一种抑制多功能蛋白聚糖1表达的siRNA及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种抑制多功能蛋白聚糖1（Versican1，V1）表达的siRNA，所述siRNA序列如下：正义链：5′-GAGGCUGGAACUGUUAUUATT-3′，反义链：5′-UAAUAACAGUUCCAGCCUCTT-3′。本发明提供的抑制多功能蛋白聚糖1表达的siRNA，能够特异性抑制和下调多功能蛋白聚糖1的表达，有效促进肺成纤维细胞弹性蛋白的沉积，并且具有长期作用的特点，符合COPD的疾病特点。
【专利说明】—种抑制多功能蛋白聚糖1表达的SiRNA及其应用【技术领域】
[0001]本发明涉及一种siRNA，尤其涉及一种抑制多功能蛋白聚糖I表达的siRNA及其应用。
【背景技术】
[0002]慢性阻塞性肺疾病(ChronicObstructive Pulmonary Disease, C0PD)是一种常见、多发、高致残性和高致死性的慢性呼吸系统疾病。COPD患者典型的肺实质破坏表现为小叶中央型肺气肿，其导致的气流阻塞是器质性和永久性的改变，现有治疗方法并不能有效预防及逆转已经发生的肺组织破坏和肺功能损害。作为维持组织弹性和呼吸周期中肺泡正常开放和回缩的主要成分，弹性蛋白破坏是肺气肿的主要原因。CN102499925A公开了一种中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，其活性成分为具有五环三萜结构的化合物，通过抑制弹性蛋白酶来减少弹性蛋白的降解，从而缓解肺气肿等疾病。CN1201730A公开了用RAR选择性视黄醛衍生物激动剂治疗肺气肿，通过促进弹性蛋白原基因表达，来达到治疗肺气肿的目的。但是目前还没有有效促进肺组织弹性蛋白生成并有序沉积的有效方法。
[0003]多功能蛋白聚糖I (Versicanl, VI)是一种富含硫酸软骨素(chondroitinsulfate, CS)的蛋白多糖,可通过形成局部高CS浓度而促进弹性蛋白原脱落来抑制弹性蛋白生成。在皮肤以及动脉平滑肌细胞的研究中发现Vl高表达可抑制弹性蛋白形成。但是肺组织结构特殊，不同于皮肤及动脉；而且COPD是一个慢性疾病，吸烟及空气污染是其重要的危险因素，目前缺乏特异性抑制Vl达到修复烟草所致的弹性蛋白受损的方法。
[0004]近年来,利用RNA干扰技术,将化学合成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转导至特定的细胞，沉默相关基因的表达，是研究基因功能最有效的手段之一，使用RNAi治疗疾病的思路是根据病原体的致病基因序列以及生物体内与疾病发生相关的基因序列，设计和制备与这些基因序列具有同源性的小干扰RNA (siRNA)，然后通过某种方式将siRNA转移到动物体内使有关疾病基因发生沉默，从而达到治疗的目的。其优势在于只抑制疾病相关蛋白的表达，而不损伤正常细胞功能，其序列特异性及基因抑制作用的强大性是其他药物难以匹敌的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服上述不足，提供一种特异性抑制Vl表达的siRNA，本发明的另一目的在于提供上述siRNA的应用。
[0006]本发明的第一个方面是提供一种抑制多功能蛋白聚糖I (Versicanl, VI)表达的siRNA,所述siRNA序列如下:
[0007]正义链:5'-GAGGCUGGAACUGUUAUUATT-3'，
[0008]反义链:5'-UAAUAACAGUUCCAGCCUCTT-3'。
[0009]本发明的第二个方面是提供一种低表达多功能蛋白聚糖I的肺成纤维细胞，所述肺成纤维细胞携带有权利要求1所述的siRNA。[0010]本发明的第三个方面是提供一种构建上述低表达多功能蛋白聚糖I的肺成纤维细胞的方法，通过脂质体转染法将权利要求1所述的SiRNA转染至肺成纤维细胞中，即得。
[0011]在一个优选的实施方式中，所述脂质体转染法中使用的脂质体为脂质体TM2000。
[0012]在一个优选的实施方式中，所述肺成纤维细胞为经受烟草刺激的肺成纤维细胞。
[0013]本发明的第四个方面是提供上述抑制Vl的siRNA在在制备促进肺成纤维细胞弹性蛋白修复的药物或材料中的应用。
[0014]本发明的第五个方面是提供上述抑制Vl表达的siRNA在制备治疗肺气肿药物或材料中的应用。
[0015]本发明提供的抑制多功能蛋白聚糖I表达的siRNA，能够特异性抑制和下调多功能蛋白聚糖I的表达，有效促进肺成纤维细胞弹性蛋白的沉积，并且具有长期作用的特点，符合COPD的疾病特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明提供的siRNA转染肺成纤维细胞后Vl表达结果图，图A为VlmRNA相对表达水平图，图B为Vl和弹性蛋白检测结果图；
[0017]图2为检测本发明提供的siRNA对烟草所致的肺成纤维细胞弹性蛋白丧失的影响的流程图，图A为弹性蛋白mRNA检测结果图，图B为上清液中可溶性弹性蛋白含量检测结果图，图C为弹性蛋白沉积量检测结果图，*ρ〈0.01，#p<0.001 ；
[0018]图3为烟草对CCL-210人肺成纤维细胞系合成弹性蛋白原以及弹性蛋白沉积的影响结果图；
[0019]图4为本发明提供的siRNA对烟草所致的CCL-210人肺成纤维细胞弹性蛋白沉积的影响结果图。
【具体实施方式】
[0020]下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的描述，以更好地理解本发明。
[0021]一、本发明提供的抑制多功能蛋白聚糖I表达的SiRNA对正常肺成纤维细胞中多功能蛋白聚糖I的表达和弹性蛋白沉积的影响
[0022]1、多功能蛋白聚糖I (Versicanl, VI) siRNA革巴位点序列及其转染。
[0023]设计并合成VlsiRNA靶位点序列为:
[0024]正义链:5'-GAGGCUGGAACUGUUAUUATT-3'，
[0025]反义链:5'-UAAUAACAGUUCCAGCCUCTT-3'。
[0026]采用脂质体Lipofectamin TM2000进行转染。具体转染步骤如下:
[0027](I)使用无抗生素的培养基将正常肺成纤维细胞培养于24孔培养板中，37°C，5%C02，培养箱内培养；
[0028](2)当细胞铺满90-95%的孔底面积是，先吸去培养基，然后用无菌的PBS洗一次，然后加入5ml无血清培养基。
[0029](3)脂质体Lipofectamin TM2000使用之前先轻轻摇匀。按每孔I μ I脂质体对50μ I培养基的比例，计算好用量后将脂质体加入到不含血清与抗生素的F-12K培养基中，轻摇混匀后室温静置5min。
[0030](4)按每孔20pmol对50 μ I培养基的比例，计算好用量后将siRNA加入到不含血清和抗生素的F-12K培养基中，轻摇混匀后室温静置5min。
[0031](5) siRNA溶液与脂质体混和均匀，室温静置20min。
[0032](6)24孔培养板上的细胞弃去培养基，用PBS (pH=7.4)洗涤细胞1_2次。每孔细胞加100 μ I SiRNA/脂质体混合物，轻轻摇晃混匀后，置于细胞培养箱37°C、5%C02条件下培养4-6h。
[0033](7)取出培养板，小心吸去DNA/脂质体混合物，每孔加500 μ I新鲜的含10%血清F-12K培养基，37°C、5%C02继续培养24h后，收集细胞加入裂解液，测定Vl的RNA和弹性蛋白含量，结果如图1所示。结果表明，本发明提供的siRNA能有效特异性抑制肺成纤维细胞内源性Vl的合成分泌。
[0034]二、本发明提供的抑制多功能蛋白聚糖I表达的siRNA对烟草所致的肺成纤维细胞弹性蛋白丧失的影响
[0035]如图2所示，设计针对Vl的祀位点siRNA序列，用脂质体Lipofectamin TM2000法转染CCL-210人肺成纤维细胞系。在以烟草刺激复制而成的COPD弹性蛋白减少体外模型中应用本发明涉及的VlsiRNA加以干预并观察效果。
[0036]1、香烟提取物的制备及体外COPD模型的复制:
[0037]将I 支科研用香烟2R1的燃烧烟雾溶于5ml不含血清的DMEM培养液，调整pH值至pH7.4，0.22 um滤菌器除菌，工作浓度为1%和10%。检测经受烟草刺激的肺成纤维细胞中弹性蛋白原及弹性蛋白沉积情况，结果如图3所示，结果表明，烟草能够抑制弹性蛋白原mRNA表达，刺激14天时弹性蛋白原(即可溶性弹性蛋白)和弹性蛋白沉积(即弹性蛋白原单体组装成不可溶性弹性蛋白)均显著下降。
[0038]2、设计并合成VI靶位点的s i RNA序列为:
[0039]正义链:5'-GAGGCUGGAACUGUUAUUATT-3'，
[0040]反义链:5'-UAAUAACAGUUCCAGCCUCTT-3'。
[0041]3、siRNA 的转染:
[0042](I)使用无抗生素的培养基将细胞培养于24孔培养板中，37°C，5%C02,培养箱内培养;
[0043](2)当细胞铺满90-95%的孔底面积。先吸去培养基，然后用无菌的PBS洗一次，然后加入5ml无血清培养基。
[0044](3)脂质体Lipofectamin TM2000使用之前先轻轻摇匀。按每孔I μ I脂质体对50μ I培养基的比例，计算好用量后将脂质体加入到不含血清与抗生素的F-12K培养基中，轻摇混匀后室温静置5min。
[0045](4)按每孔20pmol对50 μ I培养基的比例，计算好用量后将siRNA加入到不含血清和抗生素的F-12K培养基中，轻摇混匀后室温静置5min。
[0046](5) siRNA溶液与脂质体混和均匀，室温静置20min。
[0047](6)24孔培养板上的细胞弃去培养基，用PBS (pH=7.4)洗涤细胞1_2次。每孔细胞加100 μ I SiRNA/脂质体混合物，轻轻摇晃混匀后，置于细胞培养箱37°C、5%C02条件下培养4-6h。[0048](7)取出培养板，小心吸去DNA/脂质体混合物，每孔加500 μ I新鲜的含10%血清F-12K培养基，37°C、5%C02继续培养24h后，收集细胞加入裂解液。
[0049]检测弹性蛋白原mRNA表达、弹性蛋白原(soluble elastin)和弹性蛋白(insoluble elastin)的浓度,结果如图4所示:本发明提供的siRNA能够显著改善香烟刺激导致的弹性蛋白沉积减少(图4B)，但并不改善弹性蛋白原的合成和分泌(图4A)。这说明Vl在烟草所致的弹性蛋白丧失中是从抑制分泌后加工起作用的，应用Vl靶位点siRNA序列特异性抑制其表达能够促进弹性蛋白沉积，并且这种效应只有作用一定时间后才显现，而非短期效应。
[0050]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【权利要求】
1.一种抑制多功能蛋白聚糖I表达的SiRNA,其特征在于,所述SiRNA序列如下: 正义链:5, -GAGGCUGGAACUGUUAUUATT-3,， 反义链:5' -UAAUAACAGUUCCAGCCUCTT-3'。
2.—种低表达多功能蛋白聚糖I的肺成纤维细胞，其特征在于，所述肺成纤维细胞携带有权利要求1所述的siRNA。
3.一种构建权利要求2所述的肺成纤维细胞的方法，其特征在于，通过脂质体转染法将权利要求1所述的siRNA转染至肺成纤维细胞中。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述脂质体转染法中使用的脂质体为脂质体 TM2000。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述肺成纤维细胞为经受烟草刺激的肺成纤维细胞。
6.一种权利要求1所述的siRNA在制备促进肺成纤维细胞弹性蛋白修复的药物或材料中的应用。
7.—种权利要求1 所述的siRNA在制备治疗肺气肿药物或材料中的应用。
【文档编号】C12N5/071GK103468681SQ201310415689
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】瞿介明, 张静, 吴棟, 陆运涛 申请人:复旦大学附属华东医院