枣疯病植原体环介导等温扩增快速检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种枣疯病植原体环介导等温扩增快速检测方法，本发明针对枣疯病植原体16S?rDNA基因保守序列的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温62℃左右，几十分钟即可实现核酸的高效扩增；4条引物对靶序列的6个特异序列区域的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性；LAMP不需要模板的热变性，长时间温度循环，在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的浪费，使反应速度可提高30-50％；反应结束后，可直接通过肉眼观察反应管颜色变化，或通过凝胶电泳判断检测结果；该技术对枣疯病植原体的检测特异性强，具有快速、高效、仪器要求简易，操作简便，成本低，易于在基层推广使用的特点。
【专利说明】枣疯病植原体环介导等温扩增快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体的说本发明涉及一种利用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术检测率疯病植原体的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]枣疯病(Juiube witches’broom, JWB)又称“枣癌症”是由植原体病原侵染导致的、在枣树生产中危害最严重的毁灭性病害。植原体原称类菌原体，为单细胞原核生物，无细胞壁，由生物膜包围，可引起多种病害。根据植原体16S rDNA基因序列为对象进行分析，可将植原体分为28个组。其中引起枣疯病的枣疯病植原体与榆树黄化植原体、葡萄金黄化植原体等同为榆树黄化组成员。枣疯病分布范围广，传播速度快，致病力强，树体一旦感病，终身携带，传统的病害防治技术和栽培技术难以治愈。我国多数枣树主栽品种对枣疯病敏感，全国每年因枣疯病死树高达千万株，直接经济损失高达数亿元，严重阻碍了枣树产业的发展。要从根本上解决枣疯病的防治问题是采取有效的预防措施，加强种苗(接穗、砧木)的检疫检验，采用健康苗木(砧木、接穗)，建立无病苗木繁育体系，从源头上杜绝病原才是控制枣疯病发生蔓延的根本途径，而建立和应用先进的病原检测技术是红枣无病苗木生产的核心所在。
[0003]植原体自发现后，其检测技术的发展一直没有大的突破。传统的电镜观察、血清学等检测方法因为灵敏度低、周期长和操作繁琐等不足，已不能满足现代生产的需要。随着分子生物学技术引入植原体病害研究领域，植原体鉴定和检测技术才得到了较快的发展，如普通PCR、巢氏PCR、实时荧光PCR等，但这些方法不仅需要PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪等昂贵的仪器设备，且操作程序繁 琐复杂、时间长，对检测人员有较高的技术要求，大大限制了作为快速诊断方法的使用和推广。
[0004]环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是 Notomi等在2000年开发的一种恒温核酸扩增方法，具有特异性强、操作简单、不需要复杂的仪器，肉眼可直接观察检测结果，其高效性、简易性、成本低廉且检测周期短等特点非常适合于基层及现场使用。该技术针对目的基因的6个区段，设计4条特异引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在一定温度下对核酸进行等温扩增，近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体的检测。此前，已有应用在肺炎链球菌、西尼罗病毒、SARS病毒、番爺黄叶病毒、山药嵌纹病毒、肺炎支原体等病原微生物的检测以及登革病毒的分型等方面的报道，目前，尚未见利用环介导等温扩增方法检测枣疯病植原体的报道。
【发明内容】
[0005]目前针对现有技术中未见专门利用环介导等温扩增技术检测枣疯病植原体的技术现状，本发明旨在提供一种枣疯病植原体的环介导等温扩增检测方法，能够进行快速、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有技术的不足。
[0006]本发明通过以下技术方案实现的:本发明根据枣疯病植原体分离物16S rDNA基因的保守序列，设计了枣疯病植原体LAMP特异性引物，确定反应条件和试剂浓度并进行优化，建立了枣疯病植原体的LAMP快速检测体系，此方法对枣疯病植原体的检测特异性强，Ih即可获得检测结果，具有快速、高效、简易的特点。
[0007]本发明提供了一种建立枣疯病植原体的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤。
[0008](I)提供一套用于检测枣疯病植原体的LAMP反应特异性引物序列，具体的寡聚核苷酸序列为:
[0009]F3:5/ -GTCTGCAACTCGACTTCATGAA-3'
[0010]B3:5/ -TAACCCCAATCATCAACCCTA-3'
[0011]FIP:5/ -GGTGTGTACAAACCCCGAGAACGTTTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATC-3'
[0012]BIP:5/ -AAACCACGAAAGTTAGCAATACCCGTTTTCCTTAGACAGCTCCCTCTTCTTGC-3'。
[0013](2)提供枣疯病植原体的LAMP检测方法，即首先从待检测样品中制备反应模板，并配制LAMP反应体系，然后通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增。
[0014](3)最后通过日光下肉眼观察或电泳检测待测样品中是否含有枣疯病植原体。
[0015]具体的，本发明提供了一种枣疯病植原体的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤:
[0016](I)设计用于检测率疯病植原体的LAMP引物:首先在Genebank中搜集全部植原体及有代表性细菌的16S rDNA核 酸序列，利用Omiga软件对上述序列进行比较及一致性分析，找出枣疯病植原体与其他植原体的基因差异位点和高度保守区域，利用LAMP引物在线设计软件 Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)针对枣疯病植原体16S rDNA基因保守序列的6个区域设计出I套特异性引物，包括I对外引物F3、B3和I对内引物FIP、BIP，引物由上海生工生物工程公司按照PAGE纯度级别合成。
[0017]引物序列如下所示:
[0018]F3:5/ -GTCTGCAACTCGACTTCATGAA-3'
[0019]B3:5/ -TAACCCCAATCATCAACCCTA-3'
[0020]FIP:5/ -GGTGTGTACAAACCCCGAGAACGTTTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATC-3'
[0021]BIP:5/ -AAACCACGAAAGTTAGCAATACCCGTTTTCCTTAGACAGCTCCCTCTTCTTGC-3'。
[0022](2)植物总DNA的提取:采用植物基因组提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit,TIANGEN)提取枣树叶片总DNA，置于-40C冰箱贮存备用。
[0023](3)配制LAMP反应体系:反应体系为25 μ L，各组分的用量为，8U/ μ L的Bst DNA聚合酶 L O μ L，I X ThermoPol 反应缓冲液 2.5 μ L, I Ommol/L 的 dNTP2.5 μ L，1.0mmol/L 的Betain2.0yL, 25mmol/L 的 MgS044.0uL, 1.8 μ mol/L 的引物 FIP,BIP 各 2.0 μ L，0.2 μ mol/L 的引物 F3、B3 各 0.5 μ L，625 μ mol/L 的 Calceinl.0 μ L，12.5mmol/L 的 MnCl2L 0 μ L，模板 DNA1.0 μ L，补足灭菌 ddH20 M 25 μ L0
[0024](4)通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增:将混合物置于62 °C恒温反应60min,8CTC灭活 5min。
[0025](5) LAMP扩增产物的分析:
[0026]分析方法1:琼脂糖凝胶电泳，扩增产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色15min后，在凝胶成像系统上成像。分析方法2:在日光下，肉眼观察反应管中颜色的变化。
[0027](6)结果的判定:在分析方法I中，在凝胶成像系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，若出现梯形条带判定为阳性，反之，为阴性。在分析方法2中，若扩增产物变为翠绿色则判定为阳性反应，即样品中感染有枣疯病植原体，若扩增产物仍为棕黄色则判定为阴性。
[0028]通过实施本发明具体的
【发明内容】
，可以达到以下效果:本发明针对枣疯病植原体16S rDNA基因中6个不同区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等温60°C左右，几十分钟即可实现核酸的高效扩增，4条引物对靶序列的6个特异序列区域的识别，保证了 LAMP扩增的高度特异性。另外本发明使用Calcein+MnCl2替代了 SYBR Green，在配置环介导等温扩增反应液时就加入反应液中，仅在发生环介导等温扩增反应时才呈现翠绿色，避免了常规环介导等温扩增方法需在反应结束后加入SYBRGreen染液显色造成的假阳性问题，具有更好的特异性。环介导等温扩增反应不需要模板的热变性，长时间温度循环，在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的浪费，使反应速度可提高30-50%，只在水浴锅中Ih即可完成检测枣疯病植原体。
[0029]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0030](I)特异性强:所用的特异性引物针对枣疯病植原体16S rDNA基因中6个不同区域设计，特异性超过常规PCR。
[0031](2)灵敏度高:对枣疯病植原体检测的灵敏比普通PCR方法高100倍以上。
[0032](3)检测快捷Adna的提取，到检测完毕用时约2h，而常规pcr需要5h以上，节省检测时间。
[0033](4)经济实用:不需要昂贵的的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只要水浴锅或金属浴就能完成检测反应。
`[0034](5)操作简便、结果明显:整个检测过程不涉及复杂仪器或设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作；结果可直接通过肉眼观察鉴定，阳性结果为翠绿色，阴性结果为棕黄色。
[0035](6)对人和环境安全:避免了常规PCR检测过程使用溴化乙锭等有毒化学药品，对人和环境都较为安全。
[0036]总之，本发明采用的环介导等温扩增技术，具有反应时间短、特异性强、灵敏度高等特点，具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1:枣疯病植原体DNA环介导等温扩增产物的电泳检测结果。图中泳道M为IOObp DNA Ladder，泳道I为阴性对照，泳道2_4为枣疯病植原体总DNA。
[0038]图2:肉眼检测枣疯病植原体DNA环介导等温扩增产物。图中I为阴性对照,2_4为枣疯病植原体总DNA。
[0039]图3-4:枣疯病植原体环介导等温扩增检测方法的特异性试验结果。图中1、2、3分别代表采用泡桐丛枝植原体DNA、翠菊黄化植原体DNA、葡萄金黄化植原体DNA作为模板时的LAMP检测结果，4~7代表采用枣疯病植原体DNA作为模板时的LAMP检测结果，8为健康枣树DNA，9为灭菌双蒸水对照。
[0040]图3:琼脂糖(2.0% w/v)电泳使用EB染色显示LAMP反应特异性。[0041 ] 图4:肉眼检测LAMP反应特异性。
[0042]图5-7:枣疯病植原体LAMP检测方法与常规PCR检测方法间的灵敏度比较。图中泳道M为IOObp DNA Ladder,泳道1_7分别对应采用10倍梯度稀释的DNA模板即DNA浓度为43ng/ μ L~4.3fg/ μ L时的扩增情况，泳道8为灭菌双蒸水对照。
[0043]图5:琼脂糖(2.0% w/v)电泳使用EB染色显示LAMP反应灵敏度。
[0044]图6:肉眼检测LAMP反应灵敏度。
[0045]图7:琼脂糖(1.0% w/v)电泳使用EB染色显示常规PCR反应灵敏度。
【具体实施方式】
[0046]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0047]本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。
[0048]试验药品:植物基因组提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit, TIANGEN)、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)、Tap DNA聚合酶购自北京天根生化科技有限公司；Bst DNA聚合酶大片段、I X ThermoPol反应缓冲液为北京纽英伦NEB生物技术有限公司产品；甜菜碱(Betain)、钙黄绿素(Calcein)购自上海生工生物工程公司。
[0049]试验材料:以常规PCR检测到的含有枣疯病植原体的枣树叶片总DNA为材料，健康枣树叶片总DNA和灭菌双蒸水为阴性对照。
[0050]本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0051]实施例1引物的制备
[0052]1.引物的设计和合成:首先从Genebank中搜集全部植原体及有代表性细菌的16S rDNA核酸序列，利用Omiga软件对上述序列进行比较及一致性分析，找出枣疯病植原体与其他植原体的基因差异位点和高度保守区域，利用LAMP在线引物设计软件PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)针对率疯病植原体16S rDNA基因保守序列的6个区域设计了多组引物，然后根据引物所在区域的保守性、弓丨物的发夹结构、二聚体GC含量以及Tm值等综合因素，选取出I套特异性引物，包括I对外引物F3、B3和I对内引物FIP、BIP，引物由上海生工生物工程公司按照PAGE纯度级别合成。
[0053]引物序列如下所示:
[0054]F3:5/ -GTCTGCAACTCGACTTCATGAA-3'；
[0055]B3:5/ -TAACCCCAATCATCAACCCTA-3'；
[0056]FIP:5/ -GGTGTGTACAAACCCCGAGAACGTTTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATC-3'；
[0057]BIP:5/ -AAACCACGAAAGTTAGCAATACCCGTTTTCCTTAGACAGCTCCCTCTTCTTGC-3'。
[0058]2.引物的准备:引物合成后，用灭菌双蒸水分别稀释为ΙΟμπιοΙ/L，将引物置于-20°C冰箱避光保存备用。
[0059]实施例2枣疯病植原体环介导等温扩增检测方法的建立
[0060]1.植物总DNA的提取
[0061]采用植物基因组提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)提取枣树叶片总DNA,置于_40°C冰箱贮存备用。
[0062]2.建立并优化枣疯病植原体环介导等温扩增反应体系及反应程序
[0063]反应体系及反应条件的初步建立:枣疯病植原体LAMP反应体系为25 μ L，各组分的用量为:8U/yL 的 Bst DNA 聚合酶 0.8 μ L，I X ThermoPol 反应缓冲液 2.5 μ L，10mmol/L的 dNTP2.0 μ L，1.0mmol/L 的 Betain2.0yL, 25mmol/L 的 MgS045.0uL, 1.8 μ mol/L 的引物FIP、BIP 各 2.Ομ L,0.2ymol/L 的引物 F3、B3 各 0.5 μ L,625 μ mol/L 的 Calceinl.0 μ L,12.5mmol/L的MnCl2L O μ L，模板DNA1.0yL,补足灭菌ddH20 M 25 μ L0混匀后将混合物置于60°C恒温反应60min,80°C灭活5min。
[0064]将反应温度按55°C~68°C依次递增，多次重复试验后确定最佳退火温度。对构建反应体系的主要影响因素在如下范围内进行优化:外引物与内引物浓度比(1:1~1:16)、dNTP(0.Smmol/I,~3.0mmol/L)、MgSO4(2.0mmol/L ~12mmol/L)、Bst DNA 聚合酶(1.6U/μ L ~11.2U/ μ L)。
[0065]每次检测时，设置阴性对照，在阴性对照和阳性对照均成立时，整个实验有效，可判定结果。
[0066]环介导等温扩增反应结果的判定:如图1所示，通过琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，若出现梯形条带判定为阳性，反之，为阴性。或通过肉眼观察反应管中颜色的变化(图2)，若扩增产物变为翠绿色则判定为阳性反应，即样品中感染有枣疯病植原体，若扩增产物仍为棕黄色则判定为阴性。
[0067]通过各反应条件的优化，最终确定枣疯病植原体环介导等温扩增最佳反应体系为 25 μ L:8U/ μ L 的 Bst DNA 聚合酶 L O μ L，I X ThermoPol 反应缓冲液 2.5 μ L, I Ommol/L的 dNTP2.5 μ L，1.0mmol/L 的 Betain2.0yL, 25mmol/L 的 MgS044.0uL, 1.8 μ mol/L 的引物FIP、BIP 各 2.Ομ L,0.2ym`ol/L 的引物 F3、B3 各 0.5 μ L,625 μ mol/L 的 Calceinl.0 μ L,12.5mmol/L 的 MnCl2L O μ L，模板 DNA1.0yL,补足灭菌 ddH20 M 25 μ L0
[0068]最佳反应条件为:621^恒温反应60min,8(TC灭活5min。
[0069]实施例3特异性检验
[0070]按上述实施例2所建立的枣疯病植原体环介导等温扩增反应体系，同时对枣疯病植原体(榆树黄化组)，葡萄金黄化植原体(榆树黄化组)，泡桐丛枝植原体(翠菊黄化组)，翠菊黄化植原体(翠菊黄化组)，田间采集及实验室保存的健康枣树基因组DNA以及灭菌双蒸水作为模板，进行枣疯病植原体环介导等温扩增的特异性试验。
[0071]分别提取健康枣树、枣疯病植原体、葡萄金黄化植原体，泡桐丛枝植原体，翠菊黄化植原体的基因组DNA以及灭菌双蒸水作为模板。
[0072]按照上述实例2中确定的最佳反应体系和最佳反应条件进行环介导等温扩增反应。
[0073]环介导等温扩增反应结果的判定:通过琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，若出现梯形条带判定为阳性，反之，为阴性。或通过肉眼观察反应管中颜色的变化，若扩增产物变为绿色则判定为阳性反应，即样品中感染有枣疯病植原体，若扩增产物仍为棕黄色则判定为阴性。
[0074]判断结果如图3、图4所示，只有枣疯病植原体DNA表现为阳性反应，肉眼观察可见翠绿色，琼脂糖凝胶电泳呈特征性梯形条带。而同属植原体榆树黄化组的葡萄金黄化植原体和属于植原翠菊黄化组的泡桐丛枝植原体、翠菊黄化植原体以及健康枣树均为阴性。由此可见，本发明建立的环介导等温扩增检测方法对枣疯病植原体有较强的特异性，能较好的区分不同组间及组内的植原体，特异性较好。特异性验证通过后，即表明该检测方法可应用于枣疯病植原体的检测。
[0075]实施例4灵敏度检测
[0076]采用植物基因组提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)提取感染了枣疯病植原体的枣树叶片总DNA，以此作为模板，用灭菌双蒸水进行10倍梯度稀释(43ng/l.! L~43fg/y L)，按照上述实例2中的最佳反应体系和最佳反应条件进行环介导等温扩增，同时进行常规PCR检测进行灵敏度比较。
[0077]结果如图5、图6所示，环介导等温扩增技术可检测到的最小DNA浓度为4.3pg/μ L(琼脂糖凝胶电泳可见梯形条带，肉眼观察可见翠绿色)。
[0078]常规PCR检测:以10倍梯度稀释的DNA为模板，R16mF2:5’ -CATGCAAGTCGAACGGA-3’，R16mR2:5’ -CTTAACCCCAATCATCGA-3’ 为扩增引物进行常规 PCR扩增。常规PCR扩增体系为25 μ L:DNA模板l.0yL, 10 μ mol/L的引物各1.0 μ L，IOmmol/L 的 dNTPl.0μ L, 10XPCR Buffer (2.5mmol/L MgCl2) 2.5 μ L, 2.5U/μ L 的 TaqDNA 聚合酶0.3μ L，灭菌 ddH2018.2μ L。扩增程序:94°C预变性 6min ;94°C变性 45s，52°C复性 45s，72°C延伸lmin, 35个循环，72°C延伸IOmin0
[0079]琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示，常规PCR扩增得到预期扩增片段大小约为1500bp，其最小检出限为430 μ g/ μ L。
[0080]由此可以看出，本发明建立的环介导等温扩增检测方法的敏感性比常规PCR高100 倍。`
【权利要求】
1.一种枣疯病植原体环介导等温扩增检测方法，其特征在于它的方法包括以下两部分: (1)提供两对用于检测枣疯病植原体的LAMP引物序列，即长度分别为22bp、21bp、50bp和53bp的寡聚核苷酸序列，依次命名为F3、B3、FIP和BIP，上述两对LAMP引物的寡聚核苷酸序列如下:
F3:5’ -GTCTGCAACTCGACTTCATGAA-3’
B3:5， -TAACCCCAATCATCAACCCTA-3’
FIP:5’ -GGTGTGTACAAACCCCGAGAACGTTTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATC-3，
BIP:5’ -AAACCACGAAAGTTAGCAATACCCGTTTTCCTTAGACAGCTCCCTCTTCTTGC-3， (2)提供一种枣疯病植原体的LAMP检测方法，即首先从待测样品中制备反应模板，并配置LAMP反应体系，然后通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增，最后根据反应混合物的颜色显示或通过琼脂糖凝胶电泳检测，判断检测结果。
2.如权利要求1所述用于检测枣疯病植原体的2对LAMP引物，其特征在于，其设计的方法是:在Genebank中搜集全部植原体及有代表性细菌的16S rDNA核酸序列,利用Omiga软件对上述序列进行比较及一致性分析，找出枣疯病植原体与其他植原体的基因差异位点和高度保守区域，利用LAMP引物在线设计软件Primer Explorer V4针对枣疯病植原体16SrDNA基因保守序列的6个区域设计出I套特异性引物，包括I对外引物F3、B3和I对内引物FIP、BIP。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的枣疯病植原体LAMP检测方法具体为:(1)模板的提取:采用植物 基因组提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit,TIANGEN)提取枣树叶片总DNA作为模板； (2)以提取的植物总DNA为模板，分别设阳性对照、健康植株总DNA对照及无菌双蒸水对照，采用权利要求1所述的引物组进行环介导等温扩增检测； (3)所述的环介导等温扩增反应体系为25μ L包括:8U/yL的Bst DNA聚合酶1.0 μ L，I X ThermoPol 反应缓冲液 2.5 μ L, 10mmol /I,的 dNTP2.5 μ L, 1.0mmol/L 的 Betain2.0 μ L,25mmol/L 的 MgS044.0uL, 1.8 μ mol/L 的引物 FIP、BIP 各 2.0 μ L，0.2 μ mol/L 的引物 F3、B3各 0.5 μ L，625 μ mol/L 的 Calceinl.0yL, 12.5mmol/L 的 MnCl2L OyL,模板 DNA1.0 μ L，补足灭菌ddH20至25 μ L ; (4)所述的环介导等温扩增反应程序:62°C恒温反应60min,80°C灭活5min； (5)环介导等温扩增反应结果分析:分析方法1:琼脂糖凝胶电泳，反应结果通过2%的琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色15min后，在凝胶成像系统上成像，若出现梯形条带判定为阳性，反之，为阴性。分析方法2:在日光下，肉眼观察反应管中颜色的变化，若扩增产物变为翠绿色则判定为阳性反应，即样品中感染有枣疯病植原体，若扩增产物仍为棕黄色则判定为阴性。
【文档编号】C12Q1/04GK103497998SQ201310455621
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】韩剑, 罗明, 张祥林, 何贵伦, 殷智婷 申请人:新疆农业大学