用于定性、定量检测枣疯病植原体的引物、探针及其方法
【专利摘要】本发明属于植物检疫【技术领域】，涉及用于对枣疯病植原体进行定性、定量检测的引物、探针及其检测方法。本发明根据枣疯病植原体与其它植原体在16S?rDNA基因序列上的差异，设计了特异性检测枣疯病植原体的引物对JWB?Primer-F：5’-TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3’/JWB?Primer-R：5’-CTCCCGTAGGAGTTT?GG-3’和TapMan探针JWB-Probe：5’-FAM-AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-TAMRA-3’，通过建立的枣疯病植原体的实时荧光定量PCR检测方法测定Ct值，依据实时荧光定量PCR检测结果的阳性判定标准，即可实现对枣疯病植原体的定性；再由预先建立的荧光定量PCR标准曲线方程计算出检测样品中枣疯病植原体16S?rDNA基因片段拷贝浓度，据此得到样品中枣疯病植原体的数量，从而实现定量检测。本发明具有灵敏度高、特异性强、重复性好、高通量等优点，可广泛应用于植物检疫、植物保护、科研等领域。
【专利说明】用于定性、定量检测枣疯病植原体的弓丨物、探针及其方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物检疫【技术领域】，涉及用于对枣疯病植原体进行定性、定量检测的引物、探针及其检测方法，特别是涉及用实时荧光定量PCR技术对枣疯病植原体进行定性、定量检测的引物、探针及其方法。
【背景技术】
[0002]枣疯病(Jujube witches’ broom, JffB)又称“枣癌症”是由植原体病原侵染导致的、在枣树生产中危害最严重的毁灭性病害。植原体原称类菌原体，为单细胞原核生物，无细胞壁，由生物膜包围，可引起多种病害。根据植原体16S rDNA基因序列为对象进行分析，可将植原体分为28个组。其中引起枣疯病的枣疯病植原体与榆树黄化植原体、葡萄金黄化植原体等同为植原体榆树黄化组成员。枣疯病分布范围广，传播速度快，致病力强，树体一旦感病，终身携带，传统的病害防治技术和栽培技术难以治愈。我国多数枣树主栽品种对枣疯病敏感，全国每年因枣疯病死树高达千万株，直接经济损失高达数亿元，严重阻碍了枣树产业的发展。要从根本上解决 枣疯病的防治问题是采取有效的预防措施，加强种苗(接穗、砧木)的检疫检验，采用健康苗木(砧木、接穗)，建立无病苗木繁育体系，从源头上杜绝病原才是控制枣疯病发生蔓延的根本途径，而建立和应用先进的病原检测技术是红枣无病苗木生产的核心所在。
[0003]植原体自发现后的10多年里，其检测技术的发展一直没有大的突破。传统的电镜观察、血清学等检测方法因为灵敏度低、周期长和操作繁琐等不足，已不能满足现代生产的需要。随着分子生物学技术引入植原体病害研究领域，植原体鉴定和检测技术才得到了较快的发展，如普通PCR、巢氏PCR等技术的应用使植原体检测灵敏度和鉴定水平有了极大的提高，但这些方法整个过程繁杂，操作步骤多，而且需要PCR后处理，如琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，如果要鉴定到种或组，还要进行限制性内切酶多态性分析(RFLP)，或者进行核酸序列测定和同源性比较，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会，严重影响对结果的正确判断。为此研发一套简单、快速、灵敏、准确的枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测方法，以期满足检疫工作的需要。
[0004]荧光PCR(FQ-PCR)技术是美国珀金埃尔默公司(PerkinElmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该方法自产生以来，不断发展完善，其中TaqMan探针实时突光定量PCR技术是在PCR反应体系中添加了一对引物的同时加入了一条标记了 2个突光基团的特异性TaqMan探针，在PCR扩增过程中TaqMan探针同PCR产物杂交，引起报告基团发出荧光信号，通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板进行定性及定量分析。与常规PCR检测方法相比，该法具有特异性强、耗时短、灵敏度高、稳定性好和定量等优点。
[0005]目前国内已建立了用于检测植原体榆树黄化组成员的实时荧光PCR检测方法，但该方法仅能实现植原体组间的特异性检测，无法对植原体榆树黄化组内的植原体进行区分和鉴定。本发明在对植原体大量基因信息进行分析比较的基础上，建立了枣疯病植原体特异性的实时荧光定量PCR检测方法，能较好的区分不同组间及组内的植原体，可大大提高枣疯病植原体的检测效率，从而满足我国相关检疫工作的需要。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种用于对枣疯病植原体进行定性、定量检测的引物、探针及其检测方法，具有快速定性和定量检测枣疯病植原体的功能。本发明操作简单，易于掌握，检测精度高，可广泛应用于实验室等日常检测工作。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是。
[0007](I)设计并提供用于枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测的引物和探针。
[0008]引物的序列为:
[0009]上游引物JWB Primer-F:5’ -TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3，；
[0010]下游引物JWB Primer-R:5’ -CTCCCGTAGGAGTTTGG-3，。
[0011]探针的序列为:
[0012]JffB-Probe: 5，-FAM-AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-TAMRA-3，。
[0013](2)提供枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测方法，即首先从待检测枣疯病样品中制备反应模板，并建立和优化实时荧光定量PCR反应体系，然后通过设定实时荧光PCR反应程序，利用荧光PCR仪对反应模板进行扩增和荧光收集。
[0014](3)最后根据仪`器给出每个样品的Ct值，分析检测结果。
[0015]具体的，本发明提供了一种用于对枣疯病植原体进行定性、定量检测的引物、探针及检测方法，包括以下步骤。
[0016](I)作为本发明的核心，提供一组高敏感和特异性的引物和探针，用于枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测，进一步提高了枣疯病植原体检测的灵敏度。
[0017]引物的序列为:
[0018]上游引物JWB Primer-F:5’ -TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3’ ；
[0019]下游引物JWB Primer-R:5’ -CTCCCGTAGGAGTTTGG-3，。
[0020]探针的序列为:
[0021 ] JffB-Probe: 5 ’ -FAM-AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-TAMRA-3’。
[0022]所述用于枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测的引物、探针，设计合成方法是:首先在NCBI中搜集全部植原体及有代表性细菌的16S rDNA核酸序列，利用Omiga软件对上述序列进行比较及一致性分析，找出枣疯病植原体与其他植原体的基因差异位点，用软件Beacon Designer7.0筛选出一对引物,在该引物对的扩增区域设定一条突光Tapman探针，报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端。枣疯病植原体特异性的PCR引物对和探针设计完成后，采用在线同源性比对，分析其序列特异性，结果表明枣疯病植原体特异性的引物和探针设计区域为枣疯病植原体所特有，未发现除枣疯病植原体之外的可以和此对弓丨物配对并引起扩增的物种，可以初步保证扩增产物的特异性。TaqMan探针及引物对由生物公司合成。
[0023]本发明的实时荧光PCR引物对扩增位于枣疯病植原体16S rDNA基因202bp~299bp位点的片段，扩增片段大小为98bp，本发明的特异性荧光探针的5’端具有报告荧光染料FAM标记，3’端具有淬灭荧光染料TAMRA标记。
[0024](2)植物总DNA的提取:采用植物基因组提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit,TIANGEN)提取枣树叶片总DNA，置于_40°C冰箱贮存备用。
[0025](3)以提取的植物总DNA为模板，分别设阳性对照、健康植株总DNA对照及无菌双蒸水对照，采用上述设计的引物和探针进行实时荧光定量PCR检测。
[0026]实时荧光定量PCR检测的反应体系为20 μ L:包括2.5XrealMasterMix8.0 μ L,20 X Probe Enhancer solutionl.0 μ L, 10 μ mol/L 的上游引物 JWB Primer-F0.5 μ L>10 μ mol/L 的下游引物 JffB Primer-R0.5 μ L，10 μ mol/L 的 TaqMan 探针 JffB-Probe0.5 μ L,模板DNA1.0yL,补足灭菌ddH20至20 μ L。
[0027]针对上述引物、探针和PCR反应体系，设置的PCR反应程序为:95°C预变性2min ；以95°C变性15s，60°C退火30s，68V延伸Imin进行40个循环，68V设置FAM荧光通道采集荧光。
[0028](4)反应结束后，记录各检测样本的PCR扩增曲线Ct值，根据各样本的反应Ct值，按照枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测结果的阳性判定标准判定待检样本中是否存在枣疯病植原体，即可实现枣疯病植原体的定性检测；并可通过预先建立的荧光定量PCR反应的标准曲线方程计算出检测样品中枣疯病植原体16SrDNA基因片段拷贝浓度，据此得到样品中枣疯病植原体的数量，从而实现定量检测。
[0029](5)枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测结果的阳性判定标准为:如果样品荧光PCR扩增曲线的Ct值≤34，而且同时阴性对照及空白对照无扩增曲线，则判定待检样品中含有枣疯病植原体，否则该样本不含枣疯病植原体；荧光定量PCR反应的标准曲线方程为:I = -3.354X+38.27，x为所测样品中枣疯病植原体16S rDNA基因片段拷贝数的对数，y为Ct值。
[0030]通过实施本发明具体的
【发明内容】
，可以达到以下效果:
[0031]本发明充分考虑到检疫工作的特殊性，并针对枣疯病植原体的特点，研制了一套实时荧光定量PCR探针及引物，该引物及探针能特异性的检测出枣疯病植原体，并排除其他植原体，其检测灵敏度达60拷贝/ μ L。另外本发明采用上述实时荧光定量PCR引物、探针进行检测的方法能快速准确的检测出样品中的枣疯病植原体含量，为苗木和接穗的带菌检测及抗枣疯病品种的鉴定提供了新的手段和依据。
[0032]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0033](I)灵敏度高:对枣疯病植原体检测的灵敏比普通PCR方法高100倍以上。
[0034](2)特异性强:本发明只针对枣疯病植原体设计特异性引物及探针，通过选取枣疯病植原体(榆树黄化组)，葡萄金黄化植原体(榆树黄化组)，泡桐丛枝植原体(翠菊黄化组)，翠菊黄化植原体(翠菊黄化组)为对象，进行特异性检测，结果表明本发明检测准确性高，特异性强。
[0035](3)检测时间短:比现有的常规PCR检测法节省时间。
[0036](4)降低污染:由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。
[0037](5)既可以做定性分析又可以做定量分析。
[0038](6)对人和环境安全:检测过程中不使用溴化乙锭等有毒试剂，对人和环境都非常安全。
[0039]总之，该方法不仅操作简便、快速高效、高通量，而且具有很高的敏感性、重复性和特异性。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1所示的是以阳性质粒为模板的的PCR鉴定结果。图中M道指IOObp DNALadder, I~4泳道分别均为PCR产物，5泳道为阴性对照。
[0041]图2所示的是枣疯病植原体实时荧光PCR检测方法的标准曲线。
[0042]图3所示的为枣疯病植原体实时荧光PCR检测方法的灵敏度试验结果。图中曲线I~10分别对应当采用的质粒模板浓度为6.09 X IO9~6.09拷贝/ μ L时的扩增情况，曲线11是阴性对照。
[0043]图4所示的为枣疯病植原体常规PCR检测方法的灵敏度试验结果。图中M道指IOObp DNA Ladder,泳道I~10分别对应当采用的质粒模板浓度为6.09 X IO9~6.09拷贝/ μ L时的扩增情况，泳道Ii是阴性对照。
[0044]图5所示的是枣疯病植原体实时荧光PCR检测方法的特异性试验结果。图中曲线
1、2、3、4分别代表采用健康枣树DNA、泡桐丛枝植原体DNA、翠菊黄化植原体DNA、葡萄金黄化植原体DNA作为模板时的荧光PCR扩增结果，曲线5代表采用枣疯病植原体DNA作为模板时的荧光PCR扩增结果。
【具体实施方式】
[0045]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0046]本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。
[0047]试验药品:植物基因组提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit, TIANGEN), PGM-T载体、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)、质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANgel Midi Purification Kit)及RealMasterMix(Probe)购自北京天根生化科技有限公司。
[0048]仪器设备:实时荧光PCR仪(Roche Lightcycle2.0)，ND-1000核酸/蛋白检测仪(Nano Drop 公司)。
[0049]本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0050]实施例1引物和探针的制备
[0051]1.引物和探针的设计和合成
[0052]所述用于枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测的引物、探针，设计合成方法是:首先在NCBI中搜集全部植原体及有代表性细菌的16S rDNA核酸序列，利用Omiga软件对上述序列进行比较及一致性分析，找出枣疯病植原体与其他植原体的基因差异位点，用软件Beacon Designer7.0筛选出一对引物，并在该引物对的扩增区域设定一条突光Tapman探针，报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端。枣疯病植原体特异性的PCR引物和探针设计完成后，采用在线同源性比对，分析其序列特异性，结果表明枣疯病植原体特异性的引物和探针设计区域为枣疯病植原体所特有，未发现除枣疯病植原体之外的可以和此对引物配对并引起扩增的物种，可以初步保证扩增产物的特异性。引物及探针由北京鼎国生物技术有限公司合成。
[0053]引物的序列为 :
[0054]上游引物JWB Primer-F:5’ -TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3’ ；
[0055]下游引物JWB Primer-R:5’ -CTCCCGTAGGAGTTTGG-3，。
[0056]探针的序列为:
[0057]JffB-Probe:5’ -AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-3’。
[0058]本发明的实时荧光PCR引物对扩增位于枣疯病植原体16S rDNA基因202bp~299bp位点的片段，扩增片段大小为98bp，本发明的特异性荧光探针的5’端具有报告荧光染料FAM标记，3’端具有淬灭荧光染料TAMRA标记。
[0059]2.引物和探针的准备
[0060]引物和探针合成后，用灭菌双蒸水分别稀释为lOymol/L，将引物、探针置于_20°C冰箱避光保存备用。实施例2枣疯病植原体实时荧光PCR检测方法的建立
[0061]1.植物总DNA的提取:采用植物基因组提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit,TIANGEN)提取枣树叶片总DNA，置于_40°C冰箱贮存备用。
[0062]2.枣疯病植原体16S rDNA的PCR扩增
[0063]利用植原体16S rDNA 通用引物对 R16mF2:5’ -CATGCAAGTCGAACGGA-3’，R16mR2:5’ -CTTAAC CCCAATCATCGA-3’对上述提取的枣树叶片总DNA进行常规PCR扩增。反应体系为 25 μ L:DNA模板 1.0 μ L, 10 μ mol/L 的引物各 1.0 μ L, 10 μ mol/L 的 dNTPl.0 μ L，10XPCRBuffer2.5μ L,2.5U/μ L 的 TaqDNA聚合酶 0.3 μ L，灭菌 ddH2018.2 μ L。反应条件:94°C预变性6min ;94°C变性45s，52°C复性45s，72°C延伸lmin，扩增35个循环，72°C补偿延伸lOmin。
[0064]3.阳性质粒的构建
[0065]用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANgel Midi Purification Kit)将上述PCR产物回收纯化，连接到pGM-T载体中并转入E.coli T0P10感受态细胞，经过筛选、PCR鉴定获得含目的片段的重组质粒。通过上海生工测序部测序鉴定，证实目的基因已正确克隆到载体中，用核酸蛋白测定仪(NanoDix)P, ND-1000)测定质粒浓度，换算成拷贝数，-20°C保存备用，使用前进行10倍梯度稀释。
[0066]4.枣疯病实时荧光PCR反应体系及条件的建立与优化
[0067]以构建的含有靶基因的阳性质粒为DNA模板，建立枣疯病实时荧光PCR方法，并对PCR反应体系和反应条件进行优化，确定实时荧光定量PCR检测的反应体系为20 μ L:包括 2.5 X realMasterMix8.0 μ L, 20 X Probe Enhancer solutionl.0 μ L, 10 μ mol/L 的上游引物 JWB Primer-F0.5 μ LUO μ mol/L 的下游引物 JffBPrimer-R0.5 μ L，10 μ mol/L 的TaqMan 探针 JffB-Probe0.5 μ L,模板 DNA1.0 μ L，补足灭菌 ddH20 M 20 μ L0 反应在 RocheLightcycle2.0荧光PCR仪上进行，反应条件:95°C预变性2min ;以95°C变性15s，60°C退火30s，68 °C延伸Imin进行40个循环，68 °C设置FAM荧光通道采集荧光。
[0068]5.标准曲线的建立及敏感性测定
[0069]以10倍梯度稀释(6.09 X IO9~6.09X10拷贝/ μ L)的质粒DNA为模板，在荧光PCR仪上检测，得到扩增动力学曲线与相应的标准曲线，根据测得的最低拷贝数评价其敏感性。同时利用引物对JWBPrimer-F: 5 ’ -TG GTGAGGTAAAGGCTTA-3 ’ ；JffB Primer-R:5’ -CTCCCGTAGGAGTTTGG-3’以上述梯度稀释的质粒DNA作为模板进行常规PCR敏感性测定，并与荧光PCR灵敏度进行比较。常规PCR反应体系为20μ?:10XPCRBuffer2.5 μ L，10 μ mol/L 的上游引物 JffB Primer-F0.5 μ L，10 μ mol/L 的下游弓 I 物 JffB Primer-R0.5 μ LlO μ mol/L 的 dNTP0.5 μ L，质粒 DNA 模板 1.0 μ L, 2.5U/ μ L 的TaqDNA聚合酶0.5μ L，灭菌ddH2014.5μ L。反应条件:95°C预变性4min ;95°C变性 15s，55°C复性30s，72°C延伸7min，35个循环；72°C补偿延伸IOmin0[0070] 6.特异性试验
[0071 ] 分别提取枣疯病植原体(榆树黄化组)，葡萄金黄化植原体(榆树黄化组),泡桐丛枝植原体(翠菊黄化组)，翠菊黄化植原体(翠菊黄化组)以及田间采集及实验室保存的健康枣树基因组DNA作为模板，进行枣疯病植原体实时荧光PCR检测的特异性试验。荧光定量PCR检测的反应体系为20 μ L:包括
[0072]2.5 XrealMasterMix8.0 μ L,20 XProbe Enhancer solutionl.0 μ L，10 μ mol/L的上游引物 JffB Primer-F0.5 μ LUO μ mol/L 的下游引物 JffB Primer-R0.5 μ L，10 μ mol/L 的 TaqMan 探针 JffB-Probe0.5 μ L，模板 DNA1.0 μ L，补足灭菌 ddH20 M 20 μ L0 反应程序:95°C预变性2min，以95°C变性15s，60°C退火30s，68°C延伸Imin进行40个循环，68°C设置FAM荧光通道采集荧光。
[0073]7.重复性试验
[0074]对3种不同浓度的标准质粒(反应初始体系中含6.09X IO4~6.09X IO6拷贝/UL)利用建立的实时荧光PCR重复检测3次，通过计算循环阈值(Ct)的平均值、标准差(SD)和变异系数(CV)来评价该方法的稳定性。变异系数(CV)=测定结果的标准差与其平均值的百分比。
`[0075]8.实验结果
[0076]以重组的质粒DNA为模板进行常规PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示特异性条带大小为98bp (见图1)，与引物的预设扩增片段大小相符。
[0077]使用质粒DNA制作标准曲线(见图2)。以10倍梯度稀释的质粒为模板，对应浓度6.09 X IO9~6.09 X 10拷贝/ μ L，以获得的Ct值为y轴，对应的质粒DNA拷贝数的对数为X轴，仪器自动生成标准曲线的扩增效率为98.2 %，相关系数为0.998，标准曲线方程为y = -3.354X+38.27。由扩增曲线可知，荧光PCR的检测灵敏度下限为60拷贝/ y L是目前常用的常规PCR检测方法灵敏度的100倍(见图3、图4)。根据检测出的最低拷贝数我们设立检测结果的判定标准:在阴性无Ct值的前提下，待检样品Ct值在34以下为阳性，34~40为可疑，需加大模板量重新进行检测，无Ct值的样品为阴性。
[0078]将建立的枣疯病植原体实时荧光PCR检测方法进行特异性试验发现，该探针能准确检测出属于植原体榆树黄化组的率疯病植原体，而同属植原体榆树黄化组的葡萄金黄化植原体和属于植原体翠菊黄化组的泡桐丛枝植原体、翠菊黄化植原体以及健康枣树均为阴性(见图5)。由此可见，JWB-Probe探针对枣疯病植原体有较强的特异性，能较好的区分不同组间及组内的植原体，特异性较好，特异性验证通过后，即表明该引物及探针可应用于枣疯病植原体的定性检测。[0079]重复性试验结果显示(表1)，各重复试验的Ct值误差均不到I个循环，且Ct值变异系数均小于5%，证明本研究建立的实时荧光PCR体系重复性较好，从而保证了不同样品间检测结果的可靠性和稳定性。
[0080]表1实时荧光PCR的重复性检测
【权利要求】
1.一种用于枣疯病植原体定性、定量检测的引物、探针，其特征在于，含有一条特异性循环探针和一对引物，所述引物对和探针的寡聚核昔酸序列为:
上游引物 JWB Primer-F:5’ -TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3’ 下游引物 JWB Primer-R:5，-CTCCCGTAGGAGTTTGG-3’
探针 JWB-Probe:5，-AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-3，。
2.如权利要求1所述用于枣疯病植原体定性、定量检测的引物、探针，其特征在于，其设计方法是=WNCBI中搜集全部植原体及有代表性细菌的16S rDNA核酸序列，利用Omiga软件对上述序列进行比较及一致性分析，找出枣疯病植原体与其他植原体的基因差异位点，用软件Beacon Designer7.0筛选出一对特异性的PCR引物，在该引物对的扩增区域设定一条荧光Tapman探针，并利用NCBI中的Blast程序分别对上游引物、下游引物和探针进行比对，确保枣疯病植原体特异性的引物和探针设计区域为枣疯病植原体所特有，从而保证扩增产物的特异性。
3.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对扩增位于枣疯病植原体16SrDNA基因202bp~299bp位点的片段，扩增片段大小为98bp。
4.如权利要求1所述的用于枣疯病植原体定性、定量检测的探针，其特征在于，该探针的5’端具有报告荧光染料FAM标记，3’端具有淬灭荧光染料TAMRA标记。
5.一种用于枣疯病植原体定性、定量检测的方法，该方法包括下列步骤: (1)采用植物基因组提取试剂盒(PlantGenomic DNA Kit,TIANGEN)提取枣树叶片总DNA,置于_40°C冰箱贮存备用。 (2)以提取的植物总DNA为模板，分别设阳性对照、健康植株总DNA对照及无菌双蒸水对照，采用JWB-Probe探针及JWB Primer引物对进行实时荧光定量PCR检测。 (3)根据各样本的反应Ct值，按照枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测结果的阳性判定标准判定待检样本中是否存在枣疯病植原体，即可实现枣疯病植原体的定性检测；并可通过预先建立的荧光定量PCR反应的标准曲线方程计算出检测样品中枣疯病植原体16SrDNA基因片段拷贝浓度，据此得到样品中枣疯病植原体的数量，从而实现定量检测。
6.如权利要求5所述的一种用于枣疯病植原体定性、定量检测的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR检测的反应体系为20 μ L:包括2.5XrealMasterMix8.0yL,20 X Probe Enhancer solutionl.0 μ L, 10 μ mol/L 的上游引物 JWB Primer-F0.5 μ L>10 μ mol/L 的下游引物 JffB Primer-R0.5 μ L，10 μ mol/L 的 TaqMan 探针 JffB-Probe0.5 μ L,模板DNA1.0yL,补足灭菌ddH20至20 μ L。
7.如权利要求5所述的一种用于枣疯病植原体定性、定量检测的方法，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测的反应程序为:95°C预变性2mmin ;以95°C变性15s，60°C退火30s，68 °C延伸Imin进行40个循环，68 °C设置FAM荧光通道采集荧光。
8.如权利要求5所述的一种用于枣疯病植原体定性、定量检测的方法，其特征在于，所述的枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测结果的阳性判定标准为:如果样品荧光PCR扩增曲线的Ct值≤34，而且同时阴性对照及空白对照无扩增曲线，则判定待检样品中含有枣疯病植原体，否则该样本不含枣疯病植原体。
9.如权利要求5所述，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的标准曲线方程为:y=-3.354x+38.27，X为所测样品中枣疯病植原体16S rDNA基因片段拷贝数的对数，y为Ct值。
【文档编号】C12Q1/06GK103525923SQ201310455553
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】罗明, 韩剑, 徐金红, 王同仁, 张祥林 申请人:新疆农业大学