一种酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法
【专利摘要】一种酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法，包括7-ACCA在水相经由氨水调溶后，加入固定化酶，保持温度10～35℃，滴加入苯甘氨酸甲酯盐酸盐或苯甘氨酸甲酯甲磺酸盐，不断保持反应pH值，pH值范围在5.5～7.5，随着酶化反应的发生，生成的头孢克洛不断从体系中析出，将酶催化液不断采用过滤分离的办法，将固定化酶M-1与头孢克洛分离，母液循环回反应器，直至7-ACCA完全反应，将所得的头孢克洛湿品纯化即得头孢克洛。本发明在头孢克洛的析出过程中，即将头孢克洛从酶促反应液中分离出来，从而解决了酶催化反应的分离、反应浓度问题。
【专利说明】一种酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法，特别涉及一种由头孢克洛母核7-ACCA经生物酶法与苯甘氨酸衍生物在水相中直接生物催化合成头孢克洛的分离、纯化方法，属于生物医药化工【技术领域】。
【背景技术】
[0002]头孢克洛是美国Eli Lilly公司于20世纪80年代初研究的第二代口服头孢抗生素，其合成方法最早均是采用化学合成法。头孢克洛化学合成法的缺点是:1、化学合成过程中要使用大量有机溶剂，如二氯甲烷、DMF等。2、反应条件也较为苛刻，一般是深冷条件下进行缩合酰化。3、反应结束后经由水中结晶或形成DMF溶剂化物提纯结晶，过程中能耗大、溶剂使用量大、所得产品杂质含量多。酶催化合成头孢抗生素是21世纪逐渐发展成熟的新型生物技术，其特征是纯水中反应，污染少，副反应少，由于酶的特异性和专一性，转化率高。反应直接由母核7-ACCA和侧链完成，不再加入像化学合成法中所需的辅助物料和溶剂，所得产品质量好，有关物质少，经济、环保，是药物合成中最新技术和发展方向。由于头孢克洛在水中溶解度小，且在酶催化的PH值条件下，它不能形成氨盐溶解在反应体系中，而是逐渐析出来，随着酶催化反应的进行，反应体系会逐渐粘稠，而使控制反应变得困难。有时只能以降低投料浓度，增加水量来解决，但水量增加又不适应工业化生产，而且批量太小给后续的纯化带来不便。
【发明内容】
[0003]本发明目的是提供一种酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法。
[0004]为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:一种酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法，
[0005]包括一酶催化反应体系，该酶催化反应体系为在固定化酶存在的条件下，用7-氨基-3-氯头孢烷酸(7-ACCA)和活性形式的D-苯甘氨酸衍生物进行酶催化合成反应得到含有头孢克洛晶体的酶促反应液；所述酶催化合成反应的PH值为5.5^7.5，所述酶催化合成反应的温度为1(T35°C ;所述固定化酶的粒径为200-500微米；
[0006]在所述酶催化合成反应的过程中，间断地或者连续地将所述酶促反应液首先过125~150微米的筛网，筛上物返回至所述酶催化反应体系中，筛下物再经过滤后得到滤出物和滤液，所述滤液返回至所述酶催化反应体系中，所述滤出物即为头孢克洛湿品；
[0007]在(T25°C温度条件下，将所述头孢克洛湿品用酶促反应液母液溶解，然后用盐酸调节PH值至0.1-2使头孢克洛溶解得到质量浓度为5~20%的头孢克洛水溶液；接下来向所述头孢克洛水溶液中加入活性炭脱色，所述活性炭与所述头孢克洛水溶液两者之间的质量比例为f 10: 100;接下来进行过滤得到滤液，然后向所述滤液中加入氨水调节pH值至
2.5^5.5使头孢克洛析出，过滤后得到滤出物和滤液，该滤液即为重结晶母液，所述滤出物经洗涤和干燥步骤即得头孢克洛产品。[0008]优选的技术方案为:所述酶催化合成反应的pH值为6.5^7.5 ;所述酶催化合成反应的温度为20~28°C。
[0009]优选的技术方案为:在所述酶催化合成反应结束后，将所述固定化酶从所述酶促反应液中分离出来得到固定化酶和酶促反应液母液。
[0010]优选的技术方案为:在(Tio°C温度条件下，将所述头孢克洛湿品用酶促反应液母液溶解。
[0011]优选的技术方案为:用盐酸调节pH值至0.1~0.8使头孢克洛溶解得到质量浓度为8^15%的头孢克洛水溶液。
[0012]优选的技术方案为:所述活性炭与所述头孢克洛水溶液两者之间的质量比例为2~6: 100 。
[0013]优选的技术方案为:加入氨水调节pH值至3.5^4.5使头孢克洛析出。
[0014]优选的技术方案为:所述D-苯甘氨酸衍生物选自D-苯甘氨酸乙酯盐酸盐、D-苯甘氨酸甲酯甲磺酸盐、D-苯甘氨酸乙酯甲磺酸盐。
[0015]优选的技术方案为:所述重结晶母液中加入β -萘酚生成β -萘酚头孢克洛复合物，过滤得到的滤出物经过丙酮洗涤、干燥后回收头孢克洛。
[0016]上述技术方案中的有关内容解释如下:
[0017]1、上述方案中，所述D-苯甘氨酸衍生物可以是D-苯甘氨酸的低级烷基(Cf C4)酯，例如D-苯甘氨酸的甲、乙或异丙酯。优选的是D-苯甘氨酸甲酯和D-苯甘氨酸乙酯，最好是D-苯甘氨酸乙酯盐酸盐、D-苯甘氨酸甲酯甲磺酸盐、D-苯甘氨酸乙酯甲磺酸盐。
[0018]2、上述方案中，固定化酶中的酶可以选用适合在7-ACCA与D-苯甘氨酸衍生物的反应中作为催化剂以制备头孢克洛的任何酶。例如青霉素酰基转移酶或青霉素G酰基转移酶，其还可被称为青霉素G酰胺酶或苯甲基青霉素酰基转移酶。青霉素G酰基转移酶来自微生物的一组水解酶，其能水解青霉素的6-酰基或头孢菌素的7-酰基。固定化酶是将酶固定在载体上，ΕΡ222462和W097/04086中所公开的E.coli青霉素酰基转移酶就可以直接应用于本发明。固定化酶例如将青霉素G酰胺酶固定于吖内酯聚合物上。
[0019]3、上述方案中，酶促反应液母液是在酶催化合成反应终了时(即酶催化反应体系中7-ACCA残留低于lmg/ml)的酶促反应液分离出固定化酶后得到的。
[0020]由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果:
[0021]1、本发明在头孢克洛的析出过程中，即将头孢克洛从酶促反应液中分离出来，从而解决了酶催化反应的分离、反应浓度问题，而且更易于7-ACCA的转化，减少了侧链消耗，可以增加投料批量，投料可以达到化学法2~4倍，质量稳定，收率可以达90%以上。
[0022]1、本发明为了方便固定化酶和从酶促反应液中析出的头孢克洛的分离，因此将固定化酶的尺寸设计为200-500微米。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例对本发明作进一步描述:
[0024]实施例一:一种酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法
[0025]在1000ml酶反应器中，加入300ml水，25g7_氨基_3_氯头孢烷酸(7-ACCA)，控制温度If 20°C，滴加氨水溶液至pH值7.0±0.1，搅拌溶解，加入固定化酶25g，再通过滴液漏斗滴加24gD-苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液获得酶促反应体系，然后通过PH值自动控制装置，控制酶促反应体系的pH值恒定6.5^6.8,每间隔30min分离一次固定化酶和反应生成头孢克洛。分离方法为首先将酶促反应液过125微米的筛网，筛上物即固定化酶返回至所述酶催化反应体系中，筛下物再经过滤后得到滤出物和滤液，滤液洗涤滤出物一次然后循环回酶反应器中，收集滤出物即头孢克洛湿品。循环多次，至3小时左右，取样测7-ACCA残留低于lmg/ml，反应结束，分离、洗涤固定化酶，固定化酶5~10°C保存备用。收集头孢克洛湿品和酶促反应液母液，将所得头孢克洛转入1000ml三口瓶中，加入酶促反应液母液250ml，降温至5~10°C,加入盐酸溶液调节pH值至0.6~0.8,溶清,加入2g活性炭脱色,30min后过滤，30ml纯化水洗涤，控温5~10°C，滴加氨水，pH值1.2~1.4时，加入头孢克洛做晶种，养晶30min后，继续调节pH值至3.8~4.0，控制时间约3h，降温至O~5°C，养晶Ih,过滤，80ml冷纯化水洗涤，抽干，50°C真空干燥至水分合格，得白色头孢克洛结晶37.5g，收率91.2%。收集反应母液和重结晶母液，在母液中加入3gi3 -萘酚，控温10~15°C，搅拌反应2h，过滤，20ml丙酮洗涤，干燥得约4gi3 -萘酚头孢克洛复合物。
[0026]对白色头孢克洛结晶进行检测，结果如下表:
[0027]
【权利要求】
1.一种酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法，其特征在于: 包括一酶催化反应体系，该酶催化反应体系为在固定化酶存在的条件下，用7-氨基-3-氯头孢烷酸和活性形式的D-苯甘氨酸衍生物进行酶催化合成反应得到含有头孢克洛晶体的酶促反应液；所述酶催化合成反应的PH值为5.5^7.5，所述酶催化合成反应的温度为1(T35°C ;所述固定化酶的粒径为200-500微米； 在所述酶催化合成反应的过程中，间断地或者连续地将所述酶促反应液首先过125~150微米的筛网，筛上物返回至所述酶催化反应体系中，筛下物再经过滤后得到滤出物和滤液，所述滤液返回至所述酶催化反应体系中，所述滤出物即为头孢克洛湿品； 在(T25°C温度条件下，将所述头孢克洛湿品用酶促反应液母液溶解，然后用盐酸调节pH值至0.1~2使头孢克洛溶解得到质量浓度为5~20%的头孢克洛水溶液；接下来向所述头孢克洛水溶液中加入活性炭脱色，所述活性炭与所述头孢克洛水溶液两者之间的质量比例为广10: 100;接下来进行过滤得到滤液，然后向所述滤液中加入氨水调节pH值至2.5^5.5使头孢克洛析出，过滤后得到滤出物和滤液，该滤液即为重结晶母液，所述滤出物经洗涤和干燥步骤即得头孢克洛产品。
2.根据权利要求1所述的酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法，其特征在于:所述酶催化合成反应的PH值为6.5^7.5 ;所述酶催化合成反应的温度为2(T28°C。
3.根据权利要求1所述的酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法，其特征在于:在所述酶催化合成反应结束后，将所述固定化酶从所述酶促反应液中分离出来得到固定化酶和酶促反应液母液。
4.根据权利要求1所述的酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法，其特征在于:在(TlO°C温度条件下，将所述头孢克洛湿品用酶促反应液母液溶解。
5.根据权利要求1所述的酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法，其特征在于:用盐酸调节PH值至0.r0.8使头孢克洛溶解得到质量浓度为8~15%的头孢克洛水溶液。
6.根据权利要求1所述的酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法，其特征在于:所述活性炭与所述头孢克洛水溶液两者之间的质量比例为2飞:100。
7.根据权利要求1所述的酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法，其特征在于:加入氨水调节pH值至3.5^4.5使头孢克洛析出。
8.根据权利要求1所述的酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法，其特征在于:所述D-苯甘氨酸衍生物选自D-苯甘氨酸乙酯盐酸盐、D-苯甘氨酸甲酯甲磺酸盐、D-苯甘氨酸乙酯甲磺酸盐。
9.根据权利要求1所述的酶法合成头孢克洛的分离及纯化方法，其特征在于:所述重结晶母液中加入β-萘酚生成β-萘酚头孢克洛复合物，过滤得到的滤出物经过丙酮洗涤、干燥后回收头孢克洛。
【文档编号】C12P35/04GK103571907SQ201310525754
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】周自金, 罗新祖, 王金龙, 杨虎星, 龚仁巍 申请人:苏州中联化学制药有限公司