一种发酵生产还原型辅酶q10的方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种发酵生产还原型辅酶Q10的方法，具体过程为：1）、优选高产菌株：将关键酶基因2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌合成酶基因克隆到光合细菌中并强化表达，得到还原型辅酶Q10高产菌株；2）、发酵培养并进行代谢调控：将冷冻保存的光合细菌菌种室温放置10-12小时后，接种到斜面培养基上，置恒温培养箱中35℃培养20h，再接种到50ml液体活化培养基中，置摇床中35℃培养24h，摇床转速200r/min，然后接种到含100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，接种量为15～20ml，35℃摇床培养72h，转速为250r/min；在发酵培养后24h，添加前体物质L-苯丙氨酸，继续培养48h后收获培养物；3）、提取目的产物。该方法能在不产生有毒气体和工业废渣的情况下显著提高目的产物产量。
【专利说明】一种发酵生产还原型辅酶Q10的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于还原型辅酶QlO生产【技术领域】，具体提供一种发酵生产还原型辅酶QlO的方法。【背景技术】
[0002]辅酶QlO广泛存在于生物体内，是人体细胞中线粒体的电子传递系统的构成因子，在氧化磷酸化反应中发挥电子搬运工的作用，由此参与ATP的生成。辅酶QlO分为氧化型和还原型，在生物体内，氧化型可以转化为还原型，而还原型的比例随着年龄和压力的增加会减少。所以，还原型辅酶QlO的需求比较大。
[0003]还原型辅酶QlO (CoQltlH2)具有防止衰老和疲劳的作用。在动物实验中，用含0.2%还原型辅酶QlO的饵料，培养出生后I个月的小鼠，连续喂养，试验证明其具有抑制老化的作用。而在氧化型辅酶QlO的实验中没有发现这样的作用。用含0.3%还原型辅酶QlO的饵料，培养出生后13个月的小鼠，连续喂养，到第19个月发现它具有抑制听觉退化的作用。说明在高龄期使用还原型辅酶QlO依然有效果。在抑制光老化的动物实验中，用含1%还原型辅酶QlO的饵料培养，证明了它具有抑制光老化的作用。还原型辅酶QlO临床上广泛用于心脑血管疾病、神经系统疾病、高血压、高血脂、糖尿病、重症肝炎等疾病的治疗。
[0004]在人的机体内93%是还原型辅酶Q10，7%是氧化型辅酶Q10，起上述2个主要作用的是还原型辅酶Q10。所以生产还原型辅酶QlO是对人体有直接的积极意义，特别是天然的还原型辅酶Q10。但是，由于还原型辅酶QlO容易被分子氧氧化，目前还未见具有工业规模生产还原型辅酶QlO技术方面的报道。
[0005]目前国内外主要有三种工艺制取还原型辅酶:动植物提纯、化学合成、微生物发酵。
[0006]化学合成过程繁杂、危险、成本高。另外，采用化学合成法时，会产生、混入有安全性隐患的副产物(Z)-异构体。
[0007]生物提取法中动植物还原型辅酶QlO含量低，而且各种化学成分复杂，并受原料和来源限制，因此成本高，价格昂贵，规模化生产受到了一定限制。
[0008]发酵法被认为是最有前途的合成工艺，近几年来微生物发酵法成为国内外开发的热点。红极毛杆菌、脱氧极毛杆菌、甲烷微环菌等是生产还原型辅酶QlO的主要菌种。
[0009]对于高质量还原型辅酶QlO的合成，领先技术尚属于日本Kaneka公司，国内暂无成熟的适合大规模工业生产的技术，虽然具有还原型辅酶QlO化学合成、微生物发酵、动植物提取的专利，但收率不高，因此急需开发一种高产量的还原型辅酶QlO合成技术并用于提闻人们的健康水平。
【发明内容】
[0010]本发明意在基因重组构建高产发酵菌株，利用分子生物学技术对还原型辅酶QlO发酵生产的关键步骤进行代谢调控，最终得到高收率的、可以用于制作成药品及保健品的还原型辅酶Q10。
[0011]本发明具体提供了一种发酵生产还原型辅酶QlO的方法，其特征在于，采用发酵法生产还原型辅酶Q10，其具体过程为:
[0012]I)、优选高产菌株
[0013]将关键酶基因克隆到光合细菌中并强化表达，得到还原型辅酶QlO高产菌株，其中关键酶基因为2，3- 二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌合成酶基因；(如不具备条件，可以不通过基因工程技术来筛选高产菌株，国内外用于辅酶QlO发酵生产的菌株包括十几种甚至几十种，筛选高产菌株的空间也比较广泛)。
[0014]2 )、发酵培养并进行代谢调控
[0015]将冷冻保存的光合细菌菌种(即筛选出来的还原型辅酶QlO高产菌株)室温放置10-12小时后，接种到斜面培养基上，置恒温培养箱中35°C培养20h，再接种到50ml液体活化培养基中，置摇床中35°C培养24h，摇床转速为200r/min，然后接种到含100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，接种量为15~20ml，35°C摇床培养72h，转速为250r/min ；
[0016]在发酵培养后24h (即指数生长期之前)，添加前体物质L-苯丙氨酸(添加量优选为lmmol/L)，继续培养48h后收获培养物；
[0017]3)、提取目的产物。
[0018]工业发酵若想获得较高目的产物产量，必须突破(或解除)微生物细胞自我调节控制机制，最常用且有效的方法就是从遗传的角度解除微生物正常代谢控制机制的突变株。辅酶QlO发酵生产的代谢调控育种基本途径有:应用营养缺陷型菌株、选育抗反馈调节突变株、利用营养缺陷型回复突变株或条件突变株的方法，解除终产物对关键酶的调节、构建目的工程菌株等。我们最终选择制备营养缺陷型菌株，将关键酶基因克隆到光合细菌中并强化表达，得到还原型辅酶QlO高产菌株。
[0019]除了构建重组菌株提高发酵产量外，对生产菌的发酵条件优化也是提高发酵产量的一条重要而有效的途径，辅酶QlO的微生物合成途径主要分为芳香环合成及异戊烯基侧链的生物合成路线。根据芳香环及异戊烯基侧链的生物合成途径结合细菌的代谢调节机制，本发明通过分析QlO工业发酵高产菌株的选育途径，最终选择在指数生长期之前，即发酵培养后24h，加入前体物质L-苯丙氨酸，用以提高目的产物产量。
[0020]本发明所述发酵生产还原型辅酶QlO的方法，其特征在于:所述斜面培养基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，琼脂20g/L，pH6.5。
[0021]所述液体活化培养基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，pH6.5。
[0022]所述发酵培养基:葡萄糖5g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，MgSO4L 2g/L, K2HPO4.3H201.2g/L, KH2PO4L 2g/L, pH5.5。
[0023]本发明所述发酵生产还原型辅酶QlO的方法，其特征在于，所述提取目的产物的过程为:将发酵培养物过滤除去培养液，剩余湿菌体加入含有枸橼酸的纯净水(优选将其调至pH=6.0)，超声破壁后进行喷雾干燥，得到干菌体，以1:10 (w:v)比例加入乙醇，充分搅拌后用己烷分3次进行萃取，合并己烷层进行减压蒸馏，充分除去有机溶剂后得到还原型辅酶QlO的干粉，采用高效液相色谱法进行含量测定。
[0024]经过大量试验发酵培养，上述方法生产还原型辅酶QlO含量均不低于0.42mg/g(湿菌重)。
[0025]本发明的优点:
[0026]I)、采用基因工程技术，构建目的基因用以筛选高产还原型辅酶QlO的菌株；
[0027]2)、利用分子生物学技术对发酵过程进行代谢调控，目的产物产量提高显著；
[0028]3)、本发明不产生有毒气体和大量工业废渣，无污染。
【具体实施方式】
[0029]以下实施例均采用高效液相色谱法进行还原型辅酶QlO含量测定，高效液相色谱条件为:C18柱(Sigma公司),4.6mmX250mm ;流动相:70%甲醇；检测波长:210nm ;流速:lml/min。
[0030]实施例1
[0031]1.优选高产菌株(构建目的工程菌株)
[0032]利用分子生物学技术找到还原型辅酶QlO生产菌株的关键酶基因2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌合成酶基因。通过重组DNA技术筛选带有目标基因的细胞，将目的基因引入生产菌株，增强合成目的产物的能力，这是构建还原型辅酶QlO发酵重组菌株的基础，通过克隆上述 关键酶基因，使其高效表达，并增强其代谢流；通过将带有目的基因的质粒转化至经过诱变的突变菌。随着细胞中合成酶基因拷贝数的增加，可积累较大量的产物；根据重组菌株的选择标记，筛选一种物质分别以有选择压力与无选择压力的培养条件，进行摇瓶发酵实验，测定质粒的丢失情况；同时，通过连续几次发酵实验，测定产物的产量及菌株的稳定性。
[0033]最终选择将关键酶基因克隆到光合细菌中并强化表达，得到还原型辅酶QlO高产菌株。
[0034]2.发酵培养及代谢调控
[0035]将冷冻保存的光合细菌菌种室温放置10小时后，接种到斜面培养基上，置恒温培养箱中35°C培养20h，再接种到50ml液体活化培养基中，置摇床中35°C培养24h，摇床转速为200r/min，然后接种到含100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，接种量为15~20ml，35°C摇床培养72h，转速为250r/min。
[0036]斜面培养基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，琼脂20g/L，pH6.5。
[0037]液体活化培养基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，pH6.5。
[0038]发酵培养基:葡萄糖5g/L,鹿糖15g/L,蛋白胨12g/L,酵母浸膏12g/L,MgSO4L 2g/L, K2HPO4.3H201.2g/L, KH2PO4L 2g/L, pH5.5。
[0039]以上培养基配置后应立即灭菌，121°C，15min。
[0040]在指数生长期之前，即发酵培养后24h，添加前体物质L-苯丙氨酸lmmol/L，用以提高目的产物产量。
[0041]3.目的产物提取
[0042]将发酵培养物过滤除去培养液，剩余湿菌体加入含有枸橼酸的纯净水,调pH=6.0,超声破壁后进行喷雾干燥，得到干菌体，以1:10 (w:v)比例加入乙醇，充分搅拌后用己烷分3次进行萃取，合并己烷层进行减压蒸馏，充分除去有机溶剂后得到还原型辅酶QlO的干粉，采用高效液相色谱法进行含量测定:还原型辅酶QlO含量为0.43mg/g (湿菌重)。
[0043]实施例2
[0044]1.优选高产菌株
[0045]将2，3- 二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌合成酶基因克隆到光合细菌中并强化表达，得到还原型辅酶QlO高产菌株。
[0046]2.发酵培养及代谢调控
[0047]将冷冻保存的光合细菌菌种室温放置12小时后，接种到斜面培养基上，置恒温培养箱中35°C培养20h，再接种到50ml液体活化培养基中，置摇床中35°C培养24h，摇床转速为200r/min，然后接种到含100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，接种量为15~20ml，35°C摇床培养72h，转速为250r/min。
[0048]斜面培养基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，琼脂20g/L，pH6.5。
[0049]液体活化培养基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，pH6.5。
[0050]发酵培养基:葡萄糖5g/L,鹿糖15g/L,蛋白胨12g/L,酵母浸膏12g/L,MgSO4L 2g/L, K2HPO4.3H201.2g/L, KH2PO4L 2g/L, pH5.5。
[0051]以上培养基配置后应立即灭菌，121°C，15min。
[0052]在指数生长期之前，即发酵培养后24h，添加前体物质L-苯丙氨酸lmmol/L，用以提高目的产物产量。
[0053]3.目的产物提取
[0054]将发酵培养物过滤除去培养液，剩余湿菌体加入含有枸橼酸的纯净水,调=pH6.0,超声破壁后进行喷雾干燥，得到干菌体，以1:10 (w:v)比例加入乙醇，充分搅拌后用己烷分3次进行萃取，合并己烷层进行减压蒸馏，充分除去有机溶剂后得到还原型辅酶QlO的干粉，采用高效液相色谱法进行含量测定:还原型辅酶QlO含量为0.42mg/g (湿菌重)。
[0055]实施例3
[0056]1.优选高产菌株
[0057]将2，3- 二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌合成酶基因克隆到光合细菌中并强化表达，得到还原型辅酶QlO高产菌株。
[0058]2.发酵培养及代谢调控
[0059]将冷冻保存的光合细菌菌种室温放置10小时后，接种到斜面培养基上，置恒温培养箱中35°C培养20h，再接种到50ml液体活化培养基中，置摇床中35°C培养24h，摇床转速为200r/min，然后接种到含100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，接种量为15~20ml，35°C摇床培养72h，转速为250r/min。
[0060]斜面培养基:葡萄糖15g/L,鹿糖15g/L,蛋白胨12g/L,酵母浸膏12g/L,琼脂20g/L，pH6.5。
[0061]液体活化培养基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，pH6.5。
[0062]发酵培养基:葡萄糖5g/L,鹿糖15g/L,蛋白胨12g/L,酵母浸膏12g/L,MgSO4L 2g/L, K2HPO4.3H201.2g/L, KH2PO4L 2g/L, pH5.5。
[0063]以上培养基配置后应立即灭菌，121°C，15min。
[0064]在指数生长期之前，即发酵培养后24h，添加前体物质L-苯丙氨酸lmmol/L，用以提高目的产物产量。
[0065]3.目的产物提取
[0066]将发酵培养物过滤除去培养液，剩余湿菌体加入含有枸橼酸的纯净水,调pH=6.5，超声破壁后进行喷雾干燥，得到干菌体，以1:10 (w:v)比例加入乙醇，充分搅拌后用己烷分3次进行萃取，合并己烷层进行减压蒸馏，充分除去有机溶剂后得到还原型辅酶QlO的干粉，采用高效液相色谱法进行含量测定:还原型辅酶QlO含量为0.43mg/g (湿菌重)。
[0067]上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效 变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种发酵生产还原型辅酶Qio的方法，其特征在于，采用发酵法生产还原型辅酶Q10，其具体过程为: 1)、优选高产菌株 将关键酶基因克隆到光合细菌中并强化表达，得到还原型辅酶QlO高产菌株，其中关键酶基因为2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌合成酶基因； 2)、发酵培养并进行代谢调控 将冷冻保存的光合细菌菌种室温放置10-12小时后，接种到斜面培养基上，置恒温培养箱中35°C培养20h，再接种到50ml液体活化培养基中，置摇床中35°C培养24h，摇床转速为200r/min，然后接种到含100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，接种量为15~20ml，35°C摇床培养72h，转速为250r/min ； 在发酵培养后24h，添加前体物质L-苯丙氨酸，继续培养48h后收获培养物； 3)、提取目的产物。
2.按照权利要 求1所述发酵生产还原型辅酶QlO的方法，其特征在于:所述斜面培养基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，琼脂20g/L，ρΗ6.5。
3.按照权利要求1所述发酵生产还原型辅酶QlO的方法，其特征在于:所述液体活化培养基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，pH6.5。
4.按照权利要求1所述发酵生产还原型辅酶QlO的方法，其特征在于:所述发酵培养基:葡萄糖5g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，MgSO4L 2g/L，K2HPO4.3H201.2g/L, KH2PO4L 2g/L, pH5.5。
5.按照权利要求1所述发酵生产还原型辅酶QlO的方法，其特征在于，所述提取目的产物的过程为:将发酵培养物过滤除去培养液，剩余湿菌体加入含有枸橼酸的纯净水，超声破壁后进行喷雾干燥，得到干菌体，以1:10 (w:v)比例加入乙醇，充分搅拌后用己烷分3次进行萃取，合并己烷层进行减压蒸馏，充分除去有机溶剂后得到还原型辅酶QlO的干粉。
6.按照权利要求5所述发酵生产还原型辅酶QlO的方法，其特征在于:在剩余湿菌体加入含有枸橼酸的纯净水，将其调至PH=6.0。
7.按照权利要求1所述发酵生产还原型辅酶QlO的方法，其特征在于:所述前体物质L-苯丙氨酸的添加量为lmmol/L。
【文档编号】C12N1/21GK103740777SQ201310455555
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】张英杰, 高劲松, 魏奇 申请人:辽宁琦润生物科技有限公司