一株低产高级醇的葡萄酒酵母的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株低产高级醇的葡萄酒酵母；是在培养酵母的平板中添加一定量的氯乙酸异戊酯，氯乙酸异戊酯在酵母菌乙酸异戊酯水解酶催化下生成氯乙酸，氯乙酸对酵母菌的生长具有强烈的抑制作用，如果突变菌株的酯分解酶活性大（酯酶分解酶活性大，菌株生成的高级醇多），进而分解产生的氯乙酸就多，所以菌落在氯乙酸的抑制作用下长的就会很小，利用本发明可以准确、方便、快速的筛选出低产高级醇的酵母菌种。利用本发明选育的低产高级醇酵母菌种生产葡萄酒，可以使葡萄酒中高级醇的含量降低10%～15%左右。利用本发明选育的高级醇低产菌株进行酒精发酵可有效降低葡萄酒中高级醇的含量，提高葡萄酒的保健价值。
【专利说明】一株低产高级醇的葡萄酒酵母
(-)【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株低产高级醇的葡萄酒酵母，属于葡萄酒酿造领域。
(二)【背景技术】
[0002]高级醇在葡萄酒中是最为常见的酵母次生代谢物，如果酒中含量过高会导致消费者饮用后上头、头疼和醉酒，严重影响葡萄酒的保健效果。
[0003]葡萄酒酵母代谢产生的高级醇主要有异戊醇、异丁醇、正丙醇和异己醇，其中异戊醇在葡萄酒高级醇组成中约占40%~50%。已有研究主要通过重氮染色平板法筛选低产高级醇酵母菌株来降低葡萄酒高级醇的含量。重氮染色平板显色原理:酵母菌乙酸异戊酯水解酶催化平板上的1-乙酸萘酯生成萘酚，后者与偶氮盐(固蓝盐B)反应，生成偶氮色素呈红色。当底物(1-乙酸萘)浓度一定时，酯酶活力越高，产物萘酚的量越大，生成的偶氮色素越多，酵母菌落颜色越深，高级醇生成量越大。
[0004]目前商业酵母的酯分解酶活性比较低，而且是经过多次驯化才用于工业生产，如果再进一步对这些菌种进行改造，酯分解酶活性变化幅度不是很大。如果用重氮染色平板法对其进行筛选，出发菌株与目的菌株之间的显色差异不明显，不利于突变菌株的挑选。所以为酿造低高级醇葡萄酒，寻找一种快速、准确、方便的筛选低产高级醇酵母菌的方法很有必要。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株低产高级醇的葡萄酒酵母，并提供了一种快速、准确、方便的选育低产高级醇酵母菌的方法，利用该酵母生产葡萄酒可解决葡萄酒中高级醇含量过高而使消费者饮后上头、头疼的问题。
[0006]本发明专利解决这个问题的途径是选用氯乙酸异戊酯平板筛选法。其原理是:在培养酵母的平板中添加一定量的氯乙酸异戊酯，氯乙酸异戊酯在酵母菌乙酸异戊酯水解酶催化下生成氯乙酸，氯乙酸对酵母菌的生长具有强烈的抑制作用，如果突变菌株的酯分解酶活性大(酯酶分解酶活性大，菌株生成的高级醇多)，进而分解产生的氯乙酸就多，所以菌落在氯乙酸的抑制作用下长的就会很小，利用本发明可以准确、方便、快速的筛选出低产高级醇的酵母菌种。
[0007]利用本发明选育的低产高级醇酵母菌种生产葡萄酒，可以使葡萄酒中高级醇的含量降低10%~15%左右。
[0008]本发明利用普通酿酒酵母分离培育出一株低产高级醇的葡萄酒酵母CP1118(Saccharomyces cerevisiae),经实验证明其具有降低葡萄酒中高级醇的能力。
[0009]一株低产高级醇的葡萄酒酵母CP1118 (Saccharomyces cerevisiae)已于2013年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);保藏编号:CGMCC N0.7828。
[0010]保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所[0011 ]分类命名:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0012]一株低产高级醇的葡萄酒酵母，通过以下方法制备得到:
[0013]a.用接种环挑取一环商业葡萄酒酵母菌体作为出发菌株，接种到20mL YH)液体培养基中，30°C振荡培养16~18h ；
[0014]b.然后取ImL步骤a培养后的YPD液体培养基12000r/min离心15s，弃上清液收集酵母细胞；再用无菌水洗涤收集到的细胞I次；
[0015]c.用ImL pH值为7.0无菌磷酸钠缓冲液(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠与无菌水的混合液；缓冲液的浓度0.lmol/L)，悬浮细胞；向悬浮后的细胞中加入30 μ L甲基磺酸乙酯(EMS)原液，振荡分散细胞，置于30°C摇床培养Ih后12000r/min离心15s ；
[0016]d.向步骤c离心后的细胞中加入ImL浓度为5%的无菌Na2S2O3溶液(Na2S2O3与无菌水的混合液)洗涤细胞两次，以失活EMS的突变作用。
[0017]e.收集步骤d)洗涤后的细胞，再用无菌水洗两次，后将细胞涂布氯乙酸异戊酯平板(CL平板)，30°C培养3天后挑选菌落最大者即为高级醇低产菌株(目的菌株)。将目的菌株命名为 CP1118 (Saccharomyces cerevisiae)。
[0018]对菌株CP1118 (Saccharomyces cerevisiae)进行遗传稳定性试验并进行高级醇生成量检测，证明该菌株传代培养后，仍具有降低高级醇生成量的作用，说明其遗传性状稳定。
[0019]通过高级醇生成量分析，确定目的菌株高级醇的生成量比出发菌的高级醇生成量明显降低。
[0020]该菌株的主要生物学特征为:呈卵圆形或圆形。菌落呈乳白色，表面湿润、粘稠，不透明，边缘整齐，易被挑起。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0，温度30°C。
[0021]本发明的有益效果:
[0022]利用本发明选育的高级醇低产菌株进行酒精发酵可有效降低葡萄酒中高级醇的含量，提高葡萄酒的保健价值。
(三)【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1出发菌株葡萄酒高级醇测定气相色谱图
[0024]以此为基准计算出出发菌株高级醇的生成量；
[0025]图2目的菌株葡萄酒高级醇测定气相色谱图
[0026]以此为基准计算出目的菌株CPl118高级醇的生成量；
(四)【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施案例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0028]本发明可使用普通商业葡萄酒酵母作为出发菌株。
[0029]YH)液体培养基:I %酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、用蒸馏水溶解；在121°C下灭菌15min ;pH自然；
[0030]YPD固体培养基:1%酵母提取物、2%的琼脂粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、用蒸馏水溶解；[0031]氯乙酸异戊酯平板(CL平板)培养基:0.67%的酵母氮源基础、2%的葡萄糖、2%琼月旨、90mg/L氯乙酸异戍酯；用蒸懼水溶解并调至pH7.0。
[0032]实施例1:低产高级醇葡萄酒酵母的选育
[0033]I)出发菌株的诱变:
[0034]a.从葡萄酒酵母EC1118斜面上用接种针挑取少量酵母菌体作为出发菌株，接种到盛有20mL YPD液体培养基中，在30°C下振荡培养16~18h，得到出发菌株菌液。
[0035]b.然后取ImL出发菌株菌液于离心管中12000r/min,离心15s收集细胞，用无菌水洗漆I次。[0036]c.用ImL pH值为7.0无菌磷酸钠缓冲液(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠与无菌水的混合液；缓冲液的浓度0.lmol/L)悬浮细胞，加30 μ L甲基磺酸乙酯(EMS)原液，振荡分散细胞，置于30°C摇床培养Ih后离心。
[0037]d.然后向离心管中加入与步骤c离心管中离心后的液体等体积的浓度为5%无菌Na2S203溶液后离心去上清液，重复操作2次，以失活EMS的突变作用。
[0038]2)目的菌株的筛选:
[0039]a.取步骤l)d中离心收集的细胞，然后再用无菌水洗二次并调整到稀释溶液中酵母细胞浓度为IO3个/mL时，即得到菌悬液；吸取30微升菌悬液涂布氯乙酸异戊酯平板(CL平板)，30°C培养3天，挑选菌落最大者即为高级醇低产菌株(目的菌株)。将此目的菌株命名为CPl 118并进行遗传稳定性试验。
[0040]3)目的菌株的遗传稳定性试验
[0041]a.将CP1118用接种环接种一环到YPD固体培养基中，持续培养2天，得到一代CP1118 ;再用接种环接种一环一代CP1118到新的YPD固体培养基中，持续培养2天，得到二代CP1118;以此类推，连续传代培养10次；
[0042]b.将传代培养至第10代的CPl118于Yro液体培养基中，28°C摇床培养2天，得到酵母菌CPl118菌液。
[0043]c.用无菌水将酵母菌CPl118菌液稀释到浓度为IO6个/mL。然后吸取ImL稀释的酵母菌CPl118菌液于灭菌的50mL葡萄汁中进行发酵，同时取ImL出发菌株菌液加入50mL同样的葡萄汁中发酵作为对照组；两组发酵条件相同；发酵结束后(至残糖含量低于4g/L)对两组葡萄汁进行高级醇的检测，检测结果表明使用菌株CP1118发酵的葡萄酒中高级醇的含量与使用出发菌株发酵的葡萄酒相比大幅度减低，且该菌株高级醇生成量稳定，该遗传稳定性试验表明目的菌株CP1118传代培养10代后仍具有降低高级醇生成量的作用，说明其遗传性状稳定。
[0044]实施例2:出发菌株与目的菌株高级醇生成量分析
[0045]高级醇的提取:精确量取8mL菌株CP1118发酵的葡萄酒，放入15mL的顶空瓶中，加入Ig NaCl，促进高级醇的挥发，再加入30 μ L内标(4-甲基-2-戊醇)，立刻用PTFE/硅橡胶隔垫密封压紧。当葡萄酒样温度到达45°C时，用DVB/CAR/PDMS的萃取头萃取50min，进样进行气相色谱-质谱分析。
[0046]GC/MS 条件:色谱柱，Stabilwax-DA 毛细管柱((30mX0.32mmX0.25 μ m));升温程序:30°C保持 lmin,以 6°C /m in 升至 100°C,以 3°C /min 升温至 200°C,以 10°C /min 升温至210°C，保持3min;进样器温度250°C;检测器温度250°C，无分流进样。电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV ;离子源温度200°C ;全扫描模式，质量扫描范围:30~400u。通过计算机检索与NIST08和WILEY7质谱库提供的标准质谱图对照进行确认。
[0047]高级醇的定性与定量分析:高级醇成分经气相色谱分离，不同组分形成其各自的色谱峰，用气相色谱-质谱-计算机联用仪进行分析鉴定。分析结果运用计算机谱库(NIST08和WILEY7)进行初步检索及资料分析，再结合文献进行人工谱图解析，定性定量分析该酵母发酵的葡萄酒中高级醇的含量。结果表明菌株CP1118总高级醇生成量为237.43mg/L，较菌株EC111·8总高级醇生成量(276.39mg/L)降低了近14%。
【权利要求】
1.一株保藏号为CGMCC N0.7828的低产高级醇的葡萄酒酵母CP1118，于2013年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.如权利要求1所述的葡萄酒酵母在降低葡萄酒高级醇中的应用。
3.培养如权利要求1所述葡萄酒酵母的氯乙酸异戊酯平板培养基，其组分为0.67%的酵母氮源基础、2%的葡萄糖、 2%琼脂和90mg/L氯乙酸异戊酯；用蒸馏水溶解并调至pH7.0。
【文档编号】C12R1/865GK103627646SQ201310633733
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】翟衡, 秦伟帅, 张娜, 杜远鹏 申请人:山东农业大学