一种制备磷脂酰丝氨酸的方法
【专利摘要】一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，包括以下步骤：将磷脂酰胆碱或含有磷脂酰胆碱的天然磷脂与吐温-80、L-丝氨酸、氯化钙、缓冲溶液、磷脂酶D混合，在35-45℃搅拌反应8-10h；反应结束后反应粗品析出并上浮，离心分离水相和反应粗品，将分离得到的反应粗品用水洗涤，并离心过滤；离心过滤后的反应粗品加入无水乙醇浸泡，搅拌，再离心过滤；对离心过滤后产物真空干燥，即得磷脂酰丝氨酸产品。本发明的目的是提供一种新的制备磷脂酰丝氨酸的方法，以解决现有技术存在的副产物磷脂酸较多，转化率不理想，生产成本高的问题。
【专利说明】一种制备磷脂酰丝氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备稳定的粉末磷脂酰丝氨酸的方法。
【背景技术】 [0002]磷脂是磷酸甘油脂的简称，对生物膜的生物活性和机体的正常代谢有重要的调节功能。通常所说的磷脂是指含有磷元素的脂肪物质，它是多种磷脂的混合物，成分主要为磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)等。
[0003]磷脂酰丝氨酸是一种唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能的磷脂，对许多细胞代谢过程有重要的调节作用，其主要功能是可提高脑细胞活力，对治疗脑萎缩、预防老年痴呆症，改善老年人的大脑功能有很好的疗效；同时修复大脑损伤、治疗儿童多动症具有非常显著的作用；另外可以促进脑疲劳的恢复、平衡情绪、缓解抑郁也有一定的疗效。
[0004]磷脂酰丝氨酸的制备方法主要有提取法和酶转化法。其中提取法主要是从植物细胞、动物的卵磷脂中提取PS，植物中的PS含量较少，所以提取法以动物的卵磷脂中提取为主，从动物中提取主要是动物的大脑及内脏，目前国外大部分以牛、羊、兔、马、驴等家禽的动物脑为原料来提取PS。近年来，由于疯牛病的等动物疾病的原因，利用动物细胞提取PS的方法，其提取的产品的安全性收到人们的怀疑，现在已处于淘汰边缘。
[0005]酶转化法主要是以天然的卵磷脂为基质，加入丝氨酸，在磷脂酶D的作用下，生成磷脂酰丝氨酸。科学文献和专利报道了将磷脂酰胆碱通过磷脂酶D催化为磷脂酰丝氨酸的方法，这些方法大部分是通过水/有机溶剂的两相体系，但两相体系有机溶剂使用量大，难以除去，同时增加了反应成本。有研究者开始研究单一水相反应，专利EP1310563描述了在不使用洗涤剂和/或钙盐的水相中制备PS的方法，该方法需要在水中将包括磷脂，羟基接受体和磷脂酶的起始混合物匀浆。专利JP2002051794和DE102004002053公布的在纯水体系中制备PS的方法也要借助特殊的均质化设备。专利CN101230365采用单一水相，但水相用量大，最大用到了反应基质的10倍，其L-丝氨酸的用量为反应基质的4-6倍量，同时在反应结束后用到了有机溶剂萃取，引入了有机溶剂的同时也增加了反应成本。专利CN102676600描述了在均相介质Y-戊内酯、2-甲基四氢呋喃或其混合物中进行反应，增加了生产成本。而在专利CN101230365中反应时间长，反应温度高，造成反应产物中PA含量高，PS转化率低，反应产物品质差。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种新的制备磷脂酰丝氨酸的方法，以解决现有技术存在的副产物磷脂酸较多，转化率不理想，生产成本高的问题。
[0007]本发明采用如下解决方案:
[0008]一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，主要包括以下步骤:
[0009](I)将磷脂酰胆碱或含有磷脂酰胆碱的天然磷脂与吐温-80、L-丝氨酸、氯化钙、缓冲溶液、磷脂酶D混合，在35-45°C搅拌反应8-10h ；
[0010]其中，吐温-80为天然磷脂质量的0.1-ο.5%，L-丝氨酸为天然磷脂质量的2-3倍，缓冲溶液的PH值为5.1-5.5，缓冲溶液的加入量为天然磷脂质量的5-6倍，磷脂酶D的加入量为每g天然磷脂20-50U，氯化钙与缓冲溶液的比例为1.5-1.8g/100mL ；
[0011](2)反应结束后反应粗品析出并上浮，离心分离水相和反应粗品，将分离得到的反应粗品用水洗涤，并离心过滤；
[0012](3)离心过滤后的反应粗品加入无水乙醇浸泡，搅拌，再离心过滤；
[0013](4)对离心过滤后产物真空干燥，即得磷脂酰丝氨酸产品。
[0014]基于上述基本方案，本发明还作如下优化限定和改进:
[0015] 上述缓冲溶液的配置选用醋酸-醋酸钠体系或磷酸氢二钠-磷酸体系。
[0016]上述步骤(3)中无水乙醇加入量为此时反应粗品质量的2-4倍，无水乙醇浸泡2-4h后搅拌l_2h，再离心过滤。
[0017]上述步骤(2)中水洗涤倍量为此时反应粗品的0.5-1倍。
[0018]上述步骤(4)中真空干燥的参数为温度50±2°C，真空度0.08±0.005Mpa。
[0019]本发明所述的天然磷脂来源广泛，优选大豆磷脂、葵花籽磷脂、蛋黄磷脂。其中磷脂酰胆碱含量在10-95%均可发生反应，更优选经纯化后的高含量磷脂酰胆碱。
[0020]本发明所述的磷脂酶D可来源于植物和微生物。植物来源包括白菜、菠菜、甘蓝、胡萝卜等，微生物来源包括链霉菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌等，优选酶活较高的链霉菌产酶。[0021 ] 本发明的有益效果和特点:
[0022]本发明利用吐温-80的乳化作用使反应基质形成胶状，无需特殊的均质化设备，同时缩短了反应时间增加了转化率。
[0023]在整个工艺过程除乙醇外无其它有机溶剂带入，保证了产品的绿色健康。经试验证明反应产物用无水乙醇浸泡可破坏掉带入产品中的磷脂酶D活性，使产品稳定性更好，同时无水乙醇可溶解掉反应产物中的油溶性成分，使最终产品的流动性，味道，色泽更好，可以更好地用来制备含磷脂酰丝氨酸的胶囊或其他保健食品。
[0024]整个工艺流程简单，反应速度快，周期短、投资小，成本低。反应产物收率高，纯度闻，品质好。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明做详细说明。
[0026]实施例1
[0027]在反应罐中加入20g磷脂酰胆碱含量为50.98%的大豆磷脂，L-丝氨酸40g，吐温-800.02g,氯化钙1.6g，缓冲溶液选用醋酸钠-醋酸体系，PH值5.5，缓冲溶液加入量IOOmL,磷脂酶D酶活为5000U/g，加入量为l00mg。搅拌并保持反应温度37°C，反应时间8h,检测转化率，离心过滤，离心后滤渣加入水20mL洗涤三次，并离心过滤的反应粗品，反应粗品加入无水乙醇100mL,浸泡2h后搅拌lh，离心过滤，真空干燥得到17.28g PS含量为56.48%的粉末磷脂。
[0028]实施例2
[0029]在反应罐中加入50g磷脂酰胆碱含量为80.68%的葵花籽磷脂，L-丝氨酸150，吐温-800.2g，氯化钙6.0g,缓冲溶液选用醋酸钠-醋酸体系，PH值5.3，缓冲溶液加入量400mL，磷脂酶D酶活为5000U/g，加入量为400mg。搅拌并保持反应温度40°C，反应时间IOh,检测转化率，离心过滤，离心后滤渣加入水50mL洗涤三次，并离心过滤的反应粗品，反应粗品加入无水乙醇400mL，浸泡2h后搅拌lh，离心过滤，真空干燥得到44.88g PS含量为87.75%的粉末磷脂。
[0030]实施例3
[0031]在反应罐中加入50g磷脂酰胆碱含量为21.62%的大豆磷脂，L-丝氨酸100g，吐温-800.25g，氯化钙6.0g,缓冲溶液选用磷酸氢二钠-磷酸体系，PH值5.1，缓冲溶液加入量300mL，磷脂酶D酶活为5000U/g，加入量为220mg。搅拌并保持反应温度37°C，反应时间IOh,检测转化率，离心过滤，离心后滤渣加入水50mL洗涤三次，并离心过滤的反应粗品，反应粗品加入无水乙醇300mL，浸泡a后搅拌lh，离心过滤，真空干燥得到33.89g PS含量为30.27%的粉末磷脂。
[0032]实施例4
[0033]在反应罐中加入50g磷脂酰胆碱含量为30.89%的蛋黄磷脂，L-丝氨酸120g，吐温-800.15g，氯化钙8.0,缓冲溶液选用磷酸氢二钠-磷酸体系，PH值5.3，缓冲溶液加入量500mL，磷脂酶D酶活为5000U/g，加入量为400mg。搅拌并保持反应温度37°C，反应时间8h,检测转化率，离心过滤，离心后滤渣加入水50mL洗涤三次，并离心过滤的反应粗品，反应粗品加入无水乙醇400mL，浸泡a后搅拌lh，离心过滤，真空干燥得到41.27g PS含量为35.78%的粉末磷脂。
[0034]各实施例中反应产物成分含量以及转化率见下表1。
[0035]
【权利要求】
1.一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，主要包括以下步骤: (1)将磷脂酰胆碱或含有磷脂酰胆碱的天然磷脂与吐温-80、L-丝氨酸、氯化钙、缓冲溶液、磷脂酶D混合，在35-45°C搅拌反应8-10h ； 其中，吐温-80为天然磷脂质量的0.1-0.5%，L-丝氨酸为天然磷脂质量的2-3倍，缓冲溶液的PH值为5.1-5.5，缓冲溶液的加入量为天然磷脂质量的5-6倍，磷脂酶D的加入量为每g天然磷脂20-50U，氯化钙与缓冲溶液的比例为1.5-1.8g/100mL ； (2)反应结束后反应粗品析出并上浮，离心分离水相和反应粗品，将分离得到的反应粗品用水洗涤，并离心过滤； (3)离心过滤后的反应粗品加入无水乙醇浸泡，搅拌，再离心过滤； (4)对离心过滤后产物真空干燥，即得磷脂酰丝氨酸产品。
2.根据权利要求1所述的制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于: 所述缓冲溶液的配置选用醋酸-醋酸钠体系或磷酸氢二钠-磷酸体系。
3.根据权利要求2所述的制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于: 步骤(3)中无水乙醇加入量为此时反应粗品质量的2-4倍，无水乙醇浸泡2-4h后搅拌1-2h，再离心过滤。
4.根据权利要求3所述的制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于:步骤(2)中水洗涤倍量为此时反应粗品的0.5-1倍`。
5.根据权利要求4所述的制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于:步骤(4)中真空干燥的参数为温度50±2°C，真空度0.08±0.005Mpa。
6.根据权利要求1至5任一所述的制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于:所述的天然磷脂来源于大豆磷脂、葵花籽磷脂或蛋黄磷脂。
7.根据权利要求1至5任一所述的制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于:所述的磷脂酶D来源于植物和微生物，其中植物来源包括白菜、菠菜、甘蓝和胡萝卜，微生物来源包括链霉菌、大肠杆菌和沙门氏杆菌。
【文档编号】C12P13/06GK103555783SQ201310508296
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】李艳, 赵江, 张永利, 寇玉锋 申请人:陕西源邦生物技术有限公司