一种利用浮萍原料制备l-乳酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用浮萍原料制备L-乳酸的方法，属于环境生物技术和生物质能源领域。本发明通过加入中温α-淀粉酶和糖化酶使浮萍糖化，获得发酵菌种所需的碳源，浮萍自身含有的蛋白质则可作为氮源，灭菌后即可作为发酵培养基；利用MRS培养基制备液体种子培养基，然后接种斜面保藏的产乳酸细菌，通过二级扩繁得到液体种子；向装有预处理好的浮萍细胞液发酵罐中接种体积比为6%的液体种子，通过静态发酵得到液态发酵产物。本发明生产的L-乳酸具有环境友好的特点，不仅不会导致大气中CO2的净增加，也就不会引起温室效应。而且还可以和污水治理协同进行。作为非粮作物的L-乳酸发酵的替代法又可以缓解世界范围内又面临着粮食短缺的紧张局面。
【专利说明】一种利用浮萍原料制备L-乳酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用浮萍原料制备L-乳酸的方法，属于环境生物技术和生物质能源领域。
【背景技术】 [0002]乳酸(LacticAcid)是三大有机酸之一，又名为α -羟基丙酸(a -hydroxypropanoic acid),根据旋光性的不同,可分为D-型和L-型两种旋光异构体，目前已经被广泛应用于化工、医药、食品和环保等领域。而由于人体中仅存在代谢L-型乳酸的酶类，故体内的D-乳酸或DL-乳酸超过一定量的话，将会导致二者因无法代谢掉而引起人体代谢功能紊乱甚至中毒。基于此，L-乳酸在实际应用中拥有广阔的前景(周爱军，李长存，黎树根，舒迪，杨丽欣.聚乳酸产业现状与合成技术研究进展.化学与生物工程，2013，30(4):18-21.)0近年来，随着环境污染的日益加重，开发可降解新型材料已经是大势所趋，而L-乳酸因具有很好的生物相容性和可生物降解，利用它来生产可降解生物塑料-聚乳酸(PLA)已经得到全世界的广泛亲睐，据统计，目前全世界塑料产品的年总消费量已超过3亿t，我国为3500万t以上，而如果10年~20年后替代石油基聚合物的消费量按10%计，世界聚乳酸需求量每年将达3000万t以上，具有广阔的发展前景。而目前L-乳酸的生产主要依靠淀粉类发酵来实现，其原料又主要集中在玉米、马铃薯等粮食作物上，而目前世界范围内又面临着粮食短缺的紧张局面，因此寻求非粮作物的L-乳酸发酵已经迫在眉急。而目前关于利用浮萍为原料发酵生产L-型乳酸的研究还没有报道。
[0003]浮萍(duckweed)为单子叶水生植物，共有4属(Lemna、Spirodela、Wolffia和ffolffiella)40个种，常用于污染水体的净化，这主要是源于它可以通过根或叶状体从水中吸收所需的氮磷等营养物质供自身生长，同时达到净化水体的目的。浮萍的营养成分也非常丰富，富含蛋白质，纤维含量低，淀粉含量在25%左右，个别浮萍种的蛋白含量高达75%(Klass D L.Duckweed Plants for ffaste-water Reuse and Biomass Production [M].Chicago:1nstitute of Gas Technology, 1993:423-432.)。特别是用于L_型乳酸发酵的乳酸菌自身合成B族维生素和氨基酸的能力有限，因此它们对营养要求也很高(葛向阳.菊芋发酵生产L-乳酸的研究.江南大学2009届博士学位论文，6-8.)，而浮萍富含蛋白，可以极大地满足它对氨基酸的需求。有研究表明，在四川地区，利用浮萍净化猪粪废水，若接种量适宜，其淀粉含量可高达40%左右，以少根紫萍为例，每公顷每年大约能生产淀粉11.4t (赵昭，姚广保，张艺琼，赵玄.猪场污水中浮萍生物量和淀粉含量变化研究.四川大学学报(自然科学版)，2012，49 (3):693-698)。可见，将它作为生物能源的原料会有着很大的潜力。目前关于利用浮萍制备燃料乙醇、丁醇和生物柴油的报道已经有较多报道，但是利用它为原料发酵产L-型乳酸的研究并未出现。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种利用浮萍原料制备L-乳酸的方法，该方法采用非粮食物质发酵、废水资源化、环保。
[0005]技术解决方案
[0006]方法步骤如下:
[0007]I)发酵培养基的制备:浮萍淀粉浓度保持在24_30g/L，酵母粉20_25g/L，CaCO3浓度保持在5-8% ；
[0008]2)发酵培养基的糖化:在溶液PH值为6.5时，先用中温α -淀粉酶降解淀粉粒，灭活多余的酶活性后，再调节溶液PH值至4.5，再通糖化酶使其充分降解，糖化完成后以100°C灭活酶活性；
[0009]3)种子发酵液的制备:先用接种环将干酪乳杆菌株Lactobacillus casei目的菌种接种到100ml MRS液体培养基中，于30°C、150r/min —级摇瓶培养12h后，再进行二级扩繁培养，培养24h后即得到液态种子；
[0010]4)按5 — 10%(V:V)的接种量将液态种子接种到发酵培养基中，在37°C、150r/min条件下于发酵36h-72h后，制备出L-乳酸。
[0011]本发明主要是针对氮、磷污水净化过程中产生的大量浮萍资源进行可再生能源的利用，利用浮萍这类可再生 资源为原料发酵生产乳酸，不仅不会导致大气中CO2的净增加，也就不会引起温室效应，而且还可以和污水治理协同进行，因此，利用该技术具有广阔的前
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【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为本发明流程图。
【具体实施方式】
[0013]以下将结合具体实施实例对本发明作进一步的说明，目的在于帮助读者更好地理解本发明，但不作为对本发明实施范围的限定。
[0014]这里DNS法的原理在于:淀粉是多糖的一种，它水解后可产生多种还原糖，在碱性条件下它们能与二硝基水杨酸发生氧化还原反应，生成的产物3-氨基-5-硝基水杨酸在沸水浴条件下呈现出棕红色，且在特定的范围内，该产物的颜色深浅与还原糖的量成正比。
[0015]乳酸含量的测定采用间接法来完成。其原理是基于络合反应，用过量CaCO3和发酵液中的乳酸发生反应形成乳酸钙〔(CH3CHOHCOO)2Ca.5H20)后，之后用EDTA标准溶液滴定乳酸钙中所含有的钙，然后依据乳酸与钙定量反应的关系，来间接计算出乳酸含量。
[0016]离子交换法中所用的交换柱是732和711，这两类树脂经过浸泡和酸碱处理后分别转换成H型(阳离子交换柱)和OH型(阴离子交换柱)。离子交换法转酸及除阴离子的原理如下:(1)732阳离子交换树脂具有解盐的能力，可与乳酸?丐进 fi"反应，BP 2R-SO；,H + Cii (CHsCHOHCOOh^ (R-SOi)2Ca +2CH:;CHOHCOOH:
(2)711阴离子交换树脂除S042_等阴离子的反应为:2RN (C1-K)iOH + SO42^: RN
(CH.； )3) 2 SO42'+ 20H': RN (CH:;),OH + Cl"-RN (CH；,):; Cl"十OIT
[0017]种子制备:乳酸菌菌种选取干酪乳杆菌株Lactobacillus casei,利用MRS培养基接种干酪乳杆菌后制备液体种子；[0018]MRS培养基包括下列原料，按质量比:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵 2.0g，葡萄糖 20.0g,乙酸钠(CH3COONa.3H20) 5.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4.3H20)2.0g，硫酸镁(MgSO4.7Η20) 0.58g，硫酸锰(MnSO4.Η20) 0.25g ;将上述原料与吐温 80 1.0mL混合，将混合后的物料用蒸馏水定容至lOOOmL，pH6.2~6.6，最后用高压锅在115°C灭菌30min备用；
[0019]采用二级培养:先用接种环将目的菌种干酪乳杆菌株接种到100ml MRS液体培养基中，于30°C、150r/min 一级摇瓶培养12h后，再进行二级扩繁培养，培养24h后即得到液态种子。
[0020]浮萍淀粉糖化液的制备:将浮萍干燥粉碎后过60目筛，利用pH值为6.5的磷酸缓冲液将其调制成质量体积比浓度为1:9的悬浊液，先用中温α -淀粉酶降解淀粉粒，制备成淀粉酶解液，为了保证酶解效果，向制备成的物料中加入质量体积浓度为0.2%的CaCl2，将温度升至60°C液化，直至碘液测试结果呈棕橙色，然后再加热煮沸10分钟，灭活酶活性；待液化液冷却后，用稀盐酸调节PH值至4.5，接着继续加入糖化酶使其充分降解，糖化完成后以100°C灭活酶活性，从而制备出发酵所需的糖化液，最后利用DNS法(参照陈毓荃主编.生物化学实验方法和技术，北京:科学出版社，2002))测定其糖的含量。
[0021]具体方法如下:样品液适当稀释，使糖浓度为0.l-1.0mg/ml，取稀释后的糖液
1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数。求出样品中糖含量。
[0022]发酵培养基的制备:根据上一步测得的糖质量体积浓度，使浮萍淀粉质量体积比浓度保持在24g/L，酵母粉20g/L，CaC038%，然后按5_10%(V:V)的接种量将液态种子接种到发酵培养基中，在37°C、150r/min条件下于发酵36h_72h后，利用EDTA滴定法测定乳酸钙含量(参照孙靓，孙菲菲，黄艳燕，卢福芝，黄日波.木薯淀粉发酵生产L-乳酸的培养条件优化.中国酿造，2009，7:33-37)，进而计算出乳酸的发酵产量。
`[0023]具体方法如下:取发酵液2mL,8000r/min离心5min,取上清液ImL于IOOmL蒸懼水中，加入1.0moI/L的NaOHlOmL,加钙指示剂2滴，用0.05mol/LNa2EDTA试剂滴定，终点为溶液颜色变为纯蓝色。由Na2EDTA体积计算乳酸钙和乳酸的含量。
[0024]乳酸钙含量:WCaL2=218.2c X V (mg)
[0025]L-乳酸含量:WLa=180c X V (g/L)
[0026]式中:V表示滴定消耗Na2EDTA的量，mL ；c表示Na2EDTA的浓度，mol/L。
[0027]L-乳酸提取:采用离子交换法从发酵液中分离纯化L-乳酸。
[0028]实施例1
[0029]取8g浮萍粉(淀粉含量30%，蛋白质含量15%)、4.8g CaCO3置于250ml的三角瓶中加入47.2ml的蒸馏水，分别用中温α -淀粉酶和糖化酶使其糖化后，115°C灭菌20分钟，然后按6%(V:V)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在37°C、150r/min条件下于静态发酵48h后，利用EDTA滴定法测定乳酸钙含量，最后通过离子交换法分离纯化出乳酸，并对其进行定量。
[0030]实施例2
[0031]取8g浮萍粉(淀粉含量30%，蛋白质含量15%)、酵母粉1.2g置于250ml的三角瓶中，用盐酸和氢氧化钠调节PH值至6.3，加入46ml的蒸馏水，并向制备成的物料中加入质量体积浓度为0.2%的CaCl2以保证酶解效果，接着分别用中温α -淀粉酶和糖化酶使其糖化后，115° C灭菌30分钟，最后向其中加入经过干热灭菌的CaC034.8g，然后按8%(V: V)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在37°C、150r/min条件下于静态发酵72h后，利用EDTA滴定法测定乳酸钙含量，最后通过离子交换法分离纯化出乳酸，并对其进行定量。
【权利要求】
1.一种利用浮萍原料制备L-乳酸的方法，其特征在于，方法步骤如下: O发酵培养基的制备:浮萍淀粉浓度保持在24-30g/L，酵母粉20-25g/L ； 2)发酵培养基的糖化:在溶液PH值为6.5时，先用中温α -淀粉酶降解淀粉粒，灭活多余的酶活性后，再调节溶液PH值至4.5，再通糖化酶使其充分降解，糖化完成后以100°C灭活酶活性； 3)种子发酵液的制备:先用接种环将干酪乳杆菌株Lactobacilluscasei目的菌种接种到100ml MRS液体培养基中，于30°C、150r/min —级摇瓶培养12h后，再进行二级扩繁培养，培养24h后即得到液态种子； 4)按5-10%(V:V)的接种量将液态种子接种到发酵培养基中，在37°C、150r/min条件下于发酵36h-72h后，制备出L-乳酸。
2.根据权利要求1所述的一种利用浮萍原料制备L-乳酸的方法，其特征在于，发酵培养基还包括质量浓度为5-8%的CaCO3。
【文档编号】C12P7/56GK103614423SQ201310626363
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】潘建刚, 蔡禄, 张艾艾, 常亚, 时陪福 申请人:内蒙古科技大学