一种处理畜禽养殖污水的复合生物菌剂及其制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种处理畜禽养殖污水的复合生物菌剂及其制造方法，属于环境生物【技术领域】。本发明的微生物菌株为解淀粉芽孢杆菌IAE（BacillusamyloliquefaciensIAE）、棘孢木霉12（Trichodermaasperellum12）和苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）。本发明适用于污水排放量较大的畜禽养殖业的污水处理，能够通过微生物分解、絮凝大颗粒固体物质（包括蛔虫卵等有害生物）、杀灭蚊蝇的有害生物、减少臭气排放等方式处理养殖业污水。处理后的污水固体悬浮颗粒、COD显著降低，污水处理后作为液体有机肥或者清水混合灌溉用水能够有效的降低施用土壤的负载，减少对土壤的污染，有效缓解集约化养殖在一定时空产生高浓度污水导致周围土壤难以消纳的难题。
【专利说明】一种处理畜禽养殖污水的复合生物菌剂及其制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及处理畜禽养殖污水的复合生物菌剂及其制造方法，属于环境生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]我国畜禽养殖业发展迅速，在保障城乡畜禽产品供应、促进农民增收、活跃农村经济方面发挥了重要作用。随着畜禽养殖业不断发展，养殖污染物排放量也大幅增加，对区域环境安全构成威胁。根据污染源普查动态更新调查数据，2010年畜禽养殖业的化学需氧量、氨氮排放量分别达到1148万吨、65万吨，占全国排放总量的比例分别为45%、25%，畜禽养殖业主要水污染物排放量中化学需氧量、氨氮排放量分别为当年工业源排放量的3.23倍、
2.30 倍。
[0003]畜禽规模化养殖水平逐 步提高，2010年，全国生猪、蛋鸡和奶牛规模养殖比例分别达到65%、79%、47%，猪、牛、家禽年末存栏量分别达到约4.6亿头、1.1亿头、53.5亿只，肉类产量连续22年居世界第一，我国生猪、蛋鸡和奶牛优势省区猪肉、禽蛋和牛奶产量分别占全国总量的92%、68%、88%，海南、天津、北京、新疆、上海、青海、宁夏、西藏等省(区、市)生猪存栏量较低，均不到全国总存栏量的I %。
[0004]国内外对于是畜禽养殖业废弃物处理主要依靠土地利用消纳。但是大型的规模化养殖导致在特定时间和空间产生大量的废弃物，废弃物中包括大量的污水，无法长距离运输，废弃物排放量严重超过土地消纳能力，造成农田土壤污染，畜禽粪便中的氮磷等元素、饲料添加剂中的抗生素、激素、铜、铁、铬、锌等物质，长期在土壤中过量累积，导致土壤和地下水环境污染。研究表明，年出栏量10万头的养猪场，污染半径可达5公里，粉尘和气溶胶携带大量包括口蹄疫、猪肺疫、大肠埃希氏菌、炭疽、布氏杆菌、真菌孢子等病原微生物，恶臭、粉尘和微生物排放量远超过大气的自净能力，严重影响空气质量，污染人居环境和人体健康。
[0005]减少养殖企业周围土壤的污水消纳负荷，必须要减少污水中有机物的浓度和病原微生物数量，同时处理过程中减少臭气的排出。现有处理养殖污水的方法多为堆肥或者沼气发酵。堆肥方式处理需要大量地添加秸杆、草木灰、锯屑、泥炭等吸水物质，增加处理量和处理成本。沼气处理后，固体物质被厌氧消化成更小的物质，污水总量变化不大，但是沼渣固液分离困难，沼渣后续处理也是一大难题。因此，开发一种方法，使污水处理过程相较于常规方法，臭气、粉尘以及气溶胶量较少，孳生蚊蝇的有害生物量较少，处理后的污水，有机物浓度低，病原微生物数量少，可以直接作为液体有机肥或者清水混灌用水，十分迫切和必要。
[0006]三、
【发明内容】
发明的目的在于提供一种处理畜禽养殖业污水的复合生物菌剂，供集约化畜禽养殖污水处理应用。
[0007]一种畜禽养殖污水处理复合生物菌剂，其特征为复合生物菌剂含有解淀粉芽孢杆菌 IAE {Bacillus amy1liquefaciens IAE)
)、棘抱木霉12 (Trichoderma.asperellum 12)和苏云金芽抱杆菌(汉thuringiensis、；
其中所述的一株解淀粉芽抱杆菌I姐(Bacillus amy1 Ii quefaci ens Z4Z?)，于2013年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，保藏编号CCTCCNO:M 2013086，简称为解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086 ；
所述的一株棘抱木霉12(7>icAoofe/ma.asperellum 7J?),于2013年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，保藏编号CCTCC NO:M 2013213，简称为棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213。
[0008]上述解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086，其特征在于:用接种环从培养皿中挑取生长24h的该菌接种于装有100mL絮凝剂合成培养基的250ml三角瓶中，接种量IO4CfuInr1JTtMSOrpm培养60h，菌株合成微生物絮凝剂量21.8 g L'
[0009]上述解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086发酵所用培养液配制方法为，以配制 IL 培养液为例:葡萄糖 80g,谷氨酸钠 50g, (NH4)2SO4 8g，NaCl 5g，K2HPO4.3H20 2g，MnSO4.7H20 0.25g, MnSO4H2O 0.03 g，蒸馏水 1000ml，pH 值自然，115°C灭菌 30min。
[0010]上述棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213发酵生产方法为:棘孢木霉CCTCC NO:M2013213接种到培养液中培养，其培养条件为培养温度25°C、摇床转速120rpm、培养时间72小时，该菌株发酵液纤维素酶活力25.2 U πιm1。
[0011]上述所用培养液配制方法为(以配制IL培养基为例):用100 g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min，经过滤后滤液中加5g普通蔗糖和2g水稻秸杆粉，定容至1000 ml，pH 值自然，115°C灭菌 30 min。
[0012]用于生物防治蚊蚬的苏云金芽孢杆菌(汉菌株购自江苏生久农化有限公司，也可以向其他商业公司或者中国科学院微生物所、南京农业大学、河海大学等科研单位购买。菌株对苍蝇和蚊子具有生物防治作用，对于苍蝇杀灭率高于60%，对于蚊子杀灭率达80%，能够有效的抑 制污水中蚊蝇的孳生。
[0013]上述苏云金芽孢杆菌发酵液杀灭蚊蝇的测定方法为:苏云金芽孢杆菌接种到菌种培养基，进行培养，其条件为:摇床震荡170rpm，培养温度37°C，培养24小时，菌落形成单位^ IXlO9Cfu πιm1，菌液喷雾于养殖苍蝇和蚊子的广口瓶中，测定相较于喷无菌水处理，菌液喷雾处理蚊蝇的死亡率。
[0014]上述所用的液体培养基的配方为，按照IL培养基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自来水 1000ml, pH 范围 7.0-7.5，121°C灭菌 20min。
[0015]所述畜禽养殖污水处理的复合生物菌剂的制备，包括:1)将解淀粉芽孢杆菌CCTCCNO:M 2013086菌株接种到液体种子培养基，培养的条件为:摇床震荡170rpm，培养温度37°C，培养24小时，菌落形成单位> IXlO9Cfu πιm1 ;所用的液体种子培养基配方为，按照IL培养基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121°C灭菌20min ;将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086种子按照5%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:培养温度28~35°C，溶氧通气量范围为30~100%，15(T220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位> I X 109cfu ml—1，发酵低温液储存备用；所用的液体发酵培养基的配方为，按照IL培养基配制:葡萄糖80g，谷氨酸钠 50g, (NH4)2SO4 8g, NaCl 5g, K2HPO4.3H20 2g, MnSO4.7H20 0.25g, MnSO4H2O 0.03g，蒸懼水1000ml, pH值自然，115°C灭菌30min。
[0016]2)棘孢木霉 CCTCC NO:M 2013213 发酵生产，棘孢木霉 CCTCC NO:M 2013213 接种到PDA培养液中，进行液体种子培养，培养条件为:摇床震荡120rpm，培养温度25°C，培养72小时，菌落形成单位> 0.5X IO8Cfu ml-1;所用的液体的种子PDA培养基的配方为，按照IL培养基配制:用200g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min，用纱布过滤后，滤液加20 g普通蔗糖，定容至1000 ml，pH值自然，115°C灭菌30 min ;将棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213菌种子按照10%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:初始PH自然，培养温I扩22°C，溶氧通气量范围为30~100%，9(Tl70rpm,发酵中后期形成菌丝球用转速250rpm搅拌打碎成菌丝片段,发酵液棘孢木霉CCTCC NO:M 2013 213菌株的菌落形成单位≥0.5 X IO8Cfu ml—1，发酵液低温存贮备用；所用液体发酵培养液配制方法为 (以配制IL培养基为例):用100 g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min,经过滤后滤液中加5g普通鹿糖和2g水稻稻杆粉,定容至1000 ml,pH值自然，115°C灭菌30 min。
[0017]3)苏云金芽孢杆菌发酵液生产，苏云金芽孢杆菌接种到液体种子培养基，培养条件为:摇床震荡170rpm，培养温度37°C，培养24小时，菌落形成单位≥IXlO8Cfu ml-1 ;所用的液体的种子培养基的配方为，按照IL培养基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121°C灭菌20min ;将苏云金芽孢杆菌种子按照5%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:初始PH范围为
7.0~7.5，培养温度25~33°C，溶氧通气量范围为30~100 %，15(T220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位> IXlO9Cfu ml—1，发酵液储存备用。所用的液体发酵培养基的配方为，按照IL培养基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121°C 灭菌 20min。
[0018]4)将微生物发酵液菌种按照解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086:棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213:苏云金芽孢杆菌=10:8:1体积比例复合，用氢氧化钙调节PH值为
8.0-8.5，用搅拌机搅拌0.5^1小时让微生物菌体稳定和进入休眠状态。复合物在常温静置2小时，灌装，即为养殖业污水净化菌群。
[0019]所述处理养殖业污水菌群可用于养殖业污水存放处直接的喷施、混合或者结合工程措施添加，能够有效的降解污水中大分子物质、沉淀悬浮的各种微生物和固体颗粒物质、有效的抑制污水中孳生蚊蝇类有害生物，减少处理过程中臭气、气溶胶、粉尘的产生，使处理后的污水有机物浓度显著降低。
[0020]本发明提供一种能够处理养殖业污水的复合生物菌剂及其生产方法，通过对高产生物絮凝剂、高产纤维素酶以及具有高效生物杀灭蚊蝇的微生物高密度发酵，利用发酵液生产稳定复合菌剂，该菌剂处理养殖业污水快速、低成本、低环境污染，处理后污水有机物浓度显著降低，有利于在现代集约化畜禽养殖污水处理中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1污水处理池剖面图，其中I为污泥出口 ；2为处理池I ;3为栅格；4为处理池2 ；5为出水口。[0022]四、【具体实施方式】
实施例1 菌株获得
产生生物絮凝剂菌株的获得
采集自江苏沿海滩涂裸露滩涂中、零星生长的植株根际周围土壤低温保存，采用谷氨酸培养基分离生物絮凝剂即Y-多聚谷氨酸合成微生物菌株。筛选的标准为菌落在培养基上形成高的隆起，隆起物具有很强的粘性和吸水性的菌株。筛选液体发酵合成Y-多聚谷氨酸的能力最强菌株，获得菌株经过16s rDNA序列进化分析，鉴定属于解淀粉芽孢杆菌(Λamy1 H quefaci ens ) ?其合成生物絮凝剂量为21.8g L_\其生物学特征为:菌体呈杆状,染色均匀，具运动性，兼性厌氧，芽孢呈椭圆形，革兰氏染色阳性，培养基上菌落呈白色不透明菌落，边缘不规则，有隆起，表面裙皱。所述的解淀粉芽孢杆菌IAE Ul amy1liquefaciensIAE)于2013年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，保藏编号CCTCC NO:M 2013086，简称为解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086 ；
上述培养基的配方为，按照配制IL量配制:葡萄糖80g，谷氨酸钠50g，(NH4)2SO4 Sg,NaCl 5g，K2HPO4.3Η20 2g，MnSO4.7Η20 0.25g, MnSO4H2O 0.03 g，蒸馏水 1000ml，pH 值自然，115°C 灭菌 30min。
[0023]产生纤维素酶菌株获得
采集通气性较差土壤、滩涂粉砂质土 壤、潜水淤泥、已经有的真菌菌株等样品，低温保存，采用刚果红培养基分离真菌，水解圈较大的菌株保存备用。
[0024]上述刚果红培养基配制方法为(以配制IL培养基为例):羧甲基纤维素钠15g，蛋白胨5g，KH2P04 1.0g，MgS047H20 0.2g,NaCl 5g，刚果红0.2g，pH7.0，琼脂20g，自来水 1000ml。
[0025]产生纤维素酶菌株属于棘孢木霉(7:主要生物学特性为:在PDA培养基上28°C培养3天，菌丝可以布满整个培养皿，菌丝生长初期白色，毡状，由中心至边缘逐渐形成环状，靠近边缘环状菌丝颜色较浅，在靠近中心同心圆上产生稠密的暗绿色分生孢子，生长菌丝的培养皿散发出很重的椰汁芳香气味，背面深黄色；分生孢子梗对生生长，呈树状分枝，暗绿色，瓶梗短，基部变细，中间膨大；分生孢子呈球形，表面粗糙，大小为
3.5~5.0 μmΧ2.0~5.0 μM;该菌株发酵液纤维素酶活为25.2 U m-1 ；ITS序列进化分析显示该菌株为棘孢木霉(T1.asperellum)。该菌株于2013年5月16日保藏与中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，保藏编号CCTCCM2013213，简称为棘孢木霉 CCTCC NO:M 2013213。
[0026]杀灭蚊蝇的苏云金芽孢杆菌菌株获得
具有杀灭蚊蝇效果的苏云金芽孢杆菌市场上已经有十分成熟的商业产品，菌株购自江苏生久农化有限公司，杀灭蚊蝇效果通过验证，对于苍蝇杀灭率高于60%，对于蚊子杀灭率达80%，能够有效的抑制污水中蚊蝇的孳生。
[0027]上述苏云金芽孢杆菌发酵液杀灭蚊蝇的测定方法为:苏云金芽孢杆菌接种到菌种培养基，进行培养，其条件为:摇床震荡170rpm，培养温度37°C，培养24小时，菌落形成单位^ IXlO9Cfu m-1，菌液喷雾于养殖苍蝇和蚊子的广口瓶中，测定相较于喷无菌水处理，菌液喷雾处理蚊蝇的死亡率。
[0028]上述所用的液体培养基的配方为，按照IL培养基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自来水 1000ml, pH 范围 7.0-7.5，121°C灭菌 20min。
[0029]菌剂生产
解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086发酵生产，将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M2013086菌株接种到液体种子培养基，培养的条件为:摇床震荡170rpm，培养温度37°C，培养24小时，菌落形成单位> IXlO9Cfu πι1 ;所用的液体种子培养基配方为，按照IL培养基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g, NaCl IOg,自来水1000ml, pH范围7.0-7.5，121°C灭菌20min ;将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086种子按照5%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:培养温度28~35°C，溶氧通气量范围为30~100%，15(T220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位> I X 109cfu ml—1，发酵液储存备用；所用的液体发酵培养基的配方为，按照IL培养基配制:葡萄糖80g，谷氨酸钠50g, (NH4)2SO4 8g, NaCl 5g，K2HPO4.3H20 2g，MnSO4.7H20 0.25g, MnSO4H2O 0.03 g，蒸馏水1000ml, pH 值自然，115°C灭菌 30min。
[0030]棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213发酵生产，棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213接种到PDA培养液中，进行液体种子培养，培养条件为:摇床震荡120rpm，培养温度25°C，培养72小时，菌落形成单位> 0.5 X IO8Cfu πι1 ;所用的液体的种子PDA培养基的配方为，按照IL培养基配制:用200g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min，用纱布过滤后，滤液加20 g普通蔗糖，定容至1000 ml，pH值自然，115°C灭菌30 min ;将棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213菌种子按照10%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:初始PH自然，培养温19~22°C，溶氧 通气量范围为30~100%，9(Tl70rpm，发酵中后期形成菌丝球用转速250rpm搅拌打碎成菌丝片段，发酵液棘孢木霉CCTCC NO:M2013213菌株的菌落形成单位> 0.5X IO8Cfu πι1，发酵液低温存贮备用；所用液体发酵培养液配制方法为(以配制IL培养基为例):用100 g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min,经过滤后滤液中加5g普通鹿糖和2g水稻稻杆粉,定容至1000 ml,pH值自然，115°C灭菌 30 min。
[0031]苏云金芽孢杆菌发酵液生产，苏云金芽孢杆菌接种到液体种子培养基，培养条件为:摇床震荡170印111，培养温度371:，培养24小时，菌落形成单位≥1\109(^11 ml—1 ;所用的液体的种子培养基的配方为，按照IL培养基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自来水1000ml, pH范围7.0-7.5，121°C灭菌20min ;将苏云金芽孢杆菌种子按照5%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:初始PH范围为7.0-7.5，培养温度25~33°C，溶氧通气量范围为30~100%，150-220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位> IXlO9Cfu πι1，发酵液储存备用。所用的液体发酵培养基的配方为，按照IL培养基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g, NaCl IOg,自来水1000ml, pH范围7.0-7.5，121°C灭菌20min。
[0032]处理养殖污水复合菌群生产
将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086、棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213和苏云金芽孢杆菌发酵液按照10:8:1的体积比复合，采用氢氧化钙调节PH值至8.0-8.5之间，用搅拌机搅拌0.5^1小时让微生物菌体稳定和进入休眠状态。复合物在常温静置2小时，灌装密封，产品即为养殖污水处理菌群。
[0033]处理养殖污水菌群应用及其效果验证供试养殖污水:2000头养殖规模养猪场污水，日排污水量50~60m3,外界环境:气温22 ~35。。。
[0034]污水处理采用两个串联的水泥结构污水处理池，中间有栅格隔开；前一个污水处理池长X宽为500cmX 100cm,底部倾斜，进水口处水深200cm，出水口水深30cm，敞口，栅格厚度15cm，中间填充稻壳，第二个污水处理池长X宽X深为500cmX150cmX 200cm，两个串联处理池剖面如图1示意。
[0035]在第一个污水处理池的污水中喷施或者撒施复合生物菌剂，投加量为每天早晚各喷施3L菌剂，对照处理不使用复合生物菌剂，12小时后在测定栅格前IOcm深水体以及第二个污水处理池出水口水体C0D、蛔虫卵数量和大肠杆菌数量，采用蚊蝇黏贴纸测定第一个污水处理池单位面积产生的蚊蝇数量。
[0036]第一个污水处理池栅格处污水COD浓度、蛔虫卵数量、大肠杆菌数量测定结果显示如表1，应用复合生物菌剂处理水体COD浓度、蛔虫卵数量、大肠杆菌数量分别比对照低68%,81%和67%。复合生物菌剂的处理出水口污水水体COD浓度、大肠杆菌数量分别比对照低72%和82%，施用复合生物菌剂处理没有检测到大肠杆菌(表2)。施用复合生物菌剂处理，栅格出水较快，不容易堵塞。相较于对照处理，施用复合生物菌剂处理，单位面积蚊子和苍蝇数量分别下降50%和62% ；
表1处理池I污水指标
【权利要求】
1.一种畜禽养殖污水处理复合生物菌剂，其特征为复合生物菌剂含有解淀粉芽孢杆菌IAE (Bacillus amy1liquefaciens IAE)、棘抱木霉 12 (Trichoderma asperellum 12)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)； 其中所述的一株解淀粉芽抱杆菌IAE(Bacillus amy1liquefaciens IAE),于2013年3月15日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，保藏编号CCTCC NO:M 2013086，简称为解淀粉芽孢杆菌 CCTCC NO:M 2013086 ； 所述的一株棘抱木霉12 (Trichoderma asperellum 12),于2013年5月16日保藏于中国典型微生物囷种保减中心，保减地址为武汉市武昌洛咖山，保减编号CCTCC NO:M2013213，简称为棘孢木霉 CCTCC NO:M 2013213。
2.权利要求1所述一种畜禽养殖污水处理复合生物菌剂的制备方法，其特征在于按如下步骤实现: 1)将解淀粉芽孢杆菌CCTCCNO:M 2013086菌株接种到液体种子培养基，培养的条件为:摇床震荡170rpm，培养温度37°C，培养24小时，菌落形成单位≥IXlO9 cfu ml-1 ;所用的液体种子培养基配方为，按照IL培养基配制:牛肉膏3g,蛋白胨10g, NaCl IOg,自来水 1000ml,pH 范围 7.0-7.5，121°C灭菌 20min ;将解淀粉芽孢杆菌 CCTCC NO:M 2013086 种子按照5%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:培养温度28~35°C，溶氧通气量范围为30~100%，15(T220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位> IXlO9 cfu ml—1，发酵液低温储存备用；所用的液体发酵培养基的配方为，按照 IL 培养基配制:葡萄糖 80g，谷氨酸钠 50g, (NH4)2SO4 8g，NaCl 5g，K2HPO4.3H20 2g，MnSO4.7H20 0.25g, MnSO4-H2O 0.03 g，蒸馏水 1000ml，pH 值自然，115°C灭菌 30min ; 2)棘孢木霉CCTCCNO:M 2013213接种到PDA培养液中，进行液体种子培养，培养条件为:摇床震荡120rpm，培养温度25°C，培养72小时，菌落形成单位≥0.5X108 cfu ml—1 ;所用的液体的种子PDA培养基的配方为，按照IL培养基配制:用200 g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min,用纱布过滤后,滤液加20 g普通鹿糖,定容至1000 ml,pH值自然，115°C灭菌30 min ;将棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213种子按照10%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:初始PH自然，培养温19~22°C，溶氧通气量范围为30~100%，9(Tl70rpm，发酵中后期形成菌丝球用转速250rpm搅拌打碎成菌丝片段，发酵棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213菌株的菌落形成单位≥0.5X IO8 cfuml—1，发酵液低温存贮备用；所用液体发酵培养液配制方法为(以配制IL培养基为例):用100 g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min，经过滤后滤液中加5g普通蔗糖和2g水稻稻杆粉,定容至1000 ml, pH值自然，115°C灭菌30 min ； 3)苏云金芽孢杆菌接种到液体种子培养基，培养条件为:摇床震荡170rpm，培养温度37°C，培养24小时，菌落形成单位≥IXlO9 cfu ml-1 ;所用的液体的种子培养基的配方为，按照IL培养基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g, NaCl IOg,自来水1000ml, pH范围7.0-7.5，121°C灭菌20min ;将苏云金芽孢杆菌种子按照5%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:初始PH范围为7.0-7.5，培养温度25~331:，溶氧通气量范围为30~100%，150-220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位> IXlO9 cfuml—1，发酵液储存备用；所用的液体发酵培养基的配方为，按照IL培养基配制:牛肉膏3g，蛋白胨 10g, NaCl IOg,自来水 1000ml, pH 范围 7.0-7.5，121°C灭菌 20min ；. 4)将微生物发酵液菌种按照解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086:棘孢木霉CCTCCNO:M 2013213:苏云金芽孢杆菌=10:8:1体积比复合，用氢氧化钙调节PH值为8.0~8.5，后继续搅拌机搅拌0.5^1小时让微生物菌体稳定和进入休眠状态，复合物在常温静置2小时，灌装，即为一种畜禽养殖污水处理复合生物菌剂。
【文档编号】C12N1/20GK103937695SQ201310307851
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年7月22日 优先权日:2013年7月22日
【发明者】陈立华, 邵孝侯, 王为木, 陈丹, 李圆圆 申请人:河海大学