPONENT系统检测表不为平均突光强度(MFI)的突光信号。
[0050]本发明涉及另一种去甲氯胺酮检测方法。检测方法适合于检测样品中的去甲氯胺酮，并包括以下。提供多个珠，且珠与去甲氯胺酮共价结合。将珠与样品混合，从而使珠上的去甲氯胺酮与生物素化的适体结合。之后，将链霉亲和素-藻红蛋白结合物加到与珠混合的样品中，从而使链霉亲和素-藻红蛋白结合物与生物素化适体结合。去除未结合的链霉亲和素-藻红蛋白 结合物。检测经生物素化适体结合至珠的链霉亲和素-藻红蛋白结合物。
[0051]在实施方式中，去甲氯胺酮的检测方法是，例如基于荧光的方法，其包括比如以下方法。将样品中的去甲氯胺酮涂覆在磁珠上，洗去过量的蛋白。在该步骤中，通过，例如修饰胺基，使去甲氯胺酮结合在磁珠上。之后，加入生物素化的适体。此处，如果样品包括去甲氯胺酮，则去甲氯胺酮与适体结合。接着，洗掉过多的适体，加入链霉亲和素-藻红蛋白结合物。在本文中，链霉亲和素-藻红蛋白结合物可以与生物素化的适体形成非共价键。之后，洗去未结合的链霉亲和素-藻红蛋白结合物，使用Luminex2003.1xPONENT系统检测荧光信号。在当前的实施方式中，因为适体和去甲氯胺酮具有高亲和性(纳摩尔级别)和高特异性，因此适体能够识别样品中的去甲氯胺酮。此外，作为DNA片段，适体不容易被环境因素例如外部温度、湿度等影响。即，本文的实施方式对于极端条件(例如，温度、湿度)更稳定，这使得它们更适合在极端环境中使用，在更长时间的运输和存储中更加稳定，因此提供比现有方法更一致的用途和性能。此外，由于DNA寡聚物的特性，适体稳定性高于抗体稳定性。此外，适体的高稳定性确保简单的操作和高质量的检测。因此，与领域内已知的现有方法相比，本实施方式中的去甲氯胺酮检测方法具有高灵敏度、高稳定性和高准确性。
[0052]在去甲氯胺酮检测或治疗目的中，相对于抗体使用，适体的使用具有若干优势。例如，由于DNA寡聚物的特性，适体的稳定性高于抗体的稳定性。适体的高稳定性确保简单的操作和高质量的检测。此外，当去甲氯胺酮适体作为药物载体或抑制剂(例如，结合部分)时，与抗体相比，不太可能引发免疫应答，因此使治疗的风险最小化。
[0053]应该注意到，尽管在上述的实施方式中，本发明的去甲氯胺酮应用在基于荧光的方法中作为示例，但本发明的去甲氯胺酮检测方法不限于此。换言之，本发明的适体具有对于去甲氯胺酮的高亲和性和高特异性，因此适体可以应用在检测去甲氯胺酮的任何检测方法中。特别地，因为本发明的适体可以代替去甲氯胺酮抗体，因此本发明的去甲氯胺酮检测方法可以在任何使用去甲氯胺酮抗体和抗原的结合原理的检测方法中采用。这些方法被领域内技术人员熟知。
[0054]本发明的适体应用在基于Luminex的方法中作为示例，去甲氯胺酮的检测方法并不限于此。特别地，本发 明的适体可以代替去甲氯胺酮抗体，例如，在其他荧光检定中，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光显微分析和流式细胞术；比色检定，例如ELISA、免疫化学染色和侧流分析；以及化学发光检定，包括蛋白质印迹和ELISA。
[0055]以下，提供数个实验来说明筛选本发明适体的方法，证实适体对去甲氯胺酮的高亲和性和特异性，并描绘本发明的去甲氯胺酮检测方法的实际应用。提供以下描述是为了具体说明本发明以让本领域技术人员实施，而不是用来限制本发明的范围。
[0056]实施例
[0057]实施例1:用于适体选择的寡核苷酸文库和去甲氯胺酮结合珠的制备
[0058]1.寡核苷酸的建立
[0059]寡核苷酸文库包括425类寡核苷酸。这些寡核苷酸由Sangon Biotech (上海，中国)有限公司合成，各自具有在SEQ ID N0:4中示出的72-mer核苷酸序列。72_mer核苷酸序列包括由25个核苷酸构成的随机序列(用η表不)、由23个核苷酸构成的5’引物区和由24 个核苷酸构成的 3’引物区:5，-GGG ACC ATG GAA TAA ACG CTG AA_[n]25_ATC AGC AGGAAG CTC GAG ACA GGC-3，(SEQ ID N0:4)。此处，n表示选自腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和鸟嘌呤(g)的核苷酸。5’引物区和3’引物区分别被设计成由GoTaq DNA聚合酶(Promega，USA)识别的核苷酸序列，以进行聚合酶链式反应(PCR)。之后，将合适量的寡核苷酸文库溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，以获得25微摩尔(uM)寡核苷酸文库储液待用。
[0060]2.去甲氯胺酮结合珠的制备
[0061]使用移液器移取60 微升(uL) Dynabeads M_270Epoxy (Cat.N0.143.02D,Invitrogen, USA)到 eppendorf 管中，将 eppendorf 管放置在磁铁(MagnaRack, Invitrogen,USA)中，由此Dynabeads M_270Epoxy被磁铁吸引，向磁铁移动并附着在eppendorf管的内壁。去除印pendorf管内不被磁场吸引的剩余物。用IOOuL的0.1摩尔(M)磷酸钠缓冲液漂洗Dynabeads M_270Epoxy,之后再将其重悬于60uL的3M硫酸铵中。向eppendorf管中加入60微克(ug)的去甲氯胺酮。之后将eppendorf管从磁铁移出，并置于室温下24小时，从而使去甲氯胺酮结合到Dynabeads M-270Epoxy,以形成去甲氯胺酮结合珠(称为珠A)。
[0062]之后,将eppendorf管放在磁铁内，从而使珠A被吸附到eppendorf管内壁。去除eppendorf管中不被磁场吸引的剩余物，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗珠A三次。接着，将珠A重悬于60uL PBS中并在4°C下存储。
[0063]实施例2:筛选对去甲氯胺酮具有亲和性的适体
[0064]使用(实验例I的)寡核苷酸文库或PCR产物进行以下的竞争测试。
[0065]将100微升的寡核苷酸文库或PCR产物与12uL的Dynabeads M_270Epoxy良好混合。接下来，将反应物在室温下孵育伴同搅动I小时。之后，使用磁铁收集剩余物并加到2uL~12uL的珠A中，在室温下孵育伴同搅动I小时。之后，用PBS清洗珠A三次。之后用以下示出的引物对(包 括正向引物Fl和反向引物Rl)并参照表US-00002中列出的反应条件，对珠A进行PCR反应。
[0066]表US-00001
[0067](SEQ ID NO:5)正向引物 Fl
[0068]5，-GGGACCATGGAATAAACGCTGAA-3，
[0069](SEQ ID NO:6)反向引物 Rl
[0070]5’-GCC TGT CTC GAG CTT CCT GCT GAT-3’
[0071]表US-00002PCR试剂体积(uL)的PCR内容物的反应条件
[0072]正向引物Fl (IOuM) 3UL
[0073]反向引物Rl (IOuM) 3UL
[0074]dNTPs (IOmM) 5uL
[0075]GoTaq DNA 聚合酶(5U/uL) 0.5uL
[0076]5X反应缓冲液20uL
[0077]MgCl2 (25mM) 15uL
[0078]去离子水加至IOOuL的总体积。
[0079]操作条件:95°C下变性2min ；14~24个以下循环:95°C下变性30秒(sec)、60°C下引物退火30sec以及72°C下延伸30sec ;最后在72°C保持lOmin。
[0080]为评定PCR产物的质量，通过在2.5%琼脂糖凝胶中进行电泳而分离从中得到的PCR产物。之后，琼脂糖凝胶用Gel-Red染色，并在GEImageQuant350成像系统下观察。
[0081]在完成PCR反应后就将PCR产物与珠A混合，以进行另一轮的竞争测试。重复竞争测试和PCR扩增15次。最后，收集最终产物来进行以下实验。
[0082]结果:图2示出在14轮竞争测试后从使用引物进行的PCR反应中得到的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。为获得最优扩增循环，在不同的PCR循环中收集PCR扩增子并进行凝胶电泳。使用2.5%的琼脂糖凝胶分离PCR扩增子并使用Gel-Red在GE ImageQuant350成像系统(GE Healthcare, USA)下可视化。第I道:DNA梯带；第2道:无模板对照?’第3道:阳性对照；第4~9道:分别为第14、16、18、20、22和24个PCR循环。bp:碱基对。如图2所示，有一个大小约72碱基对(bp)的特异条带。这表明，在14轮竞争测试后，我们分离出抗去甲氯胺酮的适体，其经以下测序实验(实验例3)证实为在适体池中是主要的。
[0083]实施例3:对去甲氯胺酮具有亲和性的适体的测序
[0084]使用(实验例2的)最终PCR产物来进行以下标记反应，以用于下一代测序。使用(实验例2的)最终PCR产物以及以下列出的引物对(包括正向引物F2和反向引物R2 )并参照表US-00004中列出的反应条件进行PCR反应。
[0085]表US-00003
[0086](SEQ ID N0:7)正向引物 F2
[0087]5， -CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTCATGGGGACCATGGAATAAACGCTGAA-3，
[0088](SEQ ID N0:8)反向引物 R2
[0089]5’ -CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATGCCTGTCTCGAGCTTCC-3’
[0090]表US-00004PCR试剂体积(uL)的PCR内容物的标记反应条件 [0091]正向引物F2 (IOuM) 2.5uL
[0092]反向引物R2 (IOuM) 2.5uL
[0093]dNTPs (IOmM) 2.5uL
[0094]GoTaq DNA 聚合酶(5U/uL) 0.25uL
[0095]5 X反应缓冲液IOuL
[0096]MgCl2 (25mM) 7.5uL
[0097]去离子水加到50uL的总体积。
[0098]操作条件:95°C下变性2min ; 13~22个以下循环:95°C下变性30秒(sec)、60°C下引物退火30sec以及72°C下延伸30sec ;最后在72°C保持lOmin。
[0099]根据制造商的操作指南,使用Minelute凝胶纯化试剂盒(Qiagen, USA)纯化所标记的PCR产物。纯化的产物进行下一代测序。
[0100]实施例4:适体对去甲氯胺酮的亲和性的评估
[0101]在本实验中，从实验例3筛选出的适体用Luminex2003.1xPONENT系统进行分析，从而根据去甲氯胺酮-适体的离解常数Kd来评估适体对去甲氯胺酮的亲和性。
[0102]首先，去甲氯胺酮结合在MagPlex微球上。使用移液器，移取50微升(uL)MagPlex微球(Cat.N0.MC10064-01, Luminex,USA, 1.25X IO7 微球 / 毫升(mL)的浓度)到 eppendorf管中，将eppendorf管放置在磁铁(MagnaRack, Invitrogen, USA)中，由此MagPlex微球被磁铁吸引，向磁铁靠近并附着在eppendorf管的内壁上。去除eppendorf管中没有被磁场吸引的剩余物。用IOOuL的0.01摩尔(M)氢氧化钠漂洗MagPlex微球，之后用IOOuL去离子水漂洗。将200微升的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC) (76mg/ml)加到eppendorf管中，并混合10分钟。除去过量的EDC,向eppendorf管中加入30微克(ug)的去甲氯胺酮并良好混合。之后将eppendorf管移出磁铁并放置在室温下60分钟，从而使去甲氯胺酮结合到MagPlex微球，形成去甲氯胺酮结合珠(称为珠B)。之后，将印pendorf管放置在磁铁内，从而使珠B被吸附到eppendorf管的内壁。去除eppendorf管中没有被磁场吸引的剩余物，将珠B用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗三遍。接下来，将珠B重悬在50uL的PBS中并放置在4 °C下存储。
[0103]为确定去甲氯胺酮与其适体之间的离解常数(Kd)，将珠B (5000微球)与指定量的生物素化适体(SEQ ID N0:USEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3)在室温下孵育I小时。珠B用200uL PBS清洗三遍，之后与链霉亲和素-藻红蛋白结合物(4ug/mL) —起孵育30分钟。珠B用200uL PBS清洗三遍，并重悬于125uL的PBS中。使用Luminex2003.1xPONENT系统测量荧光信号并表示为平均荧光强度。 [0104]结果:图3 是使用 Luminex2003.1xPONENT 系统(Millipore，USA)检测的，在指示的适体浓度下测量的受体-配体结合曲线。简单而言,MagPlex微球涂覆有去甲氯胺酮。之后，将微球与指示量的生物素化适体一起孵育。接着，加入链霉亲和素-藻红蛋白结合物，并检测经生物素化适体与珠结合的链霉亲和素-藻红蛋白结合物的量。A)SEQ ID N0:1,离解常数(Kd)为 70.6nM ；B) SEQ ID NO:2，Kd 为 10.6nM ；C) SEQ ID NO:3，Kd 为 134.6nM。示出的结果是平均荧光强度，收集100项的最小值。人类血清白蛋白用作阴性对照。如图3所示，抗去甲氯胺酮适体特异地识别去甲氯胺酮，使去甲氯胺酮与人类血清白蛋白区分开。两种适体的离解常数均在10.6nM~134.6nM的范围内，其中SEQ ID NO:2对去甲氯胺酮具有比SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3更高的结合亲和性。
[0105]总而言之，本发明的适体与去甲氯胺酮特异结合，并对去甲氯胺酮具有高亲和性。因而，本发明的适体可以广泛应用于去甲氯胺酮的检测方法和去甲氯胺酮结合技术的生物技术中。具体而言，因为本发明的适体制备简单、成本低、具有最小化的批次差异和存储稳定性，采用适体的去甲氯胺酮检测方法具有高灵敏度、高稳定性和高准确度，且可以用于疾病评估和预防的临床检查和学术研究中。
[0106]对于本领域技术人员显而易见的是，可以对所公开实施方式的结构做出多种修改和变化而不偏离本公开的范围或精神。基于以上，本公开意在涵盖所提供的本公开的修改和变型，它们落在所附权利要求及其等同物的范围内。
【权利要求】
1.一种与去甲氯胺酮特异结合的适体，包括以下核苷酸序列之一:
5’ -GAGGTGGGTGGGTGGGGCGGTTTTC-3’， (SEQ ID NO:1)
5’ -GAGGTGGGTGGGTGGGGCGTTGTTT-3’， (SEQ ID NO:2)
5’ -GAGGGGGGCGGGTGGGGCGTTATTC-3’， (SEQ ID NO:3)。
2.根据权利要求1所述的适体，其中所述适体与去甲氯胺酮之间的离解常数(Kd)为10.6 纳摩尔(nM)至 134.6nM。
3.根据权利要求1所述的适体，其5’端被硫醇基；生物素；发光标签，包括荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶；荧光标签，包括异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、Cy3和Cy5 ；或酶，包括碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)修饰。
4.根据权利要求1所述的适体，包括10~80个核苷酸。
5.一种用于检测样品中的去甲氯胺酮的检测方法，所述检测方法包括:提供权利要求1所述的适体；将所述样品与所述适体混合，从而使所述样品中的去甲氯胺酮与所述适体结合而形成去甲氯胺酮-适体复合物；以及检测所述去甲氯胺酮-适体复合物中的去甲氯胺酮或适体。
6.根据权利要求5所述的去甲氯胺酮的检测方法，其中所述适体被硫醇基；生物素；发光标签，包括荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶；荧光标签，包括异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、Cy3和Cy5 ;或酶，包括碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)标记。
7.—种去甲氯胺酮的检测方法，适合于检测样品中的去甲氯胺酮，所述检测方法包括:提供多个与去甲氯胺酮共价结合的珠；将所述珠与权利要求6所述的标记的适体混合，从而使所述珠上的去甲氯胺酮与所述标记的适体结合；向混合有所述珠的样品中加入链霉亲和素-藻红蛋白结合物，从而使所述链霉亲和素-藻红蛋白结合物与所述标记的适体结合；去除未结合的链霉亲和素-藻红蛋白结合物；以及检测经所述标记的适体与所述珠结合的链霉亲和素-藻红蛋白结合物。
8.根据权利要求7所述的去甲氯胺酮的检测方法，其中所述标记的适体被标记有生物素基标签。
9.一种适体-珠复合物，包括权利要求1所述的适体。
10.所述适体-珠复合物，还包括标签部分。
11.一种制备权利要求9所述的复合物的方法，包括将珠与权利要求1所述的适体混八口 ο
12.根据权利要求11所述的方法，还包括混合在链霉亲和素-藻红蛋白结合物中。
13.—种试剂盒，包括权利要求1所述的适体和用以检测去甲氯胺酮的说明书。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述适体与珠结合。
15.根据权利要求5所述的方法，还包括对检测到的去甲氯胺酮水平进行传达。
16.一种组合物，包括珠上的去甲氯胺酮、权利要求1所述的适体和链霉亲和素-藻红蛋白结合物。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述适体被生物素化。
【文档编号】C12N15/115GK103966223SQ201310294389
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年7月12日 优先权日:2013年1月30日
【发明者】梁修珀, 梁毓裕, 周润松 申请人:纳康科技有限公司