一种具有抗癌作用的小肽ltf及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有抗癌活性的小肽LTF，它具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；所述小肽LTF在较低浓度下具有抗癌活性，在相应浓度时对正常细胞的生长无影响。本发明还公开了所述小肽在制备抗癌药物中的应用以及在制备转基因生物中的应用。
【专利说明】一种具有抗癌作用的小肽LTF及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学领域，涉及肿瘤治疗和预防，具体涉及具有抗癌作用的小肽及其应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤已成为威胁人类健康的主要疾病之一，随着不健康、不均衡的饮食习惯及环境污染等的影响，肿瘤的发病率正在逐年攀升。中国抗癌协会公布的统计数字显示，我国近年来乳腺癌发病率正以每年3%的速度递增，发病年龄也呈逐渐年轻化的趋势，是城市女性死亡率增长最快的癌症。在中国主要城市北京、上海、天津等，10年来乳腺癌发病率增长了37%，死亡率增长了 38.9%。在未来10年，我国将面临癌症发病和死亡的双重负担。目前，癌症的主要治疗手段是手术治疗、放疗、化疗以及近年来发展起来的靶向治疗。然而，就疗效而言，除早期病人可经手术切除治愈外，对中晚期病人，尤其是有远处转移的晚期病人，目前尚无有效的根治性治疗。鉴于此，寻找、低毒性，新型抗肿瘤药物仍然是肿瘤研究者，肿瘤药物学家及各大生物医药公司研究的重点及攻关方向。
[0003]近年来小分子蛋白肽在人体中的作用已引起科学界的高度重视。大量研究结果表明，蛋白质摄入后并不完全水解成氨基酸，而是大部分以肽的形式吸收，同时发现肽被吸收的速度比同组成的氨基酸要快。多肽涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域、可被广泛用于医疗卫生，保健食品等方面。多肽类药物的主要特点是用量小，生物活性强，对癌症，自身免疫性疾病等有显著疗效和广泛的应用前途。随着医学及生物化学技术的发展，多肽类药物将成为21世纪重要的治疗、诊断、及预防性药物。因此开展多肽药物的研究具有重要的科学和健康意义。多肽类药物的研究主要包括抗肿瘤多肽，抗菌活性多肽，多肽导向药物，多肽疫苗，细胞因子模拟太，诊断用多肽及其它药用小肽等7大类。本发明就是涉及一种可用于抗肿瘤治疗的小分子多肽。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种能够抑制肿瘤生长，用于肿瘤治疗的小分子肽(命名为小肽LTF)。所述小肽LTF，它是SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列；其所示信息为:长为9氨基酸，具体序列为:Pro Lys He Lys Glu He Ala Ala Lys (或 PKIKEIAAK)。
[0005]本发明的小肽具有抗肿瘤细胞生长的活性，同等浓度下对人正常细胞生长无抑制活性，可用于癌症的治疗以及用作动植物转基因源头序列与保健防癌食品的开发。
[0006]相应地，本发明还提供所述小肽LTF在制备抗肿瘤药物中的应用。包括小肽LTF在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用。
[0007]功能实验已证实小分子肽LTF具有抗肿瘤活性，因此本领域普通技术人员知道，由于本发明的小肽B为线性序列，无任何修饰，根据密码子表，此小肽可以由其氨基酸对应的三联体密码碱基序列的任意组合获得相应的核苷酸序列，根据密码子的简并性，相对该序列可以获得的核酸序列可达74左右。 所述的核酸序列可以作为功能基因用于制备转基因动物及植物，创造新品种及表达功能蛋白(或小肽)。因而本发明还提供编码所述小肽的的核苷酸序列及其应用。将此核酸序列通过载体或直接注射入需要转入基因的动物、植物或微生物体内，使遗传信息进行翻译表达便可。例如:以转基因微生物为例:简述如下，由本发明的小肽LTF可以获得如下核酸序列5’-cct aag att aaa gag ate get gca aag_3’(SEQ ID NO:2),将此核酸序列人工合成后，以常规方法连入基因工程载体如大肠杆菌的表达载体PQE30L，转化DH5a，获得阳性克隆后，过夜培养，转培养3_4小时后，用IPTG诱导表达，便可获得转入核酸片段，同时有外源性多肽产生的转基因微生物新品种，其这种表达方法的具体操作非常常规。
[0008] 鉴于本发明所述的小肽LTF有特异性抗癌细胞的作用，因此本领域普通技术人员可以人工合成以后，作为有防癌效果的保健食品或食品成分在工业生产，食品开发等中使用。本发明所述小肽LTF在制备预防癌症的保健食品中的应用。
[0009]功能实验显示:本发明所述小肽LTF能抑制肝癌，肺癌，乳腺癌，及甲状腺癌等癌细胞株的生长，提示其在癌症临床治疗中具有重要的开发和应用价值，可用来开发抗肿瘤多肽药物。本发明提供的氨基酸长度小于10个，其不需要任何修饰连接，为线性多肽，且人工合成方便，实验证明其具有有效的抑制癌细胞，抗肿瘤生长的功能，对人正常细胞无毒性。因此，上述也表明了本发明的优点所在。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1.小肽LTF抑制肺癌细胞(H460)生长活性。用MTT法测定不同小肽LTF浓度下活性细胞的数量。
[0011]图2.小肽LTF抑制乳腺癌细胞(MCF7)生长活性。用MTT法测定不同小肽LTF浓度下活性细胞的数量。
[0012]图3.小肽LTF抑制肝癌细胞(MCF7)生长活性。用MTT法测定不同小肽LTF浓度下活性细胞的数量。
[0013]图4.小肽LTF对正常乳腺上皮细胞MCFlOA生长无抑制活性。用MTT法测定不同小肽LTF浓度下活性细胞的数量。
[0014]图5.小肽LTF抑制小鼠乳腺移植瘤生长。用荧光素酶标记的MCF7细胞(IxlO7细胞/注射)与等体积基底膜基质蛋白(Matrigel basement membrane matrix) (BDBiosciences, NJ)混合,皮下注射到4_6周龄的裸鼠。形成明显肿瘤后，动物随机分组，用小肽LTF处理。左:小肽LTF，注射量I mM ;右:生理盐水(PBS)对照。
[0015]
【具体实施方式】
[0016]下面通过【具体实施方式】的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
[0017]实施例1:多肽的设计与合成
利用蛋白质分析数据库(http://www.expasy.0rg/)及蛋白质资料库(http://www.rcsb.0rg/pdb/home/home.do)分析已知活性的多肽序列与设计的多肽序列的二级结构的相似度，结合其它物理化学参数预测进行设计序列的修正。[0018]多肽序列送至生物公司合成或利用自动多肽合成仪合成全序列。HPLC检测纯度要大于96%，同时通过质谱检测确定多肽合成质量。样品以冻干状态保存。
[0019]其中，合成后的多肽进行抗癌功能检测筛选，获得具有抗癌活性的多肽序列，试验序号为23号肽，本发明中命名为小肽LTF，其氨基酸序列为Pro Lys He Lys Glu He AlaAla Lys (SEQ ID NO:1)?
[0020]实施例2:利用MTT法检测小肽LTF体外抑癌活性
1.材料与试剂
O小肽LTF，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0021]2) H460细胞(人非小细胞肺癌株系)、MCF7细胞(人乳腺癌细胞株系)、H印G2细胞(人肝癌细胞株系)、HT2细胞(人甲状腺癌细胞株系)，MCFlOA细胞(人正常乳腺上皮细胞株系)，中科院细胞库/中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。
[0022]3) RPMI 1460培养基，美国GIBCO公司产品。
[0023]4) DMEM培养基，为美国HyClone公司产品。
[0024]5)新生小牛血清,为美国HyClone公司产品。
[0025]6) 二甲基亚砜(DMS0)，四甲基偶氮唑(MTT)和胰蛋白酶为Sigma公司产品。
[0026]2.实验
I)用稀释液(无菌PBS或无菌水或者相应的细胞培养基)将小肽LTF稀释至ImM的初始测量浓度，过滤除菌，分装于_20°C冻存。
[0027]2)细胞培养:癌细胞采用肺癌细胞(H460)、乳腺癌细胞(MCF7)、肝癌细胞(HepG2),以及正常乳腺上皮细胞MCF10A。所述各种细胞于含10%小牛血清的RPMI 1640或DMEM培养液中(含100U/ml青霉素和链霉素)培养，细胞每2_3天传代I次；正常细胞于
4-5天传代一次。细胞生长呈80%左右融合状态时，采用胰酶消化的方法分离细胞，用相应的培养基制备单细胞悬液并调整合适的细胞浓度，分瓶传代，置37°C 5%C02的湿化环境中培养。
[0028]3)细胞已贴壁后，弃去孔中原培养基，实验组分别加入含有梯度稀释(在初始浓度基础上以10倍体积稀释)肽的IOOul培养基。阴性对照组加入含有同等浓度稀释液的同体积培养基，37°c 5%C02的湿化环境中培养72小时。
[0029]4)显微镜下观察细胞生产状态，然后每孔加入20ul (5mg/ml)MTT溶液。培养4小时。
[0030]5)小心吸尽孔中液体，每孔加入150ul，DMSO,置于WD-9405B型水平摇床轻摇IOmin ；以便紫色结晶充分溶解于DMSO中。
[0031]6)使用Model680酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值,记录数据。
[0032]7)利用sigmaplotlO和excel软件分析处理数据。
[0033]结果显示，小肽LTF在小于ImM浓度下能抑制肺癌、肝癌、乳腺癌细胞株的生长，抑制效果浓度与浓度相关，结果见附图中图1至3。同时，同等浓度下人正常MCF10A细胞无明显抑制，结果见图4。
[0034]本发明的小肽LTF序列具有的对肿瘤细胞的选择性杀伤能力使其可以直接用于制备癌症治疗的临床药物，或者开发为联合化疗的临床药物使用，有较好的应用前景。
[0035]实施例3:NF- K B/p65S536D抑制小鼠移植瘤生长实验用小鼠为4-6周龄的裸鼠。用荧光素酶标记的HCTl 16细胞(IxlO7细胞/注射)与等体积基底膜基质蛋白(Matrigel basement membrane matrix) (BD Biosciences, NJ)混合，皮下注射到4-6周龄的裸鼠(Harlan实验室，Madison, WI)。形成明显肿瘤后,动物随机分组。分别经腹腔内注射小肽LTF (250，500及1000 uM)或生理盐水，每隔日一次。在不同的时间节点，测量肿瘤体积。其方法是用150mg/kg D-突光素(D-luciferin, Goldbiotechnology, MO)腹腔给药,用体内生物发光法成像并定量(Caliper lifesciences,MA)。注射小肽LTF (1.0 mM)或生理盐水的结果如图5的示，表明所述小肽LTF能够抑制小鼠乳腺移植瘤生长。`
【权利要求】
1.一种可用于抗癌治疗的小肽LTF，其特征在于，所述抗肿瘤小肽LTF为九肽，其所示序列为:SEQ ID N0.1。
2.一种编码权利要求1所述的小肽LTF的核苷酸。
3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，其序列如SEQID N0.2所示。
4.如权利要求1所述的小肽LTF、或权利要求2至3任一项所述的核苷酸在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用。
5.如权利要求1所述的小肽LTF、或权利要求2至3任一项所述的核苷酸在制备抗肿瘤的药物中的应用。
6.如权利要求1所述的小肽LTF、或权利要求2至3任一项所述的核苷酸在制备预防癌症的保健食品中的应用。
7.如权利要求1所述的小肽LTF的制备方法，其特征在于，采用固相合成法制备小肽LTF。
8.如权利要求1所述的小肽LTF的制备方法，其特征在于，采用基因重组方法合成。
9.如权利要求8所述的小肽LTF的制备方法，其特征在于，将权利要求2所述的核苷酸通过载体或直接注射入需要转入基因的生物体内，再通过翻译表达获得所述小肽LTF。
10.如权利要求9所述的小肽LTF的制备方法，其特征在于，将权利要求2所述的核苷酸重组入重组表达载体中，转化微生物，筛选阳性克隆后，再通过诱导表达获得所述小肽LTF。
【文档编号】C12N15/12GK103613644SQ201310669173
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】祝跃球 申请人:湖南莱拓福生物科技有限公司