提高苏云芽孢杆菌产几丁质酶的培养基及培养方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体来说是一种提高苏云芽孢杆菌产几丁质酶的培养基及培养方法；所述培养基原料配方为：葡萄糖或果糖，蛋白胨或酵母侵粉，Ba2+、Ca2+或K+，Vc或VB1，胶体几丁质，KH2PO4，余量为水；培养方法包括将苏云芽孢杆菌接种种子培养基，制得发酵种子液，将制得的发酵种子液按接种于所述培养基，250mL的三角瓶装液量为50～100mL，接种量5～15mL，于26℃，转速160r/min下培养。本发明培养基条件温和，易于控制；提供的用于苏云芽孢杆菌发酵生产几丁质酶的培养基，具有几丁质酶产率高，几丁质酶活力高等优点。
【专利说明】提高苏云芽孢杆菌产几丁质酶的培养基及培养方法
【技术领域】[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体来说是一种提高苏云芽孢杆菌产几丁质酶的培养基及培养方法。
【背景技术】
[0002]苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种革兰氏阳性菌,其在生长周期的稳定期形成的芽胞及伴胞晶体使其独具特性。由于苏云金芽胞杆菌制剂对靶标昆虫有特异性毒杀作用，且对人畜安全、不危害环境，在农业、林业和卫生害虫的防治上得到了广泛应用。
[0003]许多Bt菌除了合成杀虫晶体蛋白外，也能产生几丁质酶。Bt几丁质酶不仅具有杀虫增效作用，对病原真菌也有抑制作用，具有防治农作物病虫害的作用；几丁质酶在农业、工业、食品、医药等领域展现出良好前景，具有重要的经济价值。但由于Bt菌株几丁质酶产量普遍较低，制约了其在实际生产中的应用。因此，提高Bt几丁质酶产量是几丁质酶开发应用的关键问题之一。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是解决现有Bt菌株几丁质酶产量普遍较低的问题，提供一种提高苏云芽孢杆菌产几丁质酶的培养基及培养方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种提高苏云芽孢杆菌产几丁质酶的培养基，所述培养基原料配方为:17~25g/L葡萄糖或果糖，17~25g/L蛋白胨或酵母侵粉，4X l(T4mol/L Ba2+、Ca2+ 或 K+，0.01w%Vc 或 VB1,100ml/L 胶体几丁质，KH2PO40.6 (g/L)，余量为水。
[0006]进一步的，所述培养基原料配方为:20g/L葡萄糖或果糖，17g/L蛋白胨或酵母侵粉，4X l(T4mol/L Ba2\Ca2+ 或 K+，0.01w%Vc 或 Vbi，100ml/L 胶体几丁质，KH2PO40.6 (g/L)，余量为水。
[0007]进一步的，所述培养基的pH值为5.5~7.0。
[0008]进一步的，所述培养基的pH值为6.5。
[0009]本发明的另一目的是提供一种提高苏云芽孢杆菌产几丁质酶培养方法，包括如下步骤:
步骤一、将苏云芽孢杆菌接种种子培养基，制得发酵种子液；
步骤二、将步骤一中制得的发酵种子液按接种于所述培养基，250mL的三角瓶装液量为50~100mL，接种量5~15mL，于26°C，转速160r/min下培养。
[0010]进一步的,所述步骤一中的种子培养基的原料含有:150g/L淀粉,葡萄糖20g/L。
[0011]本发明的有益技术效果是:本发明培养基条件温和，易于控制；提供的用于苏云芽孢杆菌发酵生产几丁质酶的培养基，具有几丁质酶产率高，几丁质酶活力高等优点。【具体实施方式】
[0012]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0013]实施例1
苏云芽孢杆菌产几丁质酶发酵方法 (O发酵种子的制备 (A)菌种和培养基 菌种:苏云芽孢杆菌；
斜面培养基=PDA培养基；
液体种子培养基:土豆150g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL,自然pH，1.0lMPa，灭菌20mino
[0014](B)种子液制备 将斜面上的纯种苏云芽孢杆菌转接到多个250mL三角瓶中，其中装有IOOmL培养基，然后在27°C，在往复式震荡摇床转速160 r/min下培养培养4d，带菌丝生长健壮，菌液呈粘稠状时，说明种子已经生长好了。
[0015](2)发酵培养
发酵培养基:按照培养基优化正交实验结果配制，即2g葡萄糖，2g蛋白胨，0.083gBaCl2 (4X10-4mol/L Ba2+)，0.3g KH2PO4,0.01g Vc,蒸馏水定容至 1000mL, pH 6.5，
1.0 IMPa,灭菌 20min。
[0016]将上一步骤中制备的苏云芽孢杆菌发酵种子液，按培养条件正交实验得出的最佳条件，接种量15mL接种于250mL三角瓶中，瓶中装有50mL发酵培养液；摇床温度:26 0C ±1°C，转速 160 r/min ；
发酵周期:4d ；
菌株苏云金芽胞杆菌几丁质酶活力的测定:
取ImL菌体培养液于1.5mL离心管中，8000rpm离心lOmin。取200 μ L上清液加入200 μ L含10%胶体几丁质的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，50°C水浴lh。加入200 μ L l%Na0H溶液终止反应，混匀后8000rpm离心IOmin ;取上清400 μ L于新的离心管中，加入等体积的DNS试剂溶液，混匀后沸水浴IOmin ;以没有反应的培养液作对照，测OD535值。
[0017]一个酶活力单位定义为50°C、pH 6.0条件下反应Imin产生I μ gN_乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)所需要的酶量，酶活力测定结果均为3次以上实验结果的平均值。
[0018]测定结果表明:苏云芽孢杆菌生产几丁质酶的酶活为4.0IU/mL以上，该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。
[0019]实施例2
苏云芽孢杆菌产几丁质酶发酵方法 (O发酵种子的制备 (A)菌种和培养基 菌种:苏云芽孢杆菌；斜面培养基:PDA培养基；
液体种子培养基:土豆150g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL,自然pH，1.0lMPa，灭菌20mino
[0020](B)种子液制备
将斜面上的纯种苏云芽孢杆菌转接到多个250mL三角瓶中，其中装有IOOmL培养基，然后在27°C，在往复式震荡摇床转速160r/min下培养培养4d，带菌丝生长健壮，菌液呈粘稠状时，说明种子已经生长好了。
[0021](2)发酵培养
发酵培养基:按照培养基优化正交实验结果配制，即2g果糖，2g酵母侵粉,0.083gCaCl2 (4Xl(T4mol/L Ca2+),0.3g KH2PO4,0.01g VB1,蒸馏水定容至 1000mL, pH 6.5，
1.0IMPa,灭菌 20min。
[0022]将上一步骤中制备的苏云芽孢杆菌发酵种子液，按培养条件正交实验得出的最佳条件，接种量15mL接种于250mL三角瓶中，瓶中装有50mL发酵培养液；摇床温度:26 °C ±1°C，转速 160r/min ；
发酵周期:4d ；
菌株苏云金芽胞杆菌几丁质酶活力的测定:
取ImL菌体培养液于1.5mL离心管中，8000rpm离心lOmin。取200 μ L上清液加入200 μ L含10%胶体几丁质的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，50°C水浴Ih。加入200 μ L l%Na0H溶液终止反应，混匀后8000rpm离心IOmin ;取上清400 μ L于新的离心管中，加入等体积的DNS试剂溶液，混匀后沸水浴IOmin ;以没有反应的培养液作对照，测OD535值。
[0023]一个酶活力单位定义为50°C、pH 6.0条件下反应Imin产生I μ gN_乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)所需要的酶量，酶活力测定结果均为3次以上实验结果的平均值。
[0024]测定结果表明:苏云芽孢杆菌生产几丁质酶的酶活为4.0IU/mL以上，该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。
[0025]实施例3
苏云芽孢杆菌产几丁质酶发酵方法 (O发酵种子的制备 (A)菌种和培养基 菌种:苏云芽孢杆菌；
斜面培养基=PDA培养基；
液体种子培养基:土豆150g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL,自然pH，1.0lMPa，灭菌20mino
[0026](B)种子液制备 将斜面上的纯种苏云芽孢杆菌转接到多个250mL三角瓶中，其中装有IOOmL培养基，然后在27°C，在往复式震荡摇床转速160r/min下培养培养4d，带菌丝生长健壮，菌液呈粘稠状时，说明种子已经生长好了。
[0027](2)发酵培养
发酵培养基:按照培养基优化正交实验结果配制，即2g果糖，2g酵母侵粉,0.083g KCl(4Xl(T4mol/L K+)，0.3g KH2PO4,0.01g Vbi，蒸馏水定容至 lOOOmL，pH 6.5，1.0lMPa，灭菌20mino
[0028]将上一步骤中制备的苏云芽孢杆菌发酵种子液，按培养条件正交实验得出的最佳条件，接种量15mL接种于250mL三角瓶中，瓶中装有50mL发酵培养液；摇床温度:26 0C ±1°C，转速 160r/min ；
发酵周期:4d ；
菌株苏云金芽胞杆菌几丁质酶活力的测定:
取ImL菌体培养液于1.5mL离心管中，8000rpm离心lOmin。取200 μ L上清液加入200 μ L含10%胶体几丁质的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，50°C水浴Ih。加入200 μ L l%NaOH溶液终止反应，混匀后8000rpm离心IOmin ;取上清400 μ L于新的离心管中，加入等体积的DNS试剂溶液，混匀后沸水浴IOmin ;以没有反应的培养液作对照，测OD535值。 [0029]一个酶活力单位定义为50°C、pH 6.0条件下反应Imin产生I μ gN_乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)所需要的酶量，酶活力测定结果均为3次以上实验结果的平均值。
[0030]测定结果表明:苏云芽孢杆菌生产几丁质酶的酶活为4.0IU/mL以上，该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。
[0031]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.提高苏云芽孢杆菌产几丁质酶的培养基，其特征在于，所述培养基原料配方为:17~25g/L葡萄糖或果糖，17~25g/L蛋白胨或酵母侵粉，4X10_4mol/L Ba2+、Ca2+或K+，0.01w%Vc 或 Vbi，100ml/L 胶体几丁质，KH2PO4 0.6 (g/L)，余量为水。
2.根据权利要求1所述提高苏云芽孢杆菌产几丁质酶的培养基，其特征在于，所述培养基原料配方为:20g/L葡萄糖或果糖，17g/L蛋白胨或酵母侵粉，4X10_4mol/L Ba2+、Ca2+或K+，0.01w%Vc 或 Vbi，100ml/L 胶体几丁质，KH2PO40.6 (g/L)，余量为水。
3.根据权利要求根据权利要求2所述提高苏云芽孢杆菌产几丁质酶的培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为5.5~7.0。
4.根据权利要求根据权利要求3所述提高苏云芽孢杆菌产几丁质酶的培养基，其特征在于，所述培养基的PH值为6.5。
5.根据权利要求根据权利要求1~4所述提高苏云芽孢杆菌产几丁质酶培养方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一、将苏云芽孢杆菌接种种子培养基，制得发酵种子液； 步骤二、将步骤一中制得的发酵种子液按接种于所述培养基，250mL的三角瓶装液量为50~1OOmL,接种量5~15mL，于26°C，转速160r/min下培养。
6.根据权利5所述苏云芽孢杆菌发酵生产几丁质酶的方法，其特征在于，所述步骤一中的种子培养基的原料含有:150g/L淀粉，葡萄糖20g/L。
【文档编号】C12N9/42GK103667217SQ201310644572
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】段升华 申请人:中山奈德生物科技有限公司