一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法，本发明所述菌株F69的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年1月9日，保藏编号为：CGMCC?No.5699。本发明所述筛选方法的具体步骤依次包括：富集培养、初筛、菌株纯化、复筛、菌种保藏和β-半乳糖苷酶酶活性测定。该菌株产β-半乳糖苷酶发酵周期短、产β-半乳糖苷酶速度快、遗传稳定性好、pH稳定性好和催化活力强，且培养条件简便和生产安全性高，在食品和饲料等工业领域具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种发酵产耐高温P-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于生物工程【技术领域】，特别是涉及一种产耐高温P -半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法。
[0003]
【背景技术】
[0004]-半乳糖苷酶(P -galactosidase, EC3.2.1.23),学名为P -D-半乳糖苷半乳糖水解酶，商品名为乳糖酶，能够催化半乳吡喃糖苷水解或者转糖基化，常用于水解牛乳和其它乳制品中的乳糖，也可用来生成低聚半乳糖，广泛适用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产，解决世界一半以上人口存在的乳糖不耐症问题，3 -半乳糖苷酶还具有半乳糖苷转移作用，用于生产双歧因子-低聚半乳糖，从而在益生菌食品生产中广泛应用。^-半乳糖苷酶在食品中的重要应用价值引起人们对它的广泛关注。P-半乳糖苷酶主要来源于动物、植物、细菌、酵母、真菌或霉菌。由于微生物的快速生长、高效代谢以及分离纯化相对简单等优势，使微生物(6-半乳糖苷酶成为工业化酶制剂的主要来湿。目前乳品工业用于分解乳糖的3 -半乳糖苷酶多从酵母、曲霉菌或乳酸菌中经诱导产酶后提取获得，但是均存在热稳定性差的缺点，严重限制了它在乳制品中的应用。
[0005]如果采用耐高温P -半乳糖苷酶将可克服热稳定性差的缺陷，酶在60°C以上温度水解乳糖，可以有助于抑制杂菌微生物的生长。而且酶反应速度快，酶用量低，反应时间短，生产中可与巴氏杀菌同时进行或冷却阶段保温水解，即在巴斯德消毒过程中同时进行乳糖水解，省时、省工且能防止杂菌污染。尽管目前诸多文献报道了筛选分离多种(6-半乳糖苷酶菌株，如酵母菌、乳酸菌属、芽孢杆菌属、曲霉菌属等系列菌株的方案，但目前生产所用的
半乳糖苷酶大多最适作用温度在30°C左右，在高温下的酶活力都很低，且成本高，难以满足市场及生产所需。如何克服现有技术的不足，加快研发耐高温的(6-半乳糖苷酶产品已成为当今生物工程【技术领域】中亟待解决的重点难题之一。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的是为克服现有技术的不足而提供一种发酵产耐高温P -半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法，该菌株产3 -半乳糖苷酶发酵周期短、产3 -半乳糖苷酶速度快、遗传稳定性好、PH稳定性好和催化活力强，且培养条件简便和生产安全性高。
[0008]根据本发明提出的一种发酵产耐高温P -半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株F69的分类命名为枯草芽孢杆菌{Bacillus Jis),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期:2012年I月9日，保藏编号为=CGMCC N0.5699，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。[0009]本发明所述的菌株F69 (CGMCC N0.5699)具有以下特性:
(1)生长条件:枯草芽孢杆菌sy况27i50F69所产P-半乳糖苷酶的生长温度55~75°C，最适生长温度65°C ;所测P -半乳糖苷酶活力都在90%以上，表明该酶在较高的温度范围内催化活性很高，温度适应性强；
(2)酶活性:在50°C~80°C下保温90min，残余酶活在80%以上，在80°C和90°C下保温60min，残余酶活分别为85%和65% ;表明枯草芽孢杆菌F69所产P -半乳糖苷酶具有很强的热稳定性；
(3)弱酸性:在pH5.5~7.5之间酶活性在80%以上；在pH 4.5~7.5之间保持81%以上的酶活性，最适作用PH为6.5 ;表明(6-半乳糖苷酶在弱酸性及中性环境下非常稳定。
[0010]根据本发明提出的一种发酵产耐高温(6-半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于依次包括如下具体步骤:
步骤一，富集培养:取土样Ig研细，加入装有80ml无菌水的250ml三角瓶中，加入无菌玻璃珠，在150r/min摇床中振荡20min，然后在80°C震荡水浴摇床中震荡30 min，取1-2ml于50 mL富集培养基中，40°C恒温水浴振荡培养36h_48h，震荡频率为150_180r/min ；
步骤二，初筛:将富集后的培养液进行10倍梯度稀释至稀释倍数为10_8，分别取10_6、10_7、10_8三个梯度的稀释液0.2ml涂布在初筛分离培养基平板上，平板晾至表面没有流动液体时，在40-42°C恒温培养箱中倒置培养24-36h，然后将培养温度降到32~35°C，继续培养24~72h ;挑取蓝色菌落 至另一个初筛分离培养基上，培养条件为:温度40-42°C、培养时间30-36h ;经培养后菌落呈现深浅不一的蓝色，进一步选取蓝色较深的菌株划线纯化；
步骤三，菌株纯化:将初筛出来的菌株，于牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，置于40-42°C恒温培养箱中培养48h，重复划线培养三次以上，如连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化；
步骤四，复筛:初筛后将经过纯化的菌株接种到种子培养基中，容量为250ml的三角瓶装液量为30ml，在温度为40-45°C，震荡频率为160_180r/min下，恒温震荡摇床培养18-22h，然后按照4-6%的接种量接种到复筛发酵培养基中，摇床震荡发酵培养；发酵条件为:在250ml三角瓶中装培养基30-50ml，摇床震荡频率为160_200r/min、发酵温度40-45°C、发酵时间为36-48h ;发酵结束后，发酵液8000r/min离心lOmin，上清液为粗酶液，测定各粗酶液的3 -半乳糖苷酶酶活性；其中，菌株F69产3 -半乳糖苷酶活性最强，活力闻达 182U/ml ；
步骤五，菌种保藏:将复筛得到的菌种在斜面培养基上划线，40-45°C培养3天，然后置于4°C冰箱保存；
步骤六，(6-半乳糖苷酶酶活性测定:取500 UL待测酶液加入到已经预热到65°C的
1.5 mL 含有 2 mmol/L ONPG 的 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.5)中，65°C水浴保温 10 min后，加入ImL lmol/L的碳酸钠溶液终止反应，J4tl5测定光吸收值，计算水解产物邻硝基酚的含量和酶的活性，同时以0.1 mol/L pH 6.5磷酸酸缓冲液代替酶液作为对照；乳糖酶活性的定义:1个单位的乳糖酶的活性为在pH 6.5、65°C下每分钟分解ONPG生成I y mo I邻硝基酚(ONP)所需的酶量。
[0011]本发明与现有技术相比其显著优点在于:一是本发明所产(6-半乳糖苷酶的生长温度为55~75°C，最适反应温度为65°C，所测酶活力都在最高酶活的90%左右；酶在50°C~80°C下保温90min，残余酶活在80 %以上，具有优良的热稳定性；二是酶在pH4.5~7.5之间，酶活稳定，鉴于大多数乳制品及饮料的pH值也在这一范围内，故该酶的生化特性赋予了枯草芽孢杆菌F69菌株所产3 -半乳糖苷酶在乳制品加工中将有较强的应用优势；三是本发明筛选到的菌株遗传稳定性好，可连续传代10代以上，3 -半乳糖苷酶的合成能力不变；四是本发明的(6-半乳糖苷酶在高温下有良好的稳定性，在食品和饲料等工业领域具有广阔的应用前景。
[0012]
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为产P -半乳糖苷酶菌株初筛平板示意图。
[0014]图2以16S rDNA序列为基础的F69菌系统发育树示意图。
[0015]图3本发明的耐高温(6-半乳糖苷酶最适作用温度示意图。
[0016]图4本发明的耐高温P -半乳糖苷酶的热稳定性示意图。
[0017]图5本发明的耐高温P -半乳糖苷酶最适作用pH示意图。
[0018]图6本发明的耐高温P -半乳糖苷酶pH稳定性示意图。
[0019]
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步的详细说明。
[0021]本发明所述的枯草芽孢杆菌F69发酵生产P _半乳糖苷酶的方法，是以碳源、氮源及无机盐组成的发酵培养基，进行摇瓶发酵，生产3 -半乳糖苷酶，摇瓶发酵产量可达到182U/m I，【具体实施方式】如下:
实施例1:产耐高温(6-半乳糖苷酶菌株的筛选。
[0022]本发明提出的一种发酵产耐高温(6-半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于依次包括如下具体步骤:
(1)富集培养:取土样Ig研细，加入装有80ml无菌水的250ml三角瓶中，加入无菌玻璃珠，在150r/min摇床中振荡20min，然后在80°C震荡水浴摇床中震荡30 min，取1-2 ml于50 mL富集培养基中，40°C恒温水浴振荡培养36h-48h，震荡频率为150_180r/min ;其中，富集培养基为:乳糖2g、酵母粉0.5g、蛋白胨lg、NaCl 0.5g和蒸馏水100ml，条件:pH 6.5、灭菌温度121°C、灭菌时间20min ；
(2)初筛:将富集后的培养液进行10倍梯度稀释至稀释倍数为10_8，分别取10_6、10_7、10_8三个梯度的稀释液0.2ml涂布在初筛分离培养基平板上，平板晾至表面没有流动液体时，在40-42°C恒温培养箱中倒置培养24-36h，然后将培养温度降到32~35°C，继续培养24~72h ;挑取蓝色菌落至另一个初筛分离培养基上，培养条件为:温度40-42°C、培养时间30-36h，结果如图1所示，经培养后菌落呈现深浅不一的蓝色，进一步选取蓝色较深的菌株划线纯化；其中，初筛分离培养基为:乳糖2g、酵母粉0.5g、蛋白胨lg、NaCl 0.5g、蒸懼水100ml和琼脂1.5g，条件:pH 6.5、灭菌温度121°C、灭菌时间20 min，冷却至60°C，加入用
0.25 um的微滤膜过滤除菌的X-Gal (30mg/L) 40 U I,混匀，倒平板；
(3)菌株纯化:将初筛出来的菌株，于牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，置于40-42°C恒温培养箱中培养48h，重复划线培养三次以上，如连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化；
(4)复筛:初筛后将经过纯化的菌株接种到种子培养基中，容量为250ml的三角瓶装液量为30ml，在温度为40-45°C，震荡频率为160_180r/min下，恒温震荡摇床培养18_22h，然后按照4-6%的接种量接种到复筛发酵培养基中，摇床震荡发酵培养；发酵条件为:在250ml三角瓶中装培养基30-50ml，摇床震荡频率为160-200r/min，发酵温度40_45°C，发酵时间为36-48h，发酵结束后，发酵液8000r/min离心lOmin，上清液为粗酶液，测定各粗酶液的^ -半乳糖苷酶酶活性；其中菌株F69产P -半乳糖苷酶活性最强，活力高达182U/ml ;其中，种子培养基为:蛋白胨lg、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl 0.5g、K2HP04 0.5g和蒸馏水lOOmL，条件:pH6.5、灭菌温度121°C、灭菌时间20 min ;复筛发酵培养基为:乳糖2g、酵母粉0.5g、蛋白胨lg、NaCl 0.5g和蒸馏水100ml，条件:pH 6.5、灭菌温度121°C、灭菌时间20 min ；
(5)菌种保藏:将复筛得到的菌种在斜面培养基上划线，40-45°C培养3天，然后置于4°C冰箱保存；其中，斜面培养基为:葡萄糖lg、蛋白胨lg、NaCl 0.5g、琼脂1.5g和蒸馏水100ml,条件:pH6.5~6.8、灭菌温度121°C、灭菌时间20min ；
(6)3-半乳糖苷酶酶活性测定:取500UL待测酶液加入到已经预热到65°C的1.5 mL含有2 mmol/L ONPG的0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.5)中，65°C水浴保温10 min后，加入ImL lmol/L的碳酸钠溶液终止反应，J4tl5测定光吸收值，计算水解产物邻硝基酚的含量和酶的活性，同时以0.1 mol/L pH 6.5磷酸酸缓冲液代替酶液作为对照，乳糖酶活性的定义:1个单位的乳糖酶的活性为在pH 6.5、65°C下每分钟分解ONPG生成I y mo I邻硝基酚(ONP)所需的酶量。
[0023]实施例2:产耐高温P -半乳糖苷酶菌株F69形态及生理生化特征。
[0024]本发明所述的筛选方法得到的产(6-半乳糖苷酶菌株在牛肉膏蛋白胨培养基平板培养18-24h后，观察菌落及菌体形态，表面较粗糙，边缘不整齐，菌落污白色，革兰氏染色呈阳性；菌体的形态为短杆棒状；菌体大小为0.65-0.7 u mX2.5-3 u m ;在菌体中央形成内生芽孢，芽孢形成后菌体不膨大；菌体无荚膜，周生鞭毛，菌体具有运动性；革兰氏阳性；在液体培养基中生长，形成皱醭；纤维素分解实验呈阴性；在糖类发酵实验中，该菌株可利用可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、麦芽糖和蔗糖做唯一性碳源生长；在其他生理生化检测中，该菌株接触酶阳性、V.P测定呈阳性，能水解淀粉、酪蛋白，液化明胶，能利用柠檬酸盐，硝酸盐还原阳性，石蕊牛奶还原阳性，尿素利用阴性，不产生荧光色素，甲基红实验呈阳性；菌株F69具体的形态学及生理生化特征见表1，菌落、染色特征和生理生化特征与《伯杰细菌鉴手册》(第八版)中的枯草芽孢杆菌接近，可确定菌株F69为枯草芽孢杆菌{Bacillus subtilis、。
[0025]表1菌株F69形态学及生理生化特性
【权利要求】
1.一种发酵产耐高温(6-半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株F69的分类命名为枯草芽孢杆菌{Bacillus,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期:2012年I月9日，保藏编号为=CGMCC N0.5699。
2.根据权利要求1所述的一种发酵产耐高温(6-半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株F69 (CGMCC N0.5699)具有以下特性: (1)生长条件:枯草芽孢杆菌sy况27i50F69所产P-半乳糖苷酶的生长温度55~75°C，最适生长温度65°C ； (2)酶活性:在50°C~80°C下保温90min，残余酶活在80%以上，在80°C和90°C下保温60min，残余酶活分别为85%和65% ; (3)弱酸性:在pH5.5~7.5之间酶活性在80%以上，在pH 4.5~7.5之间保持81%以上的酶活性，最适作用pH为6.5。
3.基于权利要求1所述的一种发酵产耐高温(6-半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于依次包括如下具体步骤: 步骤一，富集培养:取土样Ig研细，加入装有80ml无菌水的250ml三角瓶中，加入无菌玻璃珠，在150r/min摇床中振荡20min，然后在80°C震荡水浴摇床中震荡30 min，取1-2ml于50 mL富集培养基中，40°C恒温水浴振荡培养36h_48h，震荡频率为150_180r/min ； 步骤二，初筛:将富集后的培养液进行10倍梯度稀释至稀释倍数为10_8，分别取10_6、.10_7、10_8三个梯度的稀释液0.2ml涂布在初筛分离培养基平板上，平板晾至表面没有流动液体时，在40~42°C恒温培养箱中倒置培养24~36h，然后将培养温度降到32~35°C，继续培养24~72h ;挑取蓝色菌落至另一个初筛分离培养基上，培养条件为:温度40~42°C，培养时间30~36h ;经培养后菌落呈现深浅不一的蓝色，进一步选取蓝色较深的菌株划线纯化； 步骤三，菌株纯化:将初筛出来的菌株，于牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，置于40~.42°C恒温培养箱中培养48h，重复划线培养三次以上，如连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化； 步骤四，复筛:初筛后将经过纯化的菌株接种到种子培养基中，容量为250ml的三角瓶装液量为30ml，在温度为40~45°C，震荡频率为160~180r/min下，恒温震荡摇床培养.18-22h，然后按照4~6%的接种量接种到复筛发酵培养基中，摇床震荡发酵培养，发酵条件为:在250ml三角瓶中装培养基30~50ml，摇床震荡频率为160_200r/min，发酵温度40~.45°C，发酵时间为36~48h，发酵结束后，发酵液8000r/min离心lOmin，上清液为粗酶液，测定各粗酶液的3 -半乳糖苷酶酶活性，其中菌株F69产3 -半乳糖苷酶活性最强，活力高达 182U/ml ； 步骤五,菌种保藏:将复筛得到的菌种在斜面培养基上划线，40~45°C培养3天,然后置于4°C冰箱保存； 步骤六，(6-半乳糖苷酶酶活性测定:取500 UL待测酶液加入到已经预热到65°C的.1.5 mL 含有 2 mmol/L ONPG 的 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.5)中，65°C水浴保温 10 min后，加入ImL lmol/L的碳酸钠溶液终止反应，Aci5测定光吸收值，计算水解产物邻硝基酚的含量和酶的活性，同时以0.1 mol/L pH 6.5磷酸酸缓冲液代替酶液作为对照，乳糖酶活性的定义:1个单位的乳糖酶的活性为在pH 6.5、65°C下每分钟分解ONPG生成I y mo I邻硝基酚(ONP)所需的酶量。
4.根据权利要求3所述的一种发酵产耐高温(6-半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于步骤一所述的富集培养基为:乳糖2g、酵母粉0.5g、蛋白胨lg、NaCl 0.5g和蒸懼水100ml,条件:pH 6.5、灭菌温度121°C、灭菌时间20 min。
5.根据权利要求3所述的一种发酵产耐高温(6-半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于步骤二所述的初筛分离培养基为:乳糖2g、酵母粉0.5g、蛋白胨lg、NaCl 0.5g、蒸懼水100ml和琼脂1.5g，条件:pH 6.5、灭菌温度121°C、灭菌时间20 min，然后冷却至60。。，加入用0.25 ii m的微滤膜过滤除菌的X-Gal (30mg/L) 40 U 1，混匀，倒平板。
6.根据权利要求3所述的一种发酵产耐高温(6-半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于步骤四所述的种子培养基为:蛋白胨lg、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.5g和蒸馏水lOOmL，条件:pH 6.5、灭菌温度121°C、灭菌时间20 min ;复筛发酵培养基为:乳糖2g、酵母粉0.5g、蛋白胨lg、NaCl 0.5g和蒸馏水100ml，条件:pH 6.5、灭菌温度121°C、灭菌时间20 min。
7.根据权利要求3所述的一种发酵产耐高温(6-半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于步骤五所述的斜面培养基为:葡萄糖lg、蛋白胨lg、NaCl 0.5g、琼脂1.5 g和蒸懼水100ml,条件:pH6.5~6.8、灭菌温度121°C、灭菌时间20min。
【文档编号】C12N9/38GK103614313SQ201310455589
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】高兆建, 李勇, 张桂英, 张建萍, 张家路, 司瑞寒, 田圣英 申请人:徐州工程学院