一种含绿色荧光蛋白报告基因的植物表达载体及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种含有绿色荧光蛋白报告基因植物表达载体的构建。该方法以pRI-AN-101载体为骨架载体，首先利用PCR技术从pCXGFP-P载体上扩增GFP基因全长序列，然后将GFP基因全长正向序列插入pRI-AN-101载体，得到重组载体pRI-AN-101-GFP。然后对GFP基因全长序列中的NdeⅠ识别位点进行定点突变，使得NdeⅠ在构建植物表达载体时可用于双酶切，最终获得了含GFP基因的植物表达载体，命名为pRI101-GFP。该载体含有的绿色荧光蛋白报告基因可以快速方便的鉴定转基因植株。
【专利说明】一种含绿色荧光蛋白报告基因的植物表达载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程【技术领域】，特别涉及一种适合双子叶植物遗传转化的植物表达载体。
【背景技术】
[0002]植物表达载体是植物基因工程研究的重要组成部分。它是携带目的基因进入宿主细胞并进行扩增和表达的重要媒介。通过植物表达载体,外源目的基因可进入宿主细胞并高效表达，为阐明新基因的功能和利用基因资源改良植物性状奠定了基础。因此，获得稳定、高效的植物表达载体是进行遗传转化的重要前提。
[0003]将外源基因导入植物体后，对转基因植株的鉴定是关键的一步。常用的鉴定转基因植株的方法是对转基因材料进行PCR, PCR即聚合酶链式反应(polymer as chainReaction)，是在体外对特定的DNA顺序进行扩增。将少量的扩增产物和分子标记(Markers)进行琼脂糖凝胶电泳，经溴酚蓝染色，在紫外光下观察，不同转化受体是否出现目的基因片段。具有目的基因片段的植株为转基因植株，未扩增出目的基因的为非转基因植株。PCR鉴定转基因植株的方法虽然简单，但是这个过程耗时较长，且步骤繁琐，可能会做很多无用功。因此，探索一种在遗传转化早期就可以鉴定出转基因植株的方法显得尤为重要。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是:构建一种简便快速鉴定转基因植株的植物表达载体，解决转基因植株鉴定困 难的问题。
[0005]本发明所提供的含绿色荧光蛋白报告基因的植物表达载体，是以pR1-AN-101载体为骨架载体，将GFP基因插入pR1-AN-101载体，得到重组载体pR1-AN-101-GFP，然后对GFP基因的Nde I识别位点进行定点突变，得到含GFP基因的植物表达载体，命名为pRI101-GFP。
[0006]本发明所提供的含绿色荧光蛋白报告基因的植物表达载体的构建方法，包含以下步骤:
[0007]1.GFP基因的获得:以pCXGFP-P载体质粒为模板，以SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物进行PCR扩增，得到GFP基因全长序列；
[0008]2.将GFP基因插入质粒pGM-T中，得重组质粒pGM-GFP ；
[0009]3.用EcoR I和SacI分别对pGM_GFP和pR1-AN-101载体进行双酶切，将二者连接，得到重组载体pR1-AN-101-GFP ；
[0010]4.以重组载体pR1-AN-101-GFP为模板，以SEQ ID NO:4所示的Nde I识别位定点突变第一条引物和SEQ ID NO:5所示的Nde I识别位定点突变第二条引物作为引物，进行PCR扩增，得到突变载体pRI 101-GFP。[0011 ] 绿色突光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)是一种可以发出绿色突光的物质。GFP作为报告基因的优点:荧光产生不需要添加任何底物或辅助因子；相对分子质量小，对细胞无毒害；检测方便，可直接用于活体检测；无种属特异性及细胞种类和位置的限制；灵敏度高，不受假阳性干扰；可制成永久标本。但GFP也有在酸性环境下容易发生荧光淬灭，光漂白以及GFP生色团的形成对温度敏感等缺点。因为GFP基因自身含有Nde I酶切位点，故将GFP基因作为报告基因导入植物表达载体pR1-AN-101中后，用双酶切法构建植物表达载体时，Nde I酶切位点不能使用。然而Nde I酶切位点在多数植物表达载体中不存在，并且该酶常见，经济实惠，在植物表达载体pR1-AN-101中用该酶切位点可以保留AtADH5’UTR (如图1所示)，对目的基因的表达有一定的好处。因此为了使用Nde I酶切位点，本发明对GFP基因自身的Nde I酶切位点进行了基因的定点突变。
[0012]本发明所构建的植物表达载体pRI101-GFP具有下列优点: [0013]1.能够简便快速的鉴定转基因植株；
[0014]2.可以活体鉴定转基因植株；
[0015]3.解决了 Nde I酶切位点在用双酶切的方法构建含绿色荧光蛋白基因植物表达载体时出现的问题，扩展了该植物表达载体的应用范围。
[0016]4.本发明的植物表达载体可以应用于双子叶植物遗传转化中。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是植物表达载体pR1-AN-101的部分序列。
[0018]图2是GFP基因的电泳图。
[0019]图3是pGM-GFP和pR1-AN-101载体双酶切结果电泳图。
[0020]图4是pR1-AN-101-GFP重组载体的双酶切验证。
[0021]图5是NdeI酶切位点定点突变引物设计。
[0022]图6是大引物扩增结果。
[0023]图7是突变质粒质粒电泳检测结果。
[0024]图8是pR1-AN-101-GFP载体的Nde I识别位点的定点突变。
[0025]图9是山植NAC domain基因全长序列的犾得。
[0026]图10是pGM-NAC domain和pRI101-GFP载体双酶切结果电泳图。
[0027]图11是pRIl01-GFP-NAC domain重组载体的双酶切验证。
【具体实施方式】
[0028]实验中所用的各种试剂主要是实验室保存的和从商业渠道购买，载体pRNA1-BKIK pRI201-AN_GUS、pCXSN 和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105为本实验室保存。大肠杆菌(Escherichia coli )感受态T0P10和DH5 a分别购自北京天根(TiANGEN)生物技术有限公司和大连宝生物工程有限公司。克隆载体pGM-T试剂盒购自北京天根生物技术有限公司。IOObp DNA Marker、质粒小提中量试剂盒及DNA凝胶回收试剂盒购自 AXYGEN 公司。dNTPs，ExTaq DNA 聚合酶、PrimcSTAR? GXL DNA Polymerase、Dpn 1、限制性内切酶Kpn I ,Nde I ,EcoR I和Sac I购自大连宝生物工程有限公司。T4DNA连接酶、限制性内切酶Xcm I购自NEB公司。核酸测序均由华大基因公司完成。所用的引物均由大连宝生物工程有限公司合成。实验中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0029]实施例1 一种含绿色突光蛋白报告基因的植物表达载体的构建
[0030]一、GFP基因全长序列的获得
[0031]1.设计GFP基因全长序列扩增引物
[0032]在NCBI上获取pCXGFP-P载体全长序列，根据pCXGFP-P载体序列设计扩增TA克隆位点的引物，5’端引入EcoR I酶切位点，3’端引入SacI酶切位点，预期的扩增片段长度约为700bp。经设计，GFP基因序列全长扩增的上游引物如SEQ ID NOl所示，GFP基因序列全长扩增的下游引物如SEQ ID N02所示。
[0033]GFP 基因序列全长扩增的上游引物:5，-CGAATTCATGGGTAAAGGAGAAGAA-3，
[0034]GFP 基因序列全长扩增的下游引物:5’ -CGAGCTCTCATTTGTATAGTTCATC-3，
[0035]2.扩增GFP基因序列全长
[0036]用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2从pCXGFP-P质粒载体中扩增出I条长度约为700bp的片段(扩增结果如图2)。从凝胶中回收特异性条带并与pGM-T载体重组，然后转化大肠杆菌感受态细胞T0P10并进行蓝白斑筛选。随机挑取6个白色单菌落进行PCR鉴定，均扩增出约700bp的特异性谱带。
[0037]3.验证扩增GFP基因序列全长的正确性
[0038]3个单菌落的测序结果显示扩增片段长度为702bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，与预期的完全一致。将插入了 GFP基因的重组质粒命名为pGM-GFP。
[0039]二、构建含GFP基因序列全长的重组载体pR1-AN-101-GFP
[0040]将pGM-GFP和pR1-AN-101载体分别用EcoR I和SacI进行双酶切，凝胶电泳后分别回收pR1-AN-101的大片段(电泳结果如图3，1，2，3泳道)和pGM-GFP的小片段(电泳结果如图3，4，5，6泳道)。
[0041]用T4连接酶将pGM-GFP的小片段与pR1-AN-101的大片段相连，然后转化大肠杆菌感受态细胞DH5 a。
[0042]利用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2对随机挑取的4个单菌落进行PCR验证，结果4个均扩增出约700bp的目的条带。从这4个菌落中提取质粒，用EcoR I和SacI对提取的质粒进行双酶切，结果4个菌落提取的质粒均酶切出约700bp的片段(电泳结果如图4)，初步判断构建载体成功。将提取的质粒进行测序，结果显示GFP基因全长序列已经成功被插入到pR1-AN-101载体中，将重组后的植物表达载体命名为pR1-AN-101-GFP。
[0043]三、获得突变载体pRI101-GFP
[0044]1.NdeI酶切位点定点突变引物的设计
[0045]根据GFP基因序列全长，找到NdeI酶切位点，设计一对突变引物，将NdeI酶识别位点突变掉，但是不改变其所翻译的氨基酸序列，进而使该位点不能再被NdeI酶识别(如图5所示)。
[0046]根据快速PCR定点突变引物的设计原则:正反向引物要在目标突变区域重合，正反向引物是完全反向互补的，且长度应在25bp到45bp之间，35bp最好,设计一对突变引物。Nde I识别位定点突变第一条引物的序列如SEQ ID N04所示，Nde I识别位定点突变第二条引物的序列如SEQ ID N05所示。
[0047]Nde I 识别位定点突变第一条弓丨物:5’ -CAAGATACCCAGATCACATGAAACGGCATGACT-3’Nde I 识别位定点突变第二条引物:5’ -AGTCATGCCGTTTCATGTGATCTGGGTATCTTG-3
[0048]2.突变质粒的获得
[0049]以第二)步骤中获得的pR1-AN-101-GFP重组质粒DNA为模板，在高保真酶Prime STAR? GXL DNA Polymerase 的作用下，用引物 SEQ ID NO:4 (Nde I 识别位定点突变第一条引物)和SEQ ID NO:5 (Nde I识别位定点突变第二条引物)进行扩增，得到大片段的单一 PCR产物(电泳如图6，其中I泳道为负对照，2和3泳道为所得单一的PCR产物)。
[0050]突变PCR体系为:
[0051]
【权利要求】
1.一种含绿色荧光蛋白报告基因的植物表达载体，其特征在于:所述的植物表达载体是以PR1-AN-1Ol载体为骨架载体，将GFP基因插入pR1-AN-101载体，得到重组载体pR1-AN-101-GFP，然后对GFP基因的Nde I识别位点进行定点突变，得到含GFP基因的植物表达载体，命名为pRI 101-GFP。
2.—种权利要求1所述的含绿色荧光蛋白报告基因的植物表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤: (1)GFP基因的获得； (2)将GFP基因插入质粒pGM-T中，得重组质粒pGM-GFP； (3)用EcoRI和SacI分别对pGM_GFP和pR1-AN-101载体进行双酶切，将二者连接得到重组载体pR1-AN-101-GFP ； (4)以重组载体pR1-AN-101-GFP为模板，以SEQID NO:4所示的Nde I识别位定点突变第一条引物和SEQ ID NO:5所示的Nde I识别位定点突变第二条引物作为引物，进行PCR扩增，得到突变载体pRI 101-GFP。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于:步骤(1)GFP基因的获得方法如下:以pCXGFP-P载体质粒为模板，以SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物进行PCR扩增，得到GFP基因全长序列。
4.权利要求1所述的含绿色荧光蛋白报告基因的植物表达载体在双子叶植物遗传转化中的应用。
5.含山楂NACdomain基 因的pRI101-GFP植物表达载体的构建，其特征在于包括以下步骤: (1)山楂NACdomain基因的获得； (2)将山楂NACdomain基因插入质粒pGM_T中，得重组质粒pGM-NAC domain ； (3 )用Nde I和Kpn I分别对重组质粒pGM_NAC domain和权利要求1所述的pRIIOl-GFP载体进行双酶切，将二者连接，得到含山楂NAC domain基因序列全长的植物表达载体 pRI 101-GFP-NAC domain。
【文档编号】C12N15/65GK103627724SQ201310669160
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月7日 优先权日:2013年12月7日
【发明者】张志宏, 韩国粉, 田义, 代红艳, 马跃, 从佩华, 李贺, 刘月学, 李晓明 申请人:沈阳农业大学