Snp标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了SNP标记及其应用。其中，该SNP标记为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第251位碱基T或C。本发明的SNP标记与斜带石斑鱼的全长性状紧密相关，能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种。
【专利说明】SNP标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及SNP标记及其应用。具体地，本发明涉及斜带石斑鱼全长性状相关的 SNP标记，用于检测前述SNP标记的引物对和试剂盒，前述SNP标记、引物对、试剂盒在斜带 石斑鱼选育中的用途，以及检测斜带石斑鱼全长性状的方法。
【背景技术】
[0002] 石斑鱼是名贵的海水经济鱼类。近十多年来，石斑鱼人工繁育技术已相对成熟，石 斑鱼的养殖规模也逐渐扩大，石斑鱼产业的迅速发展，对于促进渔民增收，满足国民水产品 需求，优化水产养殖业结构有重要意义。但是，种质退化，优良品种缺乏是石斑鱼产业可持 续健康发展的主要瓶颈。因此，培育石斑鱼优良新品种已成为我国石斑鱼产业发展的关键。
[0003] 传统的鱼类选育方法完全依赖于表型，存在周期长和效率低等无法逾越的障碍。 分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改 良选育物种的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分 子育种为鱼类育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在鱼类育种 中的作用将日益突出。在石斑鱼的育种中，人们希望通过对于生长性状密切相关，并且与数 量性状紧密连锁的DNA标记的选择，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而取得 更大的遗传进展。
[0004] 然而，现阶段能够有效用于石斑鱼育种的生长性状相关的分子标记仍有待挖掘。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种与石斑鱼生长性状相关，能够有效用于石斑鱼选育的SNP标记。
[0006] 其中，需要说明的是，SNP (single nucleotide polymorphism，SNP，即单核苷酸多 态性）是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子 遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现 出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。
[0007] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种斜带石斑鱼全长性状相关的SNP标 记。根据本发明的实施例，该SNP标记为SEQ ID NO :1所示核苷酸序列自5'端起第251位 碱基T或C。根据本发明的实施例，SEQ ID N0:1所示核苷酸序列如下：AGGTCCTTCACAAAGC CGTCACCGTCCACTGACACCACATACGTCACTGGAGCTGTTGCATTCTTGGAGCAGAGATGAGGCATCCCAACACCG TGCTCCACATCTACGCAAACCCAGGATGAAGTTTTCTCCAAATACACCTCCAACCACTCGTCCGCCCCAGGCCCCTC CTTCTTTTTCCCACCCCGCTTTGTTGTGTTACTTGTTGTTACTTCTTCCTCATCATCTTCCTCTTGCTCTTCGCCCT CCTYGTCTTTCAACTGTTTCTTCCCTCCACTGCTCCTCCTCTTCGAAGCTGCAGTGTTCTTGCTCGTCCCTTTCCCC TTCTTCCCCTTTGTGGATTTAGCCCCTCCCTCTGAATCCTCACTGTCCTCGTCGCTTGTTGCCTGAAACTCCTCATC ACTAAGCCCCTCCTCCTCCTGTTCCCCTTCGCTGTTACTTTCTTCCTTGTAGCTGACTTTTGAGGCGATGCTGCGAC G(SEQ ID NO ：1) 〇
[0008] 发明人发现，该SNP标记的位点处基因型为纯合TT的斜带石斑鱼的全长显著高于 此处基因型为纯合CC或杂合TC的斜带石斑鱼。进而，根据本发明的实施例，通过检测斜带 石斑鱼的上述SNP，能够有效地确定其全长性状，具体地，如前所述，该SNP位点为纯合TT的 斜带石斑鱼的全长显著高于此处基因型为纯合CC或杂合TC的斜带石斑鱼，例如该SNP位 点的基因型为TT时，则能够确定待测斜带石斑鱼的属于生长速度快的个体。由此，发明人 确定，本发明的SNP标记与斜带石斑鱼的全长性状紧密相关，能够有效用于斜带石斑鱼的 分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种需求选择生长速度对斜带石斑鱼育种材料进行 早期选择，进一步能够有效提高育种的效率和准确性，提高斜带石斑鱼繁殖群体的遗传水 平，从而能够准确、高效地选育出斜带石斑鱼优良品种。此外，根据本发明的一些实施例，利 用本发明的SNP标记进行斜带石斑鱼分子标记辅助育种，具有早期筛选、节省时间、成本低 廉、准确性高的优点。
[0009] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的本发明的SNP 标记的引物对。根据本发明的实施例，所述引物对具有SEQ ID NO :2-3所示的核苷酸序列。 具体地，本发明的引物对的序列如下所示：
[0010] 上游引物：AGGTCCTTCACAAAGCCGTCAC(SEQ ID NO :2);
[0011] 下游引物：CGTCGCAGCATCGCCTCAAA(SEQ ID NO :3)。
[0012] 根据本发明的实施例，利用本发明的引物对能够有效地对待测斜带石斑鱼的上述 与全长性状相关的SNP标记所在的片段进行PCR扩增，进而通过测序能够有效实现对该SNP 标记的检测，确定待测斜带石斑鱼该SNP标记位点的基因型，进而能够有效确定待测斜带 石斑鱼的全长性状。具体地，该SNP标记位点处基因型为纯合TT的斜带石斑鱼的全长显著 高于此处基因型为纯合CC或杂合TC的斜带石斑鱼，例如该SNP位点的基因型为TT时，则 能够确定待测斜带石斑鱼的属于生长速度快的个体。由此，用于检测前面所述的本发明的 SNP标记的引物对，能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现 短时间、低成本、高准确性地选育斜带石斑鱼优良品种。
[0013] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的SNP标记的试 齐?盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含：前面所述的用于检测本发明的SNP标记的引物 对。即本发明的试剂盒中包含具有SEQ ID NO :2-3所示的核苷酸序列的引物对。根据本发 明的实施例，利用本发明的试剂盒中所包含的引物对，能够有效实现对待测斜带石斑鱼的 上述与全长性状相关的SNP标记的多态性检测，确定待测斜带石斑鱼该SNP标记位点的基 因型，进而能够有效确定待测斜带石斑鱼的全长性状。具体地，该SNP标记位点处基因型为 纯合TT的斜带石斑鱼的全长显著高于此处基因型为纯合CC或杂合TC的斜带石斑鱼，例如 该SNP位点的基因型为TT时，则能够确定待测斜带石斑鱼的属于生长速度快的个体。由此， 本发明的用于检测前面所述的本发明的SNP标记的试剂盒，能够有效用于斜带石斑鱼的分 子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育斜带石斑鱼优良 品种。
[0014] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的本发明的SNP标记、引物对 或试剂盒，在斜带石斑鱼选育中的用途。如前所述，通过能够用于检测本发明的与斜带石斑 鱼全长性状相关的SNP标记的试剂例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，能够有 效地检测确定待测斜带石斑鱼的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效 确定待测斜带石斑鱼的全长性状，从而能够有效辅助斜带石斑鱼选育。
[0015] 进而，根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种检测斜带石斑鱼全长性状的 方法。根据本发明的实施例，该方法通过对待测斜带石斑鱼进行前面所述的SNP标记的检 测，确定所述待测斜带石斑鱼的全长性状。具体地，可以通过能够用于检测本发明的与斜带 石斑鱼全长性状相关的SNP标记的试剂例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，对 待测斜带石斑鱼进行PCR扩增、测序，以便检测确定待测斜带石斑鱼的上述SNP标记的基因 型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测斜带石斑鱼的全长性状。其中，如前所述，该 SNP标记位点处基因型为纯合TT的斜带石斑鱼的全长显著高于此处基因型为纯合CC或杂 合TC的斜带石斑鱼，例如当该SNP位点的基因型为TT时，则待测斜带石斑鱼的属于生长速 度快的个体。由此，本发明的检测斜带石斑鱼全长性状的方法，能够快速、高效、准确地检测 斜带石斑鱼全长性状，进而能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种，从而能够辅助 早期实现短时间、低成本、高准确性地选育斜带石斑鱼优良品种。
[0016] 另外，根据本发明上述实施例的检测斜带石斑鱼全长性状的方法还可以具有如下 附加的技术特征：
[0017] 根据本发明的实施例，对待测斜带石斑鱼进行SNP标记检测的方法不受特 别限制。测序、单链构象多态性聚合酶链式反应（PCR single strand conformation po Iymorphi sm，PCR-SSCP )、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（PCR-restriTCion fragment length polymorphism, PCR-RFLP)及飞行时间质谱等技术均可以实现SNP的检 测。其中，测序是一种准确性最高、灵活性强，通量大、检测周期短的检测技术。只需在SNP 位点的两侧设计一对引物，扩增200-1000bp的产物，再通过测序即可直接检测SNP位点的 基因型。因而，本发明采用测序的方法进行SNP标记检测。根据本发明的一些具体示例，通 过对待测斜带石斑鱼进行前面所述的SNP标记的检测，确定所述待测斜带石斑鱼的全长性 状，进一步包括：提取待测斜带石斑鱼的基因组DNA ;利用前面所述的引物对，将所述待测 斜带石斑鱼的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行 测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测斜带石斑鱼的所述SNP标记的 基因型；以及基于所述待测斜带石斑鱼的所述SNP标记的基因型，确定所述待测斜带石斑 鱼的全长性状。由此，能够有效提高检测斜带石斑鱼全长性状的效率。
[0018] 根据本发明的实施例，提取待测斜带石斑鱼的基因组DNA的方法不受特别限制， 可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。根据本发明的一些具体示例，采 用常规酚氯仿方法抽提待测斜带石斑鱼的基因组DNA。由此，能够有效获得质量好、纯度高 的基因组DNA，便于后续步骤进行。
[0019] 根据本发明的实施例，将所述待测斜带石斑鱼的基因组DNA进行PCR扩增的条 件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，该PCR扩增的扩增体系以25 μ 1计为： 50-100ng/y 1 的模板 DNAl μ 1，lOpmol/μ 1 的 SEQ ID NO :2-3 所示的上下游引物各 1 μ 1， lOmmol/L 的 dNTP π?χ2·0μ1，5υ/μ1 的 Taq DNA 聚合酶 0.125yl，10XPCR 反应缓冲液 2. 5 μ 1，余量为双蒸水；该PCR扩增的反应条件为：94°C 5分钟；94°C 30秒，53°C 30秒， 72°C 30秒，30个循环；72°C 5分钟。由此，能够快速、高效、准确地扩增本发明的SNP标记 所在的片段，获得目标扩增产物，便于后续步骤的进行。
[0020] 根据本发明的实施例，对所述PCR扩增产物进行测序的方法不受特别限制，只要 能够有效获得PCR扩增产物即SNP标记所在的片段的序列即可。根据本发明的一些具体示 例，可以采用选自HISEQ2000、S0LiD、454和单分子测序方法的至少一种对所述PCR扩增产 物进行测序。由此，能够高通量、快速、高效、准确地获得测序结果。
[0021] 根据本发明的实施例，基于测序结果，通过比对石斑鱼参考基因组序列，能够有效 确定待测斜带石斑鱼的所述SNP标记的基因型为TT、CC还是TC。
[0022] 根据本发明的实施例，所述SNP标记的TT基因型个体的全长显著高于CC和TC基 因型个体。即本发明前面所述的SNP标记与斜带石斑鱼的全长性状紧密相关。由此，基于 确定的待测斜带石斑鱼的该SNP标记的基因型，能够准确有效地确定待测斜带石斑鱼的全 长性状即生长速度性状，例如该SNP位点的基因型为TT时，则待测斜带石斑鱼的属于生长 速度快的个体。进而本发明的方法能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种，从而能 够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育斜带石斑鱼优良品种。
[0023] 需要说明的是，本发明的与斜带石斑鱼全长相关的SNP标记及其应用具有如下优 占·
[0024] (1)本发明提供的SNP标记不受斜带石斑鱼的年龄、性别等限制，可用于斜带石斑 鱼的早期选育，可显著促进斜带石斑鱼的育种进程；
[0025] (2)检测斜带石斑鱼如SEQ ID NO. 1所示自5'端起第251位SNP位点的方法，准 确可靠，操作方便；
[0026] (3)斜带石斑鱼如SEQ ID NO. 1所示自5'端起第251位的SNP位点的检出，为斜 带石斑鱼生长性状的标记辅助选择提供了科学依据。
[0027] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中 ：
[0029] 图1显示了根据本发明一个实施例，本发明的SNP标记位点处CC、TC和TT三种基 因型的测序峰图。
【具体实施方式】
[0030] 下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅 用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0031] 实施例1与斜带石斑鱼全长相关的SNP标记的获得
[0032] I. 1斜带石斑鱼群体的获得
[0033] 所采用的群体为海南某石斑鱼养殖场2010年11月10日孵化的斜带石斑鱼，2010 年12月10日，15, 000尾鱼苗被转移至一个网箱继续饲养。2011年8月8日，从该网箱随 机选出199个个体，剪取鱼体背鳍鳍条于95%乙醇-20°C保存，用于基因组DNA提取。
[0034] 1 · 2斜带石斑鱼基因组DNA提取
[0035] 本试验采用常规酚氯仿方法抽提斜带石斑鱼鳍条中的基因组DNA，具体步骤如 下：
[0036] (I)取0· 3?0· 5g鳍条于I. 5ml Eppendorf管中，剪碎，在超净工作台上开盖干燥 20min ；
[0037] (2)待乙醇基本挥发后，TE 缓冲液（lOmmol/ml Tris、lmmol/ml EDTA、SDS5%， ρΗ=8· 0)洗涤 1 ?2 次，再加入 600μ I DNA 抽提液（0· OOlmol/L Tris-Cl、0. lmol/L EDTA、 SDS5%，pH=8. 0)和 3μ I 蛋白酶 k (200mg/ml)，55°C水浴消化 3h 左右，前 30min 每 IOmin 轻 摇离心管1次，消化至管内液体澄清；
[0038] (3)加入自配酚氯仿溶液(酚：氯仿：异戊醇=25 :24 :1)600 μ 1，轻轻来回颠倒离心 管lOmin，12000r离心10min。取上层水相用等体积上述酚氯仿再抽提，直至水相与有机相 之间没有白色沉淀；
[0039] (4)再用氯仿抽提1次，取出上清液，加入2倍体积已预冷的无水乙醇沉淀DNA， 颠倒混匀，4°C静置30min，12000r离心lOmin，沉淀再用70%乙醇洗涤，离心晾干沉淀后加 50 μ 1无菌水溶解。4°C保存备用或_20°C长期保存。
[0040] 1. 3采用基因组重测序获得斜带石斑鱼全长相关的SNP标记
[0041] 基于Hiseq2000高通量测序平台，对上述的199个个体进行重测序，产生0. 5G左 右的数据量，平均覆盖〇. 5X的斜带石斑鱼基因组。同时还对这199个个体进行全长等生长 性状表型鉴定。采用PLINK软件，基于Mixed Liner模型进行GWAS分析，从7. 5万个SNP 中找到了一个与全长相关的SNP位点。该SNP位点位于SEQ ID NO :1所示序列的251bp位 点处，在SEQ ID NO: 1序列中用Y表示该处位点，且此处位点的碱基为T或C。该位点处基 因型为纯合TT的斜带石斑鱼的全长显著高于此处基因型为纯合CC或杂合TC的斜带石斑 鱼。
[0042] 实施例2与斜带石斑鱼全长相关的SNP标记的测序验证与应用
[0043] 2. 1提取待测斜带石斑鱼鳍条中的基因组DNA
[0044] 待测斜带石斑鱼来自实施例1中的斜带石斑鱼群体，随机选取70尾鱼，按照实施 例1中所述的DNA提取方法抽提基因组DNA。
[0045] 2. 2扩增含SNP位点的核苷酸片段
[0046] 以前述提取获得的各待测斜带石斑鱼的基因组DNA为模板，利用正 向引物 F:5'-AGGTCCTTCACAAAGCCGTCAC-3'（SEQ ID N0:2)和反向引物 R: 5'-CGTCGCAGCATCGCCTCAAA-3'（SEQ ID N0:3)，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段。其中， ?〇?反应体系以25 4 1计为：50-100叩/^1模板0嫩1以1，10?111〇1/^1引物？和1?各14 1， lOmmol/L dNTP π?χ2·0μ1，5υ/μ1 Taq DNA聚合酶0.125yl，10XPCR反应缓冲液2·5μ1， 余量为双蒸水；PCR反应条件为：94°C 5分钟；94°C 30秒，53°C 30秒，72°C 30秒，30个循环； 72 °C 5分钟。
[0047] 2. 3测序识别SNP位点基因型
[0048] 将上述步骤中获得的各PCR扩增产物于ABI3730测序仪上进行单向测序，识别SEQ ID N0:1序列中251bp处（即本发明的SNP标记）的基因型。其中，CC、TC和TT三种基因型 的测序峰图如图1所示。70个待测斜带石斑鱼个体该SNP位点的基因型及其全长如下表1 所示。
[0049] 70个个体该SNP位点的基因型及其全长
[0050]
【权利要求】
1. 一种斜带石斑鱼全长性状相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记为SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列自5'端起第251位碱基T或C。
2. 根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的TT基因型个体的全 长显著高于CC和TC基因型个体。
3. -种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的引物对，其特征在于，所述引物对具 有SEQ ID NO : 2-3所示的核苷酸序列。
4. 一种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于，包含：权利要 求3所述的引物对。
5. 权利要求1或2所述的SNP标记、权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试 剂盒，在斜带石斑鱼选育中的用途。
6. -种检测斜带石斑鱼全长性状的方法，其特征在于，通过对待测斜带石斑鱼进行权 利要求1或2所述的SNP标记的检测，确定所述待测斜带石斑鱼的全长性状。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过对待测斜带石斑鱼进行权利要求1或 2所述的SNP标记的检测，确定所述待测斜带石斑鱼的全长性状，进一步包括： 提取待测斜带石斑鱼的基因组DNA ; 利用权利要求3所述的引物对，将所述待测斜带石斑鱼的基因组DNA进行PCR扩增，以 便获得PCR扩增产物； 对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果； 基于所述测序结果，确定所述待测斜带石斑鱼的所述SNP标记的基因型；以及 基于所述待测斜带石斑鱼的所述SNP标记的基因型，确定所述待测斜带石斑鱼的全长 性状。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述SNP标记的TT基因型个体的全长显 著高于CC和TC基因型个体。
【文档编号】C12Q1/68GK104419705SQ201310411231
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】游欣欣, 石琼, 张勇, 杨成业, 阮志强, 束礼平, 蒙子宁, 陈国华, 林浩然 申请人:深圳华大基因研究院, 中山大学, 海南大学, 深圳华大水产科技有限公司