一种脂肪酶的发酵生产方法
【专利摘要】本发明涉及一种脂肪酶的发酵生产方法。该方法将产脂肪酶的假丝酵母和/或装载了含有LIP2基因的质粒的耶氏酵母作为发酵菌种加入发酵培养基进行发酵生产脂肪酶，并以发酵液中的丙酮酸为代谢标志物来控制发酵过程。该方法通过向发酵培养基或发酵液中加入维生素B6来控制发酵液中的丙酮酸含量，并通过在发酵过程中控制发酵液pH、发酵液温度和通气量来控制碳源和氮源代谢。该发酵工艺通过控制发酵液中作为代谢标志物的丙酮酸解除了脂肪酶合成过程中的抑制作用，从而提高了发酵菌种产生脂肪酶的能力。脂肪酶活力相比于原始发酵工艺（未添加维生素B68000IU/ml）提高了2000-4000IU/ml发酵液以上。
【专利说明】一种脂肪酶的发酵生产方法
【技术领域】
[0001]本发明属于脂肪酶发酵法生产【技术领域】，涉及一种生产脂肪酶的发酵过程的控制方法。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(Lipase.E.C3.1.1.3)又称三酰基甘油酰基水解酶，是分解脂肪的酶。月旨肪酶(Lipase.E.e.3.1.1.3)是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，将甘油三酯降解为甘油二酯、单甘酯、脂肪酸。它的另一重要特征是只作用于异相系统，即在油(或脂)一水界面上作用，对均匀分散的或水溶性底物无作用即使作用也极缓慢，因此脂肪酶也可说是专门在异相系统或水不溶性系统的油(脂)一水界面上水解酯的酶。脂肪酶的天然底物主要为三酰甘油酯，脂肪酶可催化三酰甘油酯分解生成二酰甘油酯、单酰甘油酯并可进一步分解成甘油和脂肪酸。同时脂肪酶也具有催化高级脂肪酸和三价醇(丙三醇)逆向合成三酰甘油酯的作用。脂肪酶多功能催化作用的开发很大程度上取决于它对底物的作用方式，即以它的底物专一性为基础。而底物的专一性又与酶分子的结构，特别是酶活性中心的结构、底物的结构以及影响酶结合到底物上的因素和其他影响酶活性的因素有关。具体说来，脂肪酶的底物专一性包括四个主要方面:位置专一性、脂肪酸专一性、酯类专一性及立体专一性。
[0003]由于微生物脂肪酶具有种类多、作用pH较动植物脂肪酶广、温度范围广、对底物的专一性强等优点，所以脂肪酶的研究目前主要集中在微生物脂肪酶方面。产脂肪酶的菌类主要有黑曲霉菌、荧光假单胞菌、白地霉无根根霉菌、毛霉圆柱假丝酵母菌、巢子须霉德氏根霉菌、多球菌绵毛状腐质霉菌、圆弧青霉黏质色杆菌。据统计，产脂肪酶的微生物有65个属，其中细菌28个属， 放线菌4个属，酵母菌10个属，其它真菌23个属。因此，微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源。
[0004]当今，产脂肪酶菌株主要集中在根霉、假丝酵母、曲霉、须霉、毛霉、青霉及假单胞菌等菌种。近年来假丝酵母脂肪酶发酵虽取得一定进展，但对于发酵过程中的代谢物变化、菌体的代谢流迁徙、代谢物对脂肪酶产生的抑制物的研究尚没不明确，在发酵工艺方面则基本上仍是采用以动力学为基础的最佳工艺控制点为依据的静态操作方法，作为发酵过程中细胞代谢流的特性并未得到重视。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种脂肪酶的发酵生产方法。该方法将产脂肪酶的假丝酵母和/或装载了含有LIP2基因的质粒的耶氏酵母作为发酵菌种加入发酵培养基进行发酵生产脂肪酶，并以发酵液中的丙酮酸为代谢标志物来控制发酵过程。该方法通过向发酵培养基或发酵液中加入维生素B6来控制发酵液中的丙酮酸含量，并通过在发酵过程中控制发酵液pH、发酵液温度和通气量来控制碳源和氮源代谢。该发酵工艺通过控制发酵液中作为代谢标志物的丙酮酸解除了脂肪酶合成过程中的抑制作用，从而提高了假丝酵母产生脂肪酶的能力。
[0006]为此，本发明提供了一种脂肪酶的发酵生产方法，该方法是将发酵菌种接种至发酵培养基进行发酵生产脂肪酶，并以发酵液中的丙酮酸为代谢标志物来控制发酵过程。
[0007]本发明中，所述发酵菌种包括产脂肪酶的假丝酵母和/或装载了含有LIP2基因的质粒的耶氏酵母。优选所述产脂肪酶的假丝酵母包括皱落假丝酵母(Candida rugosa)产朊假丝酵母(Candida utilis)和假丝酵母Candida sp99_125。其中，皱落假丝酵母(Candidarugosa)、产朊假丝酵母(Candida utilis)和装载了含有LIP2基因的质粒的耶氏酵母均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)；假丝酵母Candida sp99_125菌株经北京化工大学生物加工过程重点实验室筛选、诱变后得到，现保存于该实验室。 [0008]在本发明的一个【具体实施方式】中，在发酵前先进行发酵菌株的种子培养，所述种子培养基组成(以下均为质量百分含量):
[0009]
葡萄糖1%;
大豆蛋白胨0.5%;
酵母浸粉0.3%;
麦芽浸粉0.1%;
其余部分以水补足。
[0010]在本发明的另一个【具体实施方式】中，按照5~10% (体积比)的接种量将发酵菌种接种于发酵培养基中进行发酵生产脂肪酶。
[0011]所述发酵培养基为(以下均为质量百分含量):
[0012]
rl10%;
[0013]
豆柏6%;
磷酸二氢钾0.1%;
磷酸氢二钾0.2%;
硫酸镁0.05%;
硫酸铵0.05%;
氯化钙0.05%;
聚乙 ^:(6000)1%；
明胶1%;
其余部分以水补足。
[0014]所述油包括大豆油、橄榄油、菜籽油、花生油、棕榈油、油酸其中的一种或几种。
[0015]发酵培养基中的碳源包括大豆油、橄榄油、菜籽油、花生油、棕榈油、油酸、甘油、甘露醇等。发酵培养基中有机氮源包括豆柏、全脂豆粉、大豆蛋白、玉米浆、蛋白胨、酵母粉等；无机氮源包括氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵等。以上碳源氮源可以单独使用也可复合使用。[0016]根据本发明方法，所述方法包括向发酵液中加入维生素B6来控制发酵液中的丙酮酸含量。例如，可以将所述发酵液中的丙酮酸含量控制在6mg/L以下。优选将所述发酵液中的丙酮酸含量控制在4mg/L以下。
[0017]在本发明的一个实施例中，还可以将维生素B6加入发酵培养基来控制发酵液中的丙酮酸含量。
[0018]本发明中，所述维生素B6可以在发酵第0小时加入发酵培养基，也可以在发酵过程中加入发酵液。所述维生素B6的加入量为10~100mg/L发酵液。优选所述维生素B6的加入量为50~100mg/L发酵液。
[0019]在本发明的一个实施例中，例如，当发酵液中的丙酮酸含量达到4g/L时，添加50mg/L的维生素B6 ;当发酵液的丙酮酸浓度达到6mg/L发酵液,则需添加100mg/L发酵液的维生素B6。
[0020]根据本发明，所述方法还包括在发酵过程中控制pH值，其包括:在发酵第Ohr至第48hr的第一阶段，发酵液的pH值自行下降，例如由初始的6.2降至4.6~4.8 ;在发酵第48hr至第72hr的第二阶段，将发酵液的pH值维持在4.6~4.8，以加速碳源代谢并抑制氮源过快代谢；在发酵第72hr至第200hr的第三阶段，将发酵液的pH值控制在5.0至5.2，以加快碳源代谢。本发明在发酵第200hr之后结束发酵。
[0021]本发明中，在发酵过程中控制pH值可以将碳源代谢、氮源代谢控制在合理的速率范围内。例如，发酵第一阶段为碳源代谢控制阶段，在该阶段内，菌体大量代谢，培养基中的碳源物质生长迅速，PH下降速率高，发酵液的pH值由初始的6.2降至4.6~4.8 ;发酵第二阶段为氮源代谢控制阶段，在该阶段内，菌体生长速率减缓，氮源代谢速率增加，而氮源代谢速率的增加会抑制目标产物脂肪酶的产量，将发酵液的PH值维持在4.6~4.8可以加速碳源代谢并抑制氮源过快代谢；发酵第三阶段为碳源代谢、氮源代谢联合控制阶段，在该阶段内，发酵液中碳源、氮源含量均很少，适量添加碳源，并提升pH值至5.0~5.2可以加快菌体代谢碳源的速率。
[0022]在本发明的一个优选实施方式中，所述方法还包括在发酵过程中控制温度和通气量，其包括:在发酵第Ohr至第48hr的第一阶段，将发酵液的温度控制在28~30°C，通气量控制在1.0~1.2vvm ;在发酵第48hr至第72hr的第二阶段，将发酵液的温度控制在26~28°C，通气量控制在1.0~2.0vvm ;在发酵第72hr至第200hr的第三阶段，将发酵液的温度控制在24~26°C，通气量控制在1.5~1.2vvm，该阶段碳源含量较少，菌体活力较低，适当加大通气量，有助于提高菌体的碳源代谢能力。
[0023]在本发明的另一个优选实施方式中，在发酵的第三阶段，加入油以补充发酵液中即将耗尽的碳源，每0.5天补加0.5% (质量比)的油，继续培养至第8.5天。所述油为大豆油、橄榄油、棕榈油中至少一种。
[0024]本发明中，发酵液中丙酮酸含量测量采用高效液相色谱法测定。
[0025]本发明中，脂肪酶活力的测定为橄榄油为底物的滴定法，酶活力的定义为:每分钟释放出Iumol的脂肪酸的酶量，为一个脂肪酶活力单位。参照中华人民共和国国家标准GB/T23535-2009。
[0026]本发明的发明人经过大量试验研究发现:菌体代谢产生脂肪酶，水解培养基中的油脂类物质为甘油和脂肪酸，甘油进入细胞生成3-磷酸甘油醛后沿EMP途径生成丙酮酸、乙酰辅酶A;脂肪酸经P氧化成为乙酰辅酶A进入TCA循环，成为菌体的营养物质。本发明的发明人进一步通过代谢组学的相关研究，建立了假丝酵母以及装载了含有LIP2基因的质粒的耶氏酵母中心代谢网络模型并进行代谢通量分析发现，在发酵中期，由于发酵液中脂肪酸含量增加，P -氧化过程抑制了 EMP途径，致使菌体丙酮酸脱氢酶活力降低，由丙酮酸至乙酰辅酶A的通路受阻，培养基内出现丙酮酸积累现象。而丙酮酸的积累反馈抑制了 @氧化过程，出现脂肪酸积累；菌体为满足自身生长，将培养基中氮源物质(蛋白质、肽类及氨基酸)中的碳骨架抽出作为碳源，由氨基酸至a -酮戊二酸的通量增加，剩余的氨基经尿素循环后生成尿素及胺类物质，表现为发酵液PH上升。此种现象会对脂肪酶的合成产生如下影响:
[0027](I)丙酮酸积累现象导致的脂肪酸积累，对脂肪酶具有产物抑制作用；
[0028](2)培养基中尿素及胺类物质，对脂肪酶具有变性抑制作用；
[0029]( 3 )蛋白类物质代谢速率加快导致蛋白酶大量合成，对脂肪酶有分解作用。
[0030]若将发酵过程中丙酮酸积累现象解除，则上述3种对脂肪酶的影响均会消失。因此，发酵过程中添加维生素B6作为谷丙转氨酶的辅酶强化谷丙转氨酶活力，使得积累的丙酮酸转化为丙氨酸，脂肪酸及时消耗，解除了对脂肪酶的产物抑制作用；同时，由于菌体转氨酶系活力的增强，细胞内丙酮酸转化为丙氨酸，减少了外源氨基酸的摄入，缓解氨基酸代谢的副产物尿素和胺类物质对脂肪酶产生的抑制作用。
[0031]根据本发明方法将产脂肪酶的假丝酵母和/或装载了含有LIP2基因的质粒的耶氏酵母作为发酵菌种加入发酵培养基进行发酵生产脂肪酶，并以发酵液中的丙酮酸为代谢标志物来控制发酵过程。该方法通过向发酵培养基或发酵液中加入维生素B6来控制发酵液中的丙酮酸含量，并通过在发酵过程中控制发酵液pH、发酵液温度和通气量来控制碳源和氮源代谢。该发酵工艺通过控制发酵液中作为代谢标志物的丙酮酸解除了脂肪酶合成过程中的抑制作用，从而提高了发酵菌种`产生脂肪酶的能力。
[0032]通过此种发酵工艺，细胞内转氨酶活力增加17%，发酵液中丙酮酸含量降低至原先的20%，解除了脂肪酶合成过程中的抑制作用，从而提高了假丝酵母产生脂肪酶的能力。月旨肪酶活力相比于原始发酵工艺(未添加维生素B68000IU/ml)提高了 2000-4000IU/ml发酵液以上。
【具体实施方式】
[0033]为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
[0034]实施例
[0035]实施例1:
[0036]生产菌株:皱落假丝酵母(Candida rugosa),购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)。
[0037]培养方法:配置2.5升发酵培养基置于5升罐内，插入标定好的pH电极与溶氧电极，接好空气过滤器，包扎好于121°C灭菌25min。消后pH为6.2~6.4，接循环水冷却至28°C，通入1.0vvm的空气，搅拌转速为220rpm。火焰接种，接种量为10% (体积比)。24小时后调节转速为300rpm。当培养基pH值降至4.7时，自动流加4M的氢氧化钠控制pH在4.7。当发酵进行到第3天时每12小时补充0.5%的大豆油，并调节温度至26°C，同时调整pH值至5.1,通气量为1.5vvm,添加维生素B650mg/1。[0038]通过此种发酵工艺，整个发酵过程中，丙酮酸的最高浓度控制在3ml/L发酵液的水平，第9天时，脂肪酶活力可达到11000IU/ml，相比于原始菌种皱落假丝酵母的原始发酵工艺(未添加维生素B68000IU/ml)提高了 3000IU/ml。
[0039]种子培养基:葡萄糖1% ;大豆蛋白胨0.5% ;酵母浸粉0.3% ;麦芽浸粉0.1%。
[0040]发酵培养基:大豆油10% ;豆柏6% ;磷酸二氢钾0.1% ;磷酸氢二钾0.2% ;硫酸镁0.05% ;硫酸铵0.05% ;氯化钙0.05% ;聚乙二醇(6000) 1% ;明胶1%。
[0041]实施例2:
[0042]生产菌株、种子培养基和发酵培养基同实施例1。
[0043]培养方法:配置2.5升发酵培养基置于5升罐内，插入标定好的pH电极与溶氧电极，接好空气过滤器，包扎好于121°C灭菌25min。消后pH为6.2~6.4，接循环水冷却至26°C，通入1.0vvm的空气，搅拌转速为220rpm。火焰接种，接种量为10% (体积比)。24小时后调节转速为300rpm。当培养基pH值降至4.7时，自动流加4M的氢氧化钠控制pH在4.7。当发酵进行到第3天时每12小时补充0.5%的大豆油，发酵过程中温度一直维持在26°C、通气量始终维持1.0vvm，添加维生素B650mg/1。
[0044]通过此种发酵工艺，整个发酵过程中，丙酮酸的最高浓度控制在3ml/L发酵液的水平，第9天时，脂肪酶活力可达到10000IU/ml，相比于原始菌种皱落假丝酵母的原始发酵工艺(未添加维生素B68000IU/ml)提高了 2000IU/ml。
[0045]实施例3:
[0046]生产菌株:装载有LIP2基因的耶氏酵母，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)。
[0047]种子培养基和发酵培养基同实施例1。
[0048]培养方法:配置2.5升发酵培养基置于5升罐内，插入标定好的pH电极与溶氧电极，接好空气过滤器，包扎好于121°C灭菌25min。消后pH为6.2~6.4，接循环水冷却至28°C，通入1.0vvm的空气，搅拌转速为220rpm。火焰接种，接种量为10% (体积比)。24小时后调节转速为300rpm。当培养基pH值降至4.7时，自动流加4M的氢氧化钠控制pH在
4.7。当发酵进行到第3天时每12小时补充0.5%的大豆油，并调节温度至26°C，同时调整pH值至5.1,通气量为1.5vvm,添加维生素B650mg/1。
[0049]通过此种发酵工艺，整个发酵过程中，丙酮酸的最高浓度控制在3ml/L发酵液的水平，第9天时，脂肪酶活力可达到12000IU/ml，相比于LIP2基因耶氏酵母的原始发酵工艺(未添加维生素B68000IU/ml)提高了 4000IU/ml。
[0050]实施例4:
[0051]生产菌株及培养方法同实施例1 ;
[0052]种子培养基:葡萄糖1% ;大豆蛋白胨0.5% ;酵母浸粉0.3% ;麦芽浸粉0.1%。
[0053]发酵培养基:大豆油10% ;全脂豆粉6% ;磷酸二氢钾0.1% ;磷酸氢二钾0.2% ;硫酸镁0.05% ;硫酸铵0.05% ;氯化钙0.05% ;聚乙二醇(6000) 1% ;明胶1%。
[0054]当发酵进行到第3天时每12小时补充0.5%的大豆油，并调节温度至26°C，通气量为1.5vvm,添加维生素B6100mg/1。
[0055]通过此种发酵工艺，通过此种工艺，整个发酵过程中，丙酮酸的最高浓度控制在3ml/L发酵液的水平，第7天时，脂肪酶活力可达10000IU/ml，相比于原始菌种皱落假丝酵母的原始发酵工艺(控制条件相同8000IU/ml)提高了 2000IU/ml。
[0056]实施例5:
[0057]生产菌株同实施例1。
[0058]培养方法:配置15升发酵培养基置于30升罐内，插入标定好的pH电极与溶氧电极，接好空气过滤器，包扎好于121°C灭菌25min。消后pH为6.2~6.4，接循环水冷却至26°C，通入1.5vvm的空气，搅拌转速为150rpm。火焰接种，接种量为10%。24小时后调节转速为300rpm。当培养基pH值降至4.7时，自动流加4M的氢氧化钠控制pH在4.7，同时添加维生素B650mg/1。
[0059] 种子培养基同实施例1。
[0060]发酵培养基:大豆油10% ;全脂豆粉6% ;磷酸二氢钾0.1% ;磷酸氢二钾0.2% ;硫酸镁0.05% ;硫酸铵0.05% ;氯化钙0.05% ;聚乙二醇(6000) 1% ;明胶1%。
[0061]通过此种发酵工艺，通过此种工艺，整个发酵过程中，丙酮酸的最高浓度控制在lml/L发酵液的水平，第8.5天时，脂肪酶活力可达12000IU/ml，相比于原始菌种皱落假丝酵母的原始发酵工艺(控制条件相同8000IU/ml)提高了 4000IU/ml。
[0062]实施例6:
[0063]生产菌株:假丝酵母Candida sp99_125，北京化工大学生物加工过程重点实验室保存。
[0064]培养方法:配置2.5升发酵培养基置于5升罐内，插入标定好的pH电极与溶氧电极，接好空气过滤器，包扎好于121°C灭菌25min。消后pH为6.2~6.4，接循环水冷却至28°C，通入1.0vvm的空气，搅拌转速为220rpm。火焰接种，接种量为10% (体积比)。24小时后调节转速为300rpm。当培养基pH值降至4.7时，自动流加4M的氢氧化钠控制pH在
4.7。当发酵进行到第3天时每12小时补充0.5%的大豆油，并调节温度至26°C，同时调整pH值至5.1,通气量为1.5vvm,添加维生素B650mg/1。
[0065]通过此种发酵工艺，整个发酵过程中，丙酮酸的最高浓度控制在3ml/L发酵液的水平，第9天时,脂肪酶活力可达到11000IU/ml,相比于原始菌种Candida sp99_125的原始发酵工艺(未添加维生素B68000IU/ml)提高了 3000IU/ml。
[0066]种子培养基:葡萄糖1% ;大豆蛋白胨0.5% ;酵母浸粉0.3% ;麦芽浸粉0.1%。
[0067]发酵培养基:大豆油10% ;豆柏6% ;磷酸二氢钾0.1% ;磷酸氢二钾0.2% ;硫酸镁0.05% ;硫酸铵0.05% ;氯化钙0.05% ;聚乙二醇(6000) 1% ;明胶1%。
[0068]对比例1:
[0069]生产菌株同实施例1。
[0070]培养方法:配置2.5升发酵培养基置于5升罐内，插入标定好的pH电极与溶氧电极，接好空气过滤器，包扎好于121°C灭菌25min。消后pH为6.2~6.4，接循环水冷却至28°C，通入1.0vvm的空气，搅拌转速为220rpm。火焰接种，接种量为10% (体积比)。24小时后调节转速为300rpm。当培养基pH值降至4.7时，自动流加4M的氢氧化钠控制pH在
4.7。当发酵进行到第3天时每12小时补充0.5%的大豆油，并调节温度至26°C，同时调整pH值至5.1，通气量为1.5vvm。
[0071]通过此种发酵工艺，脂肪酶活力可达到8000IU/ml。
[0072]种子培养基:葡萄糖1% ;大豆蛋白胨0.5% ;酵母浸粉0.3% ;麦芽浸粉0.1%。
[0073]发酵培养基:大豆油10% ;豆柏6% ;磷酸二氢钾0.1% ;磷酸氢二钾0.2% ;硫酸镁
0.05% ;硫酸铵0.05% ;氯化钙0.05% ;聚乙二醇(6000) 1% ;明胶1%。
[0074]通过上述实施例和对比例可以看出，本发明将产脂肪酶的假丝酵母和/或装载了含有LIP2基因的质粒的耶氏酵母作为发酵菌种加入发酵培养基进行发酵生产脂肪酶，并以发酵液中的丙酮酸为代谢标志物来控制发酵过程，通过向发酵培养基或发酵液中加入维生素B6来控制发酵液中的丙酮酸含量，并通过在发酵过程中控制发酵液pH、发酵液温度和通气量来控制碳源和氮源代谢。通过上述可以看出，产脂肪酶的假丝酵母、以及装载了含有LIP2基因的质粒的耶氏酵母通过此种发酵工艺，均会出现脂肪酶含量提高和丙酮酸含量下降的现象，说明该发酵工艺通过控制发酵液中作为代谢标志物的丙酮酸解除了脂肪酶合成过程中的抑制作用，从而提高了发酵菌种产生脂肪酶的能力。
[0075]通过此种发酵工艺，细胞内转氨酶活力增加17%，发酵液中丙酮酸含量降低至原先的20%，解除了脂肪酶合成过程中的抑制作用，从而提高了假丝酵母产生脂肪酶的能力。月旨肪酶活力相比于原始发酵工艺(未添加维生素B68000IU/ml)提高了 2000-4000IU/ml发酵液以上。
[0076]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种脂肪酶的发酵生产方法，该方法是将发酵菌种接种到发酵培养基进行发酵来生产脂肪酶，并以发酵液中的丙酮酸为代谢标志物来控制发酵过程。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括向发酵液中加入维生素B6来控制发酵液中的丙酮酸含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵液中的丙酮酸含量控制在6mg/L以下。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵液中的丙酮酸含量控制在4mg/L以下。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述维生素B6的加入量为10~100mg/L发酵液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述维生素B6的加入量为50~100mg/L发酵液。
7.根据权利要求1到6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在发酵过程中控制pH值，其包括: 在发酵第Ohr至第48hr的第一阶段，发酵液的pH值自行下降； 在发酵第48hr至第72hr的第二阶段，将发酵液的pH值维持在4.6~4.8 ; 在发酵第72hr至第200hr的第三阶段，将发酵液的pH值控制在5.0至5.2。
8.根据权利要求1到6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在发酵过程中控制温度和通入空气的通气量，其包括: 在发酵第Ohr至48hr的第一阶段，将发酵液的温度控制在28~30°C，通气量控制在1.0 ~1.2vvm ； 在发酵第48hr至第72hr的第二阶段，将发酵液的温度控制在26~28°C，通气量控制在 1.0 ~2.0vvm ； 在发酵第72hr至第200hr的第三阶段，将发酵液的温度控制在24~26°C，通气量控制在 1.5 ~1.2vvm。
9.根据权利要求1到8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述发酵菌种包括产脂肪酶的假丝酵母和/或装载了含有LIP2基因的质粒的耶氏酵母。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述产脂肪酶的假丝酵母包括皱落假丝酵母和假丝酵母Candida sp99_125。
【文档编号】C12R1/72GK103667206SQ201310633763
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】曹天一, 谭天伟 申请人:北京化工大学