缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶基因序列及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶基因序列及其应用。具体地，基于缺刻缘绿藻转录组测序数据，克隆获得缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶基因cDNA全长序列及基因全长，通过将该基因在酵母的TAG合成缺陷株H1246中表达，发现其编码蛋白确实具有TAG的合成能力，并通过底物偏好性实验证实该基因所编码的蛋白更倾向于C18:1脂肪酸。本发明为通过遗传操作实现TAG的大规模合成提供了一条新途径。
【专利说明】缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶基因序列及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体地说，涉及缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶基因序列及其应用。
【背景技术】
[0002]能源是人类社会发展的基础，目前全球正面临着能源危机，石油资源供应紧张。由于生物能源的可再生性，生物能源的开发越来越受到关注，而微藻生物柴油以其不与人争粮、不与粮争地、不与畜争料的独特优势吸引了越来越多科研工作者的关注。
[0003]不同种类的微藻合成三酰甘油(triacylglycerol, TAG)的能力各不相同。研究发现，绿藻、硅藻等真核微藻的油脂含量比较高，有希望成为生物柴油的生产藻种。缺刻缘绿藻incisa Reisigl H4301)是一种淡水单细胞微藻，隶属绿藻门(Chlorophyta),该藻能大量积累TAG，尤其是在缺氮条件下，是潜在的微藻生物柴油藻种。
[0004]TAG是植物中最主要的贮存脂质，对植物的生长发育也起着重要作用。目前已经发现TAG的合成酶有二酰甘油酰基转移酶(DGAT ；EC 2.3.1.20)、磷脂:二酰甘油酰基转移酶(PDAT ；EC 2.3.1.158)和二酰甘油转酰基酶(DGTA)。其中，DGAT是TAG合成的最主要酶，它沿着Kennedy途径催化TAG合成的最后一步，也是该合成途径中唯一的限速酶。到目前为止，发现DGAT有三个家族，分别为DGATl、DGAT2和DGAT3。
[0005]中国期刊《上海海洋大学学报》，2012年9月，第21卷第5期，刊出的论文“缺刻缘绿藻转录组测序及脂质代谢相关基因注释”，该论文作者为了能深入地了解缺刻缘绿藻花生四烯酸和脂质的代谢过程，利用Roche 454 GS FLX测序仪对该藻转录组进行高通量的焦磷酸测序，得到高质量读序(read) 382468条，占原始读序的97.14%，平均每条读序长322bp，总大小达123Mb，再 经CAP3软件拼接得到22714条重叠群、25621条singleton。将这些序列与公共数据库进行同源性搜索、比较、基因功能注释和分类，并基于转录组中所注释的基因构建了缺刻缘绿藻脂质代谢途径。但是该论文并未披露缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶的cDNA序列，而且本领域技术人员均知，高通量测序方法存在误差，测出的cDNA序列并非100%准确，存在误差的可能性极大，因此根据该论文本领域技术人员也难以得出准确的缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶基因序列。
[0006]中国专利文献CN201210477507.7，
【公开日】2013.02.27，发明名称为“一种编码缺
刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶的DNA序列及其应用”，基于缺刻缘绿藻转录组测序数据，筛选获得了一种缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2)基因的cDNA全长序列，通过同源比对分析确定该酶为DAGT2基因家族，并进一步获得了 MiDGAT2的DNA全长序列，然后通过将该在酵母的TAG合成缺陷株H1246中表达，证实该基因编码蛋白确实具有TAG的合成能力。而缺刻缘绿藻是一种真核藻类，其内可能并不只包含一种二酰甘油酰基转移酶，而可能是由多个同工酶来催化 TAG的合成。同工酶(Isozyme / Isoenzyme)是指性质不同(Vmax和/或Km不同)但催化反应相同的酶，又称为同功异构酶。它们可以以不同的量出现在一种生物的不同组织或器官中，也可以出现在任何真核生物细胞不同的细胞器。其差异可以是在蛋白质的一级结构上，也可以是在四级结构或翻译后加工上。其存在可被细胞用来根据细胞内特定的生理状况而对酶活性进行调节。同工酶是基因分化的产物，而基因的分化又是生物进化过程中为适应愈趋复杂的代谢而引起的一种分子进化，以适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要，是基因编码的蛋白质表现型。因此，发现并研究缺刻缘绿藻的其它二酰甘油酰基转移酶及其基因序列，对于研究缺刻缘绿藻的物种进化、遗传变异等具有重要的意义，同时也将为通过基因工程方法合成TAG提供新的途径。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种多肽。 [0008]本发明的再一的目的是，提供一种分离的核苷酸序列。
[0009]本发明的另一的目的是，提供一种重组表达载体。
[0010]本发明的第四个目的是，提供一种基因工程化的宿主细胞。
[0011]本发明的第五个目的是，提供上述多肽、核苷酸序列、重组表达载体或宿主细胞的用途。
[0012]为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是:
一种多肽，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0013]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
一种分离的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列包括:
a)SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所述的核苷酸序列；或
b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0014]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
一种重组表达载体，所述的重组表达载体是由如上所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。
[0015]优选地,所述的质粒是pYES2质粒。
[0016]为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是:
一种基因工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞选自于下列中的一种:
a)用如上所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞及其后代细胞；
b)用如上任一所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。
[0017]优选地，所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。
[0018]更优选地，所述的宿主细胞是酵母细胞。
[0019]为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是:
如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上任一所述的重组表达载体、或如上任一所述的宿主细胞在生产三酰甘油中的用途。
[0020]本发明优点在于:
本发明基于缺刻缘绿藻转录组测序数据，得到了一条与已知DGAT基因有很高相似性的一条长309bp的片段，基于该片段序列并利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆到该基因的cDNA全长序列，通过同源比对分析确定该酶为DAGT2基因家族，并进一步克隆获得基因全长。通过将该基因在酵母的TAG合成缺陷株H1246中表达，即基因功能互补试验，发现该基因编码蛋白确实具有TAG的合成能力，从而证实了该基因的功能，并通过底物偏好性实验证实该基因所编码的蛋白更倾向于C18:1脂肪酸。该基因的克隆为通过遗传操作实现TAG的大规模合成提供了新途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1.pMD19T载体图谱。
[0022]图2.pYES2载体图谱。
[0023]图3.缺刻缘绿藻基因结构示意图。灰色线是非转录区，黑色线为内含子，黑色框为外显子。
[0024]图4.酵母油脂的薄层色谱图。从左道到右道依次为野生型酵母Scy62、缺陷株Hl246、携带pYES2的缺陷株、转的缺陷株和TAG标准品。
[0025]图5.酵母细胞的Bodipy染色图片。从左到右依次为野生型酵母Scy62、缺陷株H1246、携带pYES2的缺陷株、转#切似729的缺陷株。
[0026]图6.MiDGAT2B酶蛋白的底物偏好性分析。
【具体实施方式】
[0027]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0028]本发明的技术 路线是:
1)在温度为25°C、光照强度为115μ mo I photons m_2 *s_1的条件下,于BG-11培养基中培养缺刻缘绿藻。收集藻细胞，并提取基因组DNA和RNA ；
2)自缺刻缘绿藻转录组测序数据中筛选得到一条与已知DGAT基因有很高相似性的长309bp的片段，基于该片段序列，利用RACE技术得到缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶基因的cDNA序列全长，经序列比对发现它与本课题组已经克隆到的DGAT2家族中另一基因的cDNA序列(专利申请号CN201210477507.7)不同，它俩只有48%的同源性，为此，我们将本次克隆得到的缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶基因命名为然后，利用缺刻缘绿藻RNA反转录的cDNA为模板对#切似729的cDNA全长序列进行验证；
3)根据全长的cDNA序列设计引物，利用缺刻缘绿藻基因组DNA作为模板进行PCR扩增，得到MiDGAT2B的DNA全长序列；
4)根据M/偏挪的cDNA全长序列设计引物，利用PCR构建pMD19T/MiDGAT2B质粒；
5)对pYES2载体和pMD19T/MiDGAT2B质粒进行双酶切CKa
I /&0R I)，回收目的片段，再用T4连接酶连接得到重组表达载体pY_MiDAGT2B ；
6)将重组表达载体pY_MiDAGT2B用电穿孔仪电击法转化酵母缺陷株H1246，应用尿嘧啶缺陷的合成培养基(SC-U培养基)筛选转化株，得到转基因酵母Y_MiDGAT2B ；
7)将转基因、转空载体和未转基因的酵母H1246以及野生型酵母Scy62接种于SC培养基，72h后收集酵母细胞，冷冻干燥；
8)利用薄层色谱(TLC)检测酵母总脂成分，证实了转基因酵母Y-MiDGAT2B含有三酰甘油。同时还利用油体特异荧光染料Bodipy对转基因、缺陷型及野生型酵母进行细胞染色，发现转基因酵母Y_MiDGAT2B重建了油体，从而证明了 MiDGAT2B编码蛋白具有TAG的合成功能；
9)测定分析#//--729所编码MiDGAT2B酶蛋白的底物偏好性。
[0029]实施例1 1、实验材料
I)缺刻缘绿藻incisa Reisigl H4301)购自捷克布拉格查理斯大学藻类培养中心(CAUP)。在温度为25°C、光照强度为115 μ mo I photons m_2.s'光/暗比为12h/12h的条件下培养，培养基为BG-1I。
[0030]2)pMD19T载体(载体图谱见图 1)、pYES2载体(载体图谱见图2)购自Invitrogen公司。酵母缺陷株H1246和野生型Scy62购自瑞典农业科技大学Dr.Stymne实验室,将酵母接种于SC培养基(购自上海酶联生物科技有限公司)，在30°C下以200rpm转速振荡培养。SMART?RACE cDNA扩增试剂盒购自Clontech公司。活酵母用油体特异荧光染料Bodipy购自 GENMED SCIENTIFICS INC.U.S.A。TAG 标准品购自英国 Nu-Chek 公司。
[0031]2、实验方法
I)取IOOmg新鲜的缺刻缘绿藻细胞置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。
[0032]2) CTAB法提取基因组DNA和TRIzol法抽提总RNA，_20°C保存备用。
[0033]3)根据缺刻缘绿藻转录组测序数据筛选得到一条与已知DGAT基因有很高相似性的长309bp的片段，根据该序列设计引物，利用SMART?RACE cDNA扩增试剂盒进行PCR扩增。5’-RACE采用巢式PCR，第一轮的PCR反应条件为:94°C变性30s、68°C退火30s及72°C延伸2min, 20 个循环，引物为 GSPl (AGGTCGCCTGTGAACTTGGGGATGT, SEQ ID N0.4)和 UPM ;第二轮PCR反应取1.5μ?第一轮PCR产物直接作为第二轮反应模板，反应条件为94°C变性30s、70°C退火 Imin 和 72°C延伸 2min，共 30 个循环，引物为 GSP2(ACGGTGACATGGCGCACAGGGTTGG，SEQ ID N0.5)和NUPM。3’ -RACE反应条件同5’ -RACE第二轮PCR反应条件。随后，产物进行胶回收，TA克隆并送上海生工生物工程公司测序。将测序得到的5’ -和3’ -片段与已知的序列片段进行拼接，就可以得到基因的cDNA全长序列。
[0034]4)根据RACE技术得到的#27--/1现的cDNA全长序列设计引物:
MiDGAT2BF:5’ CAGTTACAAATCGCGTTCTGCTTA 3’ (SEQ ID N0.6);MiDGAT2BR:5’
TCCCCAGTCAAGAGTGTGCTACTC 3’ (SEQ ID N0.7)，以缺刻缘绿藻 RNA 反转录的 cDNA 为模板进行PCR扩增。PCR反应程序为94°C预变性5min，35个循环包含94°C变性30s、64°C退火45s、72°C延伸2min，最后72°C延伸lOmin。PCR产物胶回收后连接pMD19T载体，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，菌落PCR验证，菌液送到上海生工生物工程有限公司测序，以证实缺刻缘绿藻的序列。
[0035]5)根据Mf偏Σ2&的cDNA全长序列设计引物，以缺刻缘绿藻基因组DNA为模板进行PCR扩增。扩增条件为94°C预变性5min，35个循环包含94°C变性45s、65°C退火45s、72°C延伸2min，最后72°C延伸lOmin。PCR产物按上述方法经胶回收、TA克隆，送上海生工生物工程公司测序，得到缺刻缘绿藻的DNA全长序列。
[0036]6)根% MiDGAT2B的cDNA全长序列设计引物:上游引物F:gaattcAAAATGGAGCTGGCCTCAGC (SEQ ID N0.8，小写字母为&oR I酶切位点，酶切位点后的 AAA 为酵母一致性序列)；下游引物 R:tctagaCTACTCGATGATGTGCAG (SEQ ID N0.9，小写字母为I酶切位点)，它们含有油al和feoRI的酶切位点，利用PCR方法构建PMD19T/
M1DGAT2B质粒。25μ?的PCR扩增反应体系包含2.5μ?的Ex Taq缓冲液、2μ?的(1ΝΤΡ、2μ?的Mg2+、2PL的cDNA模板、引物各Ιμ?、0.25μ?的Ex Taq酶及14.5μ?无菌水。扩增条件为94°C预变性5min，35个循环包含94°C变性45s、64°C退火45s、72°C延伸2min，最后72°C延伸lOmin。PCR产物按上述方法经胶回收、TA克隆，送上海生工生物工程公司测序保证序列的准确性。
[0037]7)从大肠杆菌DH5 α中抽提pMD19T/MiDGAT2B质粒，用限制性内切酶油al和 I进行双酶切消化反应，同时对pYES2质粒也进行处al/^boRl双酶切反应。反应体系
为4PL的IOXM缓冲液、4PL的0.1% BSA,DNA约2Pg、油al及汾oRl各?μ?、加无RNase水
至20μ?。37°C消化反应4h。割胶回收酶切后的目的片段，并用T4 DNA连接酶将酶切后的MiDGAT2B片段与pYES2片段连接得到重组表达载体pY_MiDGAT2B。连接反应体系为2.5μ?的缓冲液，DNA 约 0.3pmol (MiDGAT2B\ 鸯体 DNA 约 0.03pmol (pYES2 片段)，?μ? 的 Τ4 DNA连接酶，加无RNase水至25μ?。16°C连接过夜。连接后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，按照上述方法进行克隆、菌落PCR验证和测序。从大肠杆菌DH5a中抽提pY_MiDGAT2B质粒，_20°C保存备用。
[0038]8)酵母感受态细胞制备。将酵母接种于SC培养基中，30°C复苏培养过夜，然后按I: 100放大培养，以200rpm转速振荡培养至细胞密度约为I X IO8 cells/mL (约4~5h)。冰上冷却15min使细胞停止生长，4°C条件下以5000rpm转速离心5min收集酵母细胞，预冷无菌水洗涤细胞3次，同样条件下离心收集。20mL预冷的IM山梨醇洗涤细胞I次，然后溶于
0.5mL预冷的IM山梨醇，调整细胞的浓度在I X 101° cells/mL。冰上保存细胞，便于电击使用。
[0039]9)利用电穿孔仪(Bio-Rad公司)电击，将重组的载体pY_MiDGAT2B转化酵母H1246感受态细胞。取在冰上预冷的待转化的重组`表达载体pY_MiDGAT2B约5~IOPL (5~200ng)与感受态细胞混匀，并与0.2cm的电击杯一起冰上预冷，然后将DNA与细胞混合液转移到预冷的电击杯轻轻混匀，冰浴5min后，选择程序Sc2电击一次，移走电击杯，立刻加入ImL预冷的IM山梨醇，轻轻转移到新的YPD培养基中，30°C轻微振荡5h，将菌液涂布于含有IM山梨醇的SC-U培养基上，30°C倒置静置培养48-72h，挑取菌落于液体SC-U培养基中培养。菌落PCR验证后，用含2%葡萄糖的SC-U培养基保存菌种。另外，按上述同样方法将空载体PYES2电转到H1246上。
[0040]10)将保存的菌液接种到SC培养基中，30°C下以200rpm转速振荡培养72h，收集酵母，冻干。
[0041]11)提取冻干后酵母的总脂。提取方法:准确称量50mg酵母粉置于试管中，加入ImL氯仿:甲醇(1:2)，再加入200-300 μ L玻璃珠，涡旋震荡15min，镜检观察细胞壁是否破碎完全。4000rpm离心15min后，将上清液吸出至新试管中，加入400yL 50mM柠檬酸及600 μ L氯仿,充分混匀后,4000rpm离心15min,小心吸取下层溶液,放入酯化瓶中用氮气吹干。[0042]12)薄层色谱(TLC)验证转基因酵母的三酰甘油。所用展开剂为己烷:乙醚:冰醋酸(80/20/1，v/v/v)。显色剂:10% (w/v)CuS04.5Η20 加到 8% (ν/ν)磷酸溶液。在提取的酵母总脂中加入30 μ L氯仿，用毛细管点样到硅胶60 F254板(Merck公司)上，将板放入层析缸中展开，取出，喷显色剂，140°C烘焙lOmin。
[0043]13)将活酵母用油体特异荧光染料Bodipy染色，用激光共聚焦显微镜(Leica公司)观察，拍照。
[0044]14)MiDGAT2B蛋白底物偏好性实验:所用展开剂为己烷:乙醚:冰醋酸(80/20/1，v/v/v)。显色剂:10% (w/v)CuS04.5Η20加到8% (ν/ν)磷酸溶液。在提取的酵母总脂中加Λ 30 μ L氯仿，用毛细管点样到制备型硅胶60 F254板(Merck公司)上，将板放入层析缸中展开，取出晾干，于254nm紫外光下刮出带有TAG的硅胶，碾成粉末，用正己烷洗脱TAG于酯化瓶中，氮气吹干用于甲酯化。加入ImL含4%硫酸的甲醇溶液。充氮气后，于85°C水浴锅酯化反应lh，便于将结合的脂肪酸分子充分解离并甲基化。酯化反应后，向上述酯化瓶中分别加入ImL去离子水和ImL正己烧,充分混匀,然后在5500 rpm下离心lOmin。收集上清液至样品瓶中，氮气浓缩，4°C保存用于气相色谱分析。采用Angilent 6890 plus型气相色谱仪进行脂肪酸组成分析，色谱柱为HP-5型毛细管柱(30mX0.25mm);升温程序为50°C保留lmin，25°C /min升温至200。。，3。。/min升温至230°C，最后保留18min ;分流比为50:1 ;氮气、氢气、空气的流速分别为30mL/min、450mL/min、40mL/min。进样量为I μ L。以上实验均重复三次。
[0045]3、结果 O根据RACE技术获得并经过PCR扩增验证，得到缺刻缘绿藻#//--T1现的cDNA全长序列(SEQ ID N0.1):其5，-非翻译区(5，-UTR)长170bp，3’ -UTR长1460bp，开放阅读框架长1068bp。利用缺刻缘绿藻基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，产物经序列分析后得3\MiDGAT2B的DNA全长序列(SEQ ID N0.2):总长4149bp，存在6个内含子，它们的长分别为 253bp (第 374-626bp)、248bp (第 754_1001bp)、279bp (第 1141_1419bp)、178bp (第1613-1790bp)、282bp (第 1927_2208bp)和 235bp (第 2339_2573bp)，将该基因的编码序列分成7个外显子(图3)。MiDGAT2B编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0046]2)转基因酵母Y_MiDGAT2B经半乳糖诱导培养后，其脂肪的TLC检测结果显示，MiDGAT2B表达产物能够使TAG合成缺陷株酵母H1246中重新合成TAG (图4)。
[0047]3)利用油体特异荧光染料Bodipy对酵母进行细胞染色，与TAG合成缺陷株酵母H1246相比较，发现转基因酵母Y-MiDGAT2B重建了油体(图5)，从而更进一步地证明了MiDGAT2B编码蛋白具有TAG的合成功能。
[0048]4)酵母含有4种脂肪酸，分别是C16: O，C16:1，C18:0和C18:1，但其TAG的气相色谱检测结果显示只检测到C16:1和C18:1两种脂肪酸，说明只有这两种脂肪酸参与了 TAG的合成。DGAT的作用是在二酰甘油的甘油骨架的第三碳位上转一个酰基，从而生成三酰甘油。因此，如果气相色谱检测结果中C18:1越多，则说明有更多的C18:1被用于TAG的合成。为了进一步分析MiDGAT2B蛋白和MiDGAT2蛋白(专利申请号CN201210477507.7克隆的基因所编码的MiDGAT2蛋白)的底物偏好性，我们采用了 C16:1与C18:1的峰面积比值这个参数。结果(图6)显示，转酵母株的TAG中C16:1与C18:1的比值为1.3394，与野生型3(^62的(1.3420)相近，经SPSS 13.0软件分析，无显著差异(P>0.05)；但转#27--/1现酵母株，该比值为1.2501，差异显著(P〈0.05)。这些结果说明MiDGAT2与MiDGAT2B对C16:1和C18:1的底物具有显著差异的选择性，MiDGAT2B更倾向地利用C18:1来合成TAG。
[0049]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。`
【权利要求】
1.一种多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
2.一种分离的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列包括: a)SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所述的核苷酸序列；或 b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
3.—种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体是由权利要求2所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的质粒是PYES2质粒。
5.一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞选自于下列中的一种: a)用权利要求2所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞及其后代细胞； b)用权利要求3或4所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是酵母细胞。
8.权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的核苷酸序列、权利要求3或4所述的重组表达载体、或权利要求5- 7任一所述的宿主细胞在生产三酰甘油中的用途。
【文档编号】C12N1/21GK103756985SQ201310668330
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】周志刚, 曹海生, 房逢立 申请人:上海海洋大学