一种小麦离体花粉萌发方法
【专利摘要】本发明公开了一种小麦离体花粉萌发方法，包括下述步骤：1)花粉的选择：选择当年种植的即将扬花的小麦植株收集花粉；2)花粉的离体培养：将花粉抖落到离体花粉萌发培养基中，所述培养基以蔗糖为基础，添加PEG4000、H3BO3、Ca(NO3)2、VB1、硝酸钾和硫酸镁制成。本发明公开的小麦离体花粉萌发方法具有良好的萌发率，能够有效促进小麦远缘杂交育种和杂交小麦研究。
【专利说明】一种小麦罔体花粉萌发方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物【技术领域】，特别涉及一种小麦离体花粉萌发的方法。
【背景技术】
[0002]花粉是高等植物的雄配子体，它在有性繁殖中起着传递雄性亲本遗传信息的作用，既是植物遗传育种、进化生殖等研究的重要对象内容，又是孢粉分析、药物制造、蜂群培育、生理及医疗试验的重要材料。在农林业的常规育种工作中，为进行人工辅助授粉和杂交授粉，需要进行早期采集和贮存花粉，尤其在杂交育种工作中，研究花粉的生活力和育性是一项必不可少的基础性工作。花粉的萌发质量能直接影响植物的结实率，尤其在一些稀有植物中显得尤其重要。花粉离体萌发作为一项体外萌发的研究技术，在许多植物的花粉研究中已取得了显著的成就。在小麦杂交育种研究中，无论是采用生理型雄性不育还是遗传型雄性不育途径来配制强优势的杂交组合，花粉生活力与育性鉴定都至关重要，它关系到杂交品种的质量和纯度等重要指标。小麦花粉的离体萌发研究对于测定花粉生活力、衡量各种遗传型雄性不育系的不育程度、检验各种化学杀雄剂、不同杀雄剂量杀雄的效果、揭示小麦雄性不育的内在机理以及研究和利用小麦杂种优势各途径的特异性都具有极其重要的意义。
[0003]已有研究表明小麦花粉粒的生活力很弱，离体后会很快失去活力，通常很难在离体条件下萌发，已有的用于其它植物的离体培养方法在小麦花粉上适用性不佳， 申请人:曾尝试将200910219354.4的黄岑花粉离体萌发方法、201210352311.5的石蒜萌发方法、200910023683.1的桔梗花粉离体萌发方法用于小麦花粉的离体萌发，实验结果发现由于植物种属的巨大区别，这些已有植物的植株筛选方法、离体萌发培养基、培养条件等并不适于小麦花粉的离体萌发，直接套用的话仅有40%左右的萌发率，无法满足育种和杂交研究的实际应用。
[0004]早期的科研研究也显示在离体条件下由于花粉原来的生活环境发生了改变，花粉的正常发育会受到抑制。Fritz和Lukaszewski等(Plant Breeding, 1989)报道，用放置45分钟的花粉授粉，小麦“中国春”的结实率会由原先的100%下降到不足10%。研究表明离体花粉萌发的基本条件是要有碳源、硼酸、矿质元素的参与。适宜于花粉萌发及花粉管生长的培养基组分因植物种类的不同而异。培养基组分及其物质浓度对花粉萌发率和花粉管生长都具有很大的影响。只有在培养基中含有足够量的矿质、糖类、维生素类等组分，花粉才能正常的萌发、生长，但培养基内的一些组分浓度过高时，会对花粉萌发和花粉管生长起到抑制作用，也就是说，花粉萌发及花粉管的生长需要一个比较适宜的组分浓度，组分浓度过高或过低均不利于花粉的萌发和花粉管的生长。影响花粉离体萌发的因素除了培养基组分和浓度外，培养基的PH值，培养条件(如培养时间、温度等)也是影响其萌发效果的主要因素。
[0005]小麦离体花粉萌发率的高低，不仅与小麦基因型、培养基关系密切，还与培养时间、培养温度有关。因此寻找最佳的普通小麦离体花粉萌发的培养基和方法，建立起完善的小麦花粉活力检测体系，是小麦研究工作者的一个重要课题，能够极大地促进小麦远缘杂交育种和杂交小麦研究。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的不足，本发明公开了一种小麦离体花粉萌发的方法，该方法可以适用于普通的小麦和杂交品种的小麦，利用该方法可进行小麦花粉活力的测定。
[0007]为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的: [0008]一种小麦离体花粉萌发方法，包括下述步骤:1)花粉的选择:选择当年种植的即将扬花的小麦植株收集花粉；2)花粉的离体培养:将花粉抖落到离体花粉萌发培养基中，所述培养基以蔗糖为基础，添加PEG4000、H3BO3、Ca (NO3) 2、VB1、硝酸钾和硫酸镁制成。
[0009]通过上述方法可以有效保持小麦离体花粉的萌发率。
[0010] 申请人:对上述过程的条件进行了深入研究，尤其是对离体花粉萌发培养基的组成进行了研究，发现在下述组成下小麦离体花粉的萌发率不低于80%:蔗糖浓度为15-30%，PEG4000 浓度为 5-20% ,H3BO3 浓度为 20-50mg / L，Ca (NO3) 2 浓度为 l_5mmol / UVB1 浓度为5-20mg / L，硝酸钾浓度为0.5-2mmol / L，硫酸镁浓度为0.5-1.5mmol / L。
[0011]在进一步的研究中， 申请人:对小麦花粉的收集和离体培养进行了最优化，发现在下述条件下具有最优的萌发率:
[0012]所述步骤I)的收集方法为所用小麦植株的柱头呈羽毛状分叉、有光泽，并有1-3个小穗的花粉散出，用剪刀剪去小穗的I / 3，花粉散出时将花粉抖落到已备好的装有液体
培养基的离心管。
[0013]所述步骤2)离体花粉萌发培养基的组成为蔗糖浓度为20%，PEG4000浓度为10%, H3BO3 浓度为 40mg / L，Ca(NO3)2 浓度为 3mmol / L，VB1 浓度为 IOmg / L，硝酸钾浓度为l.0mmol / L,硫酸镁浓度为0.8mmol / L。
[0014]在本发明的方法中，离体培养的条件可以根据培养的实际环境进行合理调整，优选的，步骤2)小麦花粉培养利用培养箱进行，温度设置为28°C ;时间设为30分钟。
[0015]进一步的，本发明的方法还包括了对离体萌发的小麦花粉进行镜检的步骤，通过进行镜检能够有效的判断小麦花粉的离体萌发率。
[0016]镜检的方法可以采用本领域任意可行的离体花粉萌发率统计方法，优选的，采用下述方法成本低、快捷有效:
[0017]取出离体培养的材料，使其中的花粉悬浮液充分混匀，用移液器吸取花粉悬浮液加于凹形载玻片上，在显微镜下观察花粉萌发情况，并作统计。
[0018]在上述方法中，萌发率的统计方法为以花粉管长度大于或等于I / 2花粉粒直径作为萌发花粉。
[0019]通过上述综合改进，本发明公开的小麦离体花粉萌发方法具有良好的萌发率，能够有效促进小麦远缘杂交育种和杂交小麦研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是K型三系小麦的实施部分图片，其中图1-A表示保持系离体花粉萌发情况；图1-B表示不育系和恢复系杂交F1离体花粉萌发情况；图1-C表示K型不育系离体花粉萌发情况；
【具体实施方式】
[0021]以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明，需要说明的是，本发明不限于这些实施例的小麦品种，任意小麦品种均可采用本发明的方法进行离体花粉萌发。
[0022]实施例1:
[0023]将本发明的方法用于下述5个小麦品种:小麦品种T63、辉县红、9517、西农822、ZHM-3，种植于西北农林科技大学北校西区实验田，在自然条件下用常规方法栽培管理。次年春季选择即将扬花的5个小麦品种植株，柱头呈羽毛状分叉、有光泽，并有1-3个小穗的花粉散出，用剪刀剪去小穗的I / 3，待大多数花粉散出时，轻轻将花粉抖落到已备好的装有液体培养基(组成为蔗糖浓度为20%，PEG4000浓度为10%，H3BO3浓度为40mg / L，Ca(NO3)2浓度为3mmo I / L，VB1浓度为IOmg / L，硝酸钾浓度为l.0mmol / L，硫酸镁浓度为0.8mmol / L。)的离心管中。从田间带回，利用培养箱进行，温度设置为28°C，暗培养30min，取出经培养的材料，轻摇离心管使其中的花粉悬浮液充分混匀，用Iml移液器吸取I滴加于凹形载玻片上(枪头剪去枪尖)，在显微镜(10X10)下观察花粉萌发情况，并作统计。以花粉管长度大于或等于I / 2花粉粒直径作为萌发花粉。每个玻片观察3~5个视野，统计萌发率。
[0024]实验重复3次，每次各处理统计300粒花粉粒以上。花粉萌发率=萌发花粉粒数目/观察花粉粒总数X 100%。小麦品种T63、辉县红、9517、西农822、ZHM-3离体花粉萌发率分别为 90.8%,90.3%,91.2%,92.9%,92.1%。
[0025]实施例2:
[0026]选用K型小麦三系普通小麦材料，选择即将扬花的小麦植株，并有1-3个小穗的花粉散出，用剪刀剪去小穗的I / 3，待大多数花粉散出时，轻轻将花粉抖落到已备好的装有液体培养基(同上)的离心管中。从田间带回，利用培养箱进行，温度设置为28°C，暗培养30min。通过镜检测定，保持系离体花粉的萌发率为81.60% ;不育系和恢复系杂交F1离体花粉萌发率为47.79% ;不育系离体花粉的萌发率为O %。
[0027](注:由于K型不育系为配子体不育，因而在不育系和恢复系杂交匕的花粉中总有50 %的花粉粒可育，50 %的花粉粒不育)。
【权利要求】
1.一种小麦离体花粉萌发方法，其特征在于包括下述步骤:1)花粉的选择:选择当年种植的即将扬花的小麦植株收集花粉；2)花粉的离体培养:将花粉抖落到离体花粉萌发培养基中，所述培养基以蔗糖为基础，添加PEG4000、H3B03、Ca(NO3)2^ VB1'硝酸钾和硫酸镁制成。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述步骤I)的收集方法为所用小麦植株的柱头呈羽毛状分叉、有光泽，并有1-3个小穗的花粉散出，用剪刀剪去小穗的I / 3，花粉散出时将花粉抖落到已备好的装有液体培养基的离心管。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述步骤2)离体花粉萌发培养基的组成为蔗糖浓度为 20%，PEG4000 浓度为 10% ,H3BO3 浓度为 40mg / L，Ca (NO3) 2 浓度为 3mmol / L,VB1浓度为IOmg / L，硝酸钾浓度为l.0mmol / L，硫酸镁浓度为0.8mmol / L。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述步骤2)小麦花粉培养利用培养箱进行，温度设置为28°C ;时间设为30分钟。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于还包括对离体萌发的小麦花粉进行镜检的步骤。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于采用如下镜检方法:取出离体培养的材料，使其中的花粉悬浮液充分混匀，用移液器吸取花粉悬浮液加于凹形载玻片上，在显微镜下观察花粉萌发情况，并作统计。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于萌发率的统计方法为以花粉管长度大于或等于I/2花粉粒直径作为萌 发花粉。
【文档编号】C12N5/04GK103627668SQ201310591739
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】董剑, 王军卫, 侯立江, 宋瑜龙, 徐虹, 牛娜, 马守才, 张改生, 高翔 申请人:西北农林科技大学