一种快速鉴别葎草性别的分子生物学方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速鉴别葎草性别的分子生物学方法，属于分子生物学【技术领域】。具体实施过程是，利用设计的特异引物序列，以葎草个体基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25μL，反应组成为1U的TaqDNA聚合酶，2μL的dNTP，100-200ng的基因组DNA，在PCR仪上进行PCR扩增，扩增产物以1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，DL2000marker作分子量标记，出现大小为153bp目的带的是雄性个体，没有条带的即为雌性个体。本发明中所述的SCAR引物用于预测葎草的性别，为鉴定葎草性别提供简便稳定的分子标记，在生产方面和人类健康方面具有重要应用价值。
【专利说明】一种快速鉴别蘀草性别的分子生物学方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种快速鉴别潷草性别的分子生物学方法，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]_草(Humulus scandens L)又名拉拉秧、拉拉藤,为大麻科(Cannabaceae)大麻亚科(Cannaboideae)潷草属植物，是我国广泛分布的一年生杂草。潷草花单性，雌雄异株，且性别表现稳定，花期7-8月，果期8-9月。潷草为非临床常用中草药。全草可药用，尤其是其种子中含潷草酮及蛇麻酮等，具有清热解毒、利尿、消肿、抗菌消炎、健胃抑菌、抑制病毒等功能，起到提高动物免疫力、防治疾病、促进生长的作用。另外，潷草种子对结核杆菌有显著抑制作用，对金黄色葡萄球菌也有抑制作用。所以，潷草雌株相对于雄株来讲，具有更大的药用价值。另一方面，潷草在我国分布广泛，其雄株所产生的花粉是我国夏秋季引起花粉过敏症的主要致敏原之一。因此，对其性别进行控制，培育单性群体，可以有效提高单位面积潷草的药用价值，并可避免引起花粉过敏症，有益人类的健康。然而，在发育早期，根本无法通过外观形态来鉴定潷草的性别，因此从分子水平找到一种DNA标记来鉴别发育早期的潷草植株成为潷草成功选育的先决条件，具有重要的应用价值。
[0003]AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)技术是可以快速有效的寻找分子标记的一种重要的方法。但考虑到应用其鉴别性别费时费力，常常将其转化为更为简便和实用的序列特异扩增区域(Sequence Characterized Amplified Regions, SCAR)标记。AFLP-SCAR标记技术用于某些植物的基因组中寻找性别标记已有成功报道。如在雌雄异株植物构树基因组中找到了一个雄性特异的分子标记，可以作为识别雌雄的探针。Stehlik等在叶寥(Rume xnivalis L.)中获得一个长度为164bp的雄性特异性AFLP片段,并将其成功转化为SCAR标记，此标记是位于Y染色体上的串联重复的非编码DNA序列，可以鉴别叶寥的性别。但目前国内外尚`无有关AFLP-SCAR分子标记鉴别潷草性别方法的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种快速鉴别潷草性别的分子生物学方法，以便利用AFLP技术对具有重要药用价值的潷草进行雌雄性别间分子差异分析，并将获得的AFLP标记转化为操作更为简便的SCAR标记。
[0005]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
[0006]一种快速鉴别潷草性别的分子生物学方法，包括潷草雄性特异性引物序列，其特异性引物序列为上游(SCARF):5’ -TTGAAGAAATCTCATCCTCAAAGA-3’ ；下游(SCARR):5’-GACCTTGGCCACAGGAATAG-3’。该方法的具体实施过程是，利用设计的特异引物序列，以潷草个体基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25 μ L，反应组成为IU的Taq DNA聚合酶，2 μ L的dNTP，100-200ng的基因组DNA，其中含雄性特异上下游引物各0.1 μ mol/L,在PCR仪上按下面的循环参数进行PCR扩增:95°C预变性5min后，95°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec，共30个循环，最后72°C延伸7min，扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，DL2000marker作分子量标记，出现大小为153bp目的带的是雄性个体，没有条带的即为雌性个体。
[0007]本发明中，利用AFLP技术对具有重要药用价值的潷草进行雌雄性别间分子差异分析，并将获得的AFLP标记转化为操作更为简便的SCAR标记。
[0008]本发明的有益效果在于:本发明中所述的SCAR引物用于预测潷草的性别，为鉴定潷草性别提供简便稳定的分子标记，在生产方面和人类健康方面具有重要应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1是本发明中引物组合E-CTT/M-GAC产生的潷草雄性特异AFLP条带(箭头所示)O
[0010]图2是本发明中SCAR引物SCARF和SCARR在雌性全体和雄性个体基因组中的PCR
扩增结果。
[0011]图中标记说明:在图1中，1-4为雌性个体，5-8为雄性个体；在图2中，箭头所示为雄性特异的153bp条带，其中1-8为雌性个体，9-16为雄性个体，M为DL2000marker。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例及附图对本发明的【具体实施方式】进行描述，以便更好的理解本发明。
[0013]实施例1:潷草性别特异AFLP分子标记的筛选
[0014]具体包括以下几个步骤:
[0015](1)提取潷草的基因组DNA:选择已开花可以通过花的结构鉴别雌雄的潷草。取适量叶片放入研钵中，加液氮迅速磨成粉末，转入离心管中；加入预热至65°C的CTAB抽提缓冲液，65°C温浴60min ;加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25: 24: I, V/V/V), 1000OXg,室温下离心IOmin ;取上清液,加入等体积的氯仿:异戍醇(24: I, V/V),混匀，10000X g,室温下离心IOmin ;取上清液，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，_20°C静置Ih ;用细玻璃棒挑出絮状DNA沉淀，放入1.5mL离心管中，用70%的酒精漂洗两次，室温干燥。加入500 μ LI XTE缓冲液，1000OXg离心IOmin,将上清液转入新离心管中，加入RNase (IOmg/mL)，37°C保温lh，用等体积的氯仿:异戊醇抽提；取上清液，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，-20°C静置lh。7000 Xg离心lOmin，弃去上清液，沉淀用70%的乙醇漂洗2次，室温干燥。I X TE溶解，-20°C下储存备用。将提取的DNA在紫外分光光度计下测定OD26tl和OD28tl进行质量检测，每一方法重复3次。将DNA原液稀释后，用1XTAE，0.8(%琼脂糖凝胶，5V/Cm电泳0.5h进行电泳检测。
[0016](2)基因组DNA的AFLP分析:基因组DNA的AFLP分析主要有如下步骤:
[0017](2a)对基因组DNA模板进行酶切:用1.25U/ μ L EcoR I/Mse I酶混合物37°C消化IOOng模板DNA7h，再用I %琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，然后将充分酶切的DNA溶液于70°C孵育15min灭活限制性内切酶。
[0018](2b)将特异接头连接到酶切片段上:向上面的酶切反应混合液中加入12 μ L接头混合物和1.5U T4DNA连接酶，20°C孵育12h保证接头充分连接，然后置于_20°C下保存。接头混合物的序列如下:
[0019]Eadaptorl:CTC GTA GAC TGC GTA CC ；
[0020]Eadaptor2:AAT TGG TAC GCA GTC TAC ；
[0021]Madaptorl:GAC GAT GAG TCC TGA G ；
[0022]Madaptor2:TAC TCA GGA CTC AT。
[0023](2c)进行PCR预扩增:将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板。预扩增PCR的反应条件为:94°C变性40s，56°C退火40s，72°C延伸lmin，30个循环后，72°C延伸10min，4°C保存备用。预扩增引物的序列如下:
[0024]EcoR1-pre:GACTGCGTACCAATTCC ；
[0025]Msel-pre:GATGAGTCCTGAGTAAG ；
[0026](2d)进行PCR选择性扩增:将预扩增产物稀释30倍，作为选择性扩增的模板。用含酶切位点MseI的引物和含酶切位点EcoRI的引物进行扩增，这两种引物3 ’末端带有三个选择性碱基。PCR反应分为三步:第一步进行I个循环:94°C变性40s，65°C退火40s，72°C延伸Imin ;第二步进行12个循环:94°C变性40s，65_56°C退火40s，72°C延伸Imin ;第三步进行25个循环:94°C变性40s，56°C退火40s，72°C延伸lmin。扩增产物加入适量的上样液，94°C变性5min，立即置于冰上。
[0027]总共用了 9对引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94°C变性后用6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。
[0028](2e)电泳分析:将变性好的扩增产物用6%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；电泳条件:电压1200V，功率50W，电流50mA，时间1.5h。总共用了 9个引物组合对4个潷草雌性个体和4个潷草雄性个体的基因组DNA进行了 AFLP分析，然后对电泳后产物的DNA条带图谱进行观察、照相和分析，筛选出特异片段的引物组合I个，这个引物组合产生I条雄性特异的AFLP标记。
[0029](3)雄性特异AFLP分子标记的筛选:总共用64对引物组合对4个潷草雌性个体和4个潷草雄性个体的基因组DNA进行了 AFLP分析。其中引物组合(E-CTT/M-GAC)扩增出I条雄性特异的AFLP标记。这个扩增条带只在雄性个体中出现，而在雌性个体中不出现，如图1所示。引物组合(E-CTT/M-GAC)的序列如下:
[0030]E-CTT: GACTGCGTACCAATTCCTT ；
[0031]M-GAC:GATGAGTCCTGAGTAAGAC。
[0032]实施例2:潷草雄性特异AFLP分子标记的克隆与序列分析
[0033]将采用引物组合(E-CTT/M-GAC)扩增出的雄性特异条带进行回收，克隆到PMD-18T (大连宝生物)载体中，采用标准方法进行连接和转化，采用常规PCR方法筛选出含有目的片段的克隆，并通过测序获得了一段194bp的雄性特异片段，其序列为SEQ IDNO: I所示。将该序列在Genebank上进行序列比对，未发现与之同源的序列。
[0034]实施例3 =SCAR标记的转化及潷草性别的鉴定
[0035]根据潷草雄性特异的AFLP 分子标记的序列，设计特异性引物，可将性别特异的AFLP标记转化为SCAR标记，引物的序列如下:
[0036]SCARF:5，-TTGAAGAAATCTCATCCTCAAAGA-3，:
[0037]SCARR: 5，-GACCTTGGCCACAGGAATAG-3，。[0038]即以雌性潷草和雄性潷草的基因组DNA为模板，以此引物进行PCR扩增，该引物只在雄性潷草基因组中扩增得到一条153bp的片段，而在雌性潷草中不会出现扩增片段，如图2所示。
[0039]其中，所用PCR反应的体系为:IU的Taq DNA聚合酶，2 μ L的dNTP，100_200ng的基因组DNA，其中含雄性特异上下游引物各0.14 11101/1，补充双蒸水至终体积25111^。在PCR仪上按下面的循环参数进行PCR扩增:95°C预变性5min后，95°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec，共30个循环，最后72°C延伸7min，扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，DL2000marker作分子量标记，出现大小为153bp目的带的是雄性个体，没有条带的即为雌性个体。
[0040]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。`
【权利要求】
1.一种快速鉴别潷草性别的分子生物学方法，其特征在于:包括潷草雄性特异性引物序列，其特异性引物序列为:
上游(SCARF):5’ -TTGAAGAAATCTCATCCTCAAAGA-3’ ；
下游(SCAP R):5’ -GACCTTGGCCACAGGAATAG-3’ ； 该方法的具体实施过程为:利用上述设计的特异引物序列，以潷草个体基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25 μ L，反应组成为IU的Taq DNA聚合酶，2 μ L的dNTP，100-200ng的基因组DNA，其中含雄性特异上下游引物各0.1 μ mol/L，在PCR仪上按下面的循环参数进行PCR扩增:95 V预变性5min后，95 °C变性30sec，60 V退火30sec，72 V延伸60seC，共30个循环，最后72°C延伸7min，扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，DL2000marker作分子量标记，出现大小为153bp目的带的是雄性个体，没有条带的即为雌性个体。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴别潷草性别的分子生物学方法，其特征在于:针对潷草性别特异AFLP分子标记的筛选的具体包括以下几个步骤: (1)提取潷草的基因组DNA:选择已开花可以通过花的结构鉴别雌雄的潷草，取适量叶片放入研钵中，加液氮迅速磨成粉末，转入离心管中；加入预热至65°C的CTAB抽提缓冲液，65°C温浴60min ;加入 等体积的酚:氯仿:异戊醇(25: 24: 1，V/V/V)，10000 X g，室温下离心IOmin ;取上清液,加入等体积的氯仿:异戍醇(24: I, V/V),混匀，10000X g,室温下离心IOmin ;取上清液，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，_20°C静置Ih ;用细玻璃棒挑出絮状DNA沉淀，放入1.5mL离心管中，用70%的酒精漂洗两次，室温干燥；加入500 μ LI X TE缓冲液，1000OXg离心IOmin,将上清液转入新离心管中，加入RNase (10mg/mL)，37°C保温lh，用等体积的氯仿:异戊醇抽提；取上清液，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，-20°C静置Ih ；7000 X g离心lOmin，弃去上清液，沉淀用70 %的乙醇漂洗2次，室温干燥；I X TE溶解，_20°C下储存备用；将提取的DNA在紫外分光光度计下测定OD26tl和OD28tl进行质量检测，每一方法重复3次；将DNA原液稀释后，用I X TAE，0.8 %琼脂糖凝胶，5V/cm电泳0.5h进行电泳检测； (2)基因组DNA的AFLP分析:基因组DNA的AFLP分析主要有如下步骤: (2a)对基因组DNA模板进行酶切:用1.25U/μ L EcoR I/Mse I酶混合物37°C消化IOOng模板DNA7h，再用I %琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，然后将充分酶切的DNA溶液于70°C孵育15min灭活限制性内切酶； (2b)将特异接头连接到酶切片段上:向上面的酶切反应混合液中加入12 μ L接头混合物和1.5U T4DNA连接酶，20°C孵育12h保证接头充分连接，然后置于_20°C下保存；接头混合物的序列如下:
【文档编号】C12Q1/68GK103555845SQ201310548829
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月1日 优先权日:2013年11月1日
【发明者】高武军, 李书粉, 王连军, 张国俊, 邓传良, 卢龙斗 申请人:河南师范大学