甘蔗梢腐病病原菌小种gx1的分子检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种甘蔗梢腐病病原菌（Fusarium?moniliforme）小种gx1的分子检测方法，包括引物和探针设计、提取甘蔗梢腐病病原菌小种gx1的DNA、建立qPCR检测的反应体系、qPCR检测的反应程序和qPCR检测结果。本发明采用Taqman探针的实时定量PCR检测方法，具有灵敏度高，特异性好，所需要的DNA用量少的特点，较常规半定量PCR检测的灵敏度高1,000倍，可以直接从甘蔗发病的叶片中检测到病原菌，减少了病原菌的分离、纯化和培养过程，可用于田间对甘蔗梢腐病病原菌小种gx1诊断及检测，节省时间和经费。
【专利说明】甘蔗梢腐病病原菌小种gxl的分子检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物病害的检测方法，具体涉及一种甘蔗梢腐病病原菌(Fusarium moniliforme)小种gxl的分子检测方法,属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]镰刀菌属(Fusarium)最早由Link(1809)发现的粉红镰刀菌(F.roseum),并以此为基础而建立的属内分类。镰刀菌属的种类繁多，据Dictionary of Fungi记载,至今已报道的镰刀菌超过500种。镰刀菌属是农作物及经济作物的最重要病原真菌之一，是一种最为常见的寄生病原菌，严重影响谷类植物的生长及粮食生产。而且镰刀菌在植物的寄主范围很广，可侵染大多数植物并造成毁灭性的病害，如引起香蕉萎蔫病的尖孢镰刀菌(F.0xysporum)、水稻恶苗病和甘鹿梢腐病的串珠镰刀菌(F.moniliforme)、小麦赤腐病的禾谷镰刀菌(F.graminearum)、玉米根腐病的梨孢镰刀菌(F.poae)、豆科和瓜类植物根莖腐烂的茄类镰刀菌(F.solani)等。镰刀菌不但会造成作物严重的减产和损失，而且可产生多种次生代谢产物的真菌毒素，如伏马菌素与AAL毒素等具有很强的毒性，能杀死植物细胞核；或富集于粮食的谷粒或种子内，食用后能引发人及家畜肝脏、肾脏的衰竭和癌变(Roche,2010)。
[0003]甘蔗是重要的糖料作物和理想的能源作物，在甘蔗种植中长期受到真菌性病害的影响，其中镰刀菌是甘蔗真菌性病害中最为严重的病原之一，镰刀菌属所引起的甘蔗梢腐病，主要流行于亚热带和东南亚沿海甘鹿种植区，爆发于高温雨季时期(Viswanathan等，2006)。近年来，该病呈逐渐加重趋势。Hsuan基于形态学和DNA的翻译延伸因子l-α (TEF-1a )基因对甘蔗、玉米和水稻上寄生镰刀菌菌株进行初步鉴别和分类，得到包括 F.sacchari, F.moniliforme, F.proliferatum, F.andiyazi, F.verticillioides,
G.moniliforme等多个种类的镰刀菌,提出由于寄主的差异,可能对镰刀菌种类要进行新的分类，而不能仅依据形态学鉴定的假说(Shuan等，2010 )。
[0004]目前通过对中国大陆甘蔗各产区的梢腐病调查采样及病原菌的生物地理学研究，对所有采集样品的病原菌分离培养，经形态学鉴定和分子生物学鉴定，以ITS序列聚类分析，初步鉴定中国大陆甘鹿梢腐病病原主要是单一种类镰刀菌F.moniliforme,但有两个小种(gxl和gx2),其中gxl为优势小种。如何对中国甘鹿梢腐病原优势小种gxl进行快速的分类鉴定，不论对植物病理的基础研究还是甘蔗病害防治的应用研究都具有十分重要的现实意义。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种甘鹿梢腐病病原菌(Fusarium moniliforme)小种gxl的分子检测方法。所述甘蔗梢腐病病原菌小种gxl，指引起我国甘蔗梢腐病的优势小种，并具有以下特定的核苷酸序列:
[0006]GACGATTACCAGTAACGAGGGTTTTACTACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGACCGCCAATCAATTTGGGGAACGCGATTTGACTCGCGAGTCCCAACACCAAGCTGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACA。
[0007]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下:
[0008]本发明的甘蔗梢腐病病原菌小种gxl的分子检测方法，首先是依据gxl小种的测序ITS序列，设计用于实时定量PCR的若干引物和Taqman探针组合FAM-gxl以及用于常规半定量PCR的若干引物对Pgxl。
[0009]一种利用分子检测方法检测甘蔗梢腐病病原菌小种gxl的引物和探针组合FAM-gxl，其特征在于所述引物和探针组合为下列6个组合中的I个组合；6个引物探针组合如下:
[0010]FAM-gxl 第 I 组:
[0011]引物:FAM-gxl-Fl:5，-CCTGATCCGAGGTCAACATTC-3’
[0012]FAM-gxl-Rl:5’ -TCGAGCTTCCATAGCGTAGTA-3’
[0013]探针:FAM-gxl-Pl:5’ -CATGGCCGCGACGATTACCAGTAA-3’ ；
[0014]FAM-gxl 第 2 组:
[0015]引物:FAM-gxl-F2:5’ -TGCTTAAGTTCAGCGGGTATT-3’
[0016]FAM-gxl-R2:5， -GTCACGTCGAGCTTCCATAG-3’
[0017]探针:FAM-gxl-P2:5’ -CATGGCCGCGACGATTACCAGTAA-3’ ；
[0018]FAM-gxl 第 3 组:
[0019]引物:FAM-gxl-F3:5’ -CGATTACCAGTAACGAGGGTTT-3’
[0020]FAM-gxl-R3:5， -CCTGTTCGAGCGTCATTTCA-3’
[0021]探针:FAM-gxl-P3:5’ -TACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGA-3’ ；FAM-gxl 第 4 组:
[0022]引物:FAM-gx1-F4:5，-CTGTTCGAGCGTCATTTCAAC-3 ’
[0023]FAM-gx1-R4:5’ -GACGATTACCAGTAACGAGGG-3，
[0024]探针:FAM-gxl-P4:5，-CGCGAGTCCCAACACCAAGC-3，；
[0025]FAM-gxl 第 5 组:
[0026]引物:FAM-gxl-F5:5，-CGCAATGTGCGTTCAAAGAT-3，
[0027]FAM-gx1-R5:5’ -ACAACGGATCTCTTGGTTCTG-3’
[0028]探针:FAM-gx1-P5:5，-TTTGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3，；
[0029]FAM-gxl 第 6 组:
[0030]引物:FAM-gx1-F6:5 ’ -TGGGCTTGAGGGTTGAAATG-3 ’
[0031]FAM-gx1-R6:5， -TCGATGAAGAACGCAGCAAA-3，
[0032]探针:FAM-gxl-P6:5，-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCC-3，。
[0033]上述Taqman探针的5’端、3’端分别用FAM报导荧光染料和BHQ-1淬灭基团标记。
[0034]所述6个引物探针组合中，FAM - gxl第四组为最佳。
[0035]使用本发明的引物探针组合检测甘蔗梢腐病病原菌小种gxl的方法，包括提取甘蔗梢腐病病原菌小种gxl的DNA、建立qPCR检测的反应体系、qPCR检测的反应程序、定量qPCR检测，其特征在于:
[0036](I)提取甘蔗梢腐病病原菌小种gxl的DNA:采集甘蔗梢腐病样品，经分离纯化培养病原菌的样品提取病原菌DNA ;或直接提取病建交界处的叶片DNA。
[0037](2)建立qPCR检测的反应体系:qPCR检测的反应体系为1/10体积的10倍PCR反应缓冲液；dNTP各0.1~0.5mmol/L ；Taq DNA聚合酶0.1~5国际单位；Taqman探针0.1~0.5mmol/L ;分离纯化的DNA模板液0.1~5 μ 1，；一个组合的引物和探针，各0.1~2nmol/L ;加无菌去离子水使总体积达到10~100 μ I ；
[0038](3) qPCR检测的反应程序:qPCR检测的反应程序为:90_100 V 30_60s ；90-100°C 5-30s, 50-70°C 20_90s，20~50个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测，荧光模式设为FAM;
[0039](4) qPCR检测结果:qPCR检测结果Ct值为0，表示样品未检出甘蔗梢腐病病原菌小种gxl °
[0040]为了确保参试菌株为甘蔗梢腐病菌病原菌小种gxl，本发明通过ITS - PCR方法对所采集的样品进行了病原菌小种gxl鉴定。
[0041](I)常规半定量PCR检测鉴定方法:在本发明的常规半定量PCR检测的引物(Pgxl)为下述五个引物组合中的I个组:
[0042]Pgxl 第一组:
[0043]Pgxl-fl:5，-CGATTACCAGTAACGAGGGTTT-3，
[0044]Pgxl-rl:5，-GGAGGGATCATTACCGAGTTTAC-3，
[0045]Pgxl 第二组:
[0046]Pgx1-f2:5’ -TGCTTAAGTTCAGCGGGTATT-3’
[0047]Pgx1-r2:5， -ACAACGGATCTCTTGGTTCTG-3，
[0048]Pgxl 第三组:
[0049]Pgx1-f3:5， -CTGATCCGAGGTCAACATTCAG-3’
[0050]Pgx1-r3:5， -ACCTGCGGAGGGATCATTA-3’
[0051]Pgxl 第四组:
[0052]Pgx1-f4:5’ -TTCAGCGGGTATTCCTACCT-3’
[0053]Pgx1-r4:5，-CCTGTTCGAGCGTCATTTCA-3’
[0054]Pgxl 第五组:
[0055]Pgx1-f5:5’ -TATTCCTACCTGATCCGAGGTC-3’
[0056]Pgxl-r5:5， -TCGATGAAGAACGCAGCAA-3，。
[0057]在本发明的一个优选实施方案中，所述常规半定量PCR检测的反应体系为:1/10体积的10倍PCR反应缓冲液；dNTP各0.1~0.5mmol/L ；Taq DNA聚合酶0.1~5国际单位；分离纯化的DNA模板液0.1~5 μ I ；DNA引物I对,各0.1~2nmol/L ;加无菌去离子水使总体积达到10~100 μ I。
[0058]在本发明的一个优选实施方案中，所述常规半定量PCR检测的反应程序为:90~98 V 1-1Omin ；90 ~98 V 5_60s，58 ~68 V 10_60s，68 ~74 V 30_180s，20-50 个循环；68-76V 2-18min，PCR产物用0.5-2.5%琼脂糖电泳检测。
[0059]本发明的方法以gxl小种的ITS序列易变异区设计特异引物和TanMan探针组合(FAM-gxl)和常规半定量PCR引物对(Pgxl )，通过qPCR技术和常规半定量PCR技术可实现对F.moniIiforme小种gxl的快速定量检测和小种的准确鉴定。
[0060]本发明的优点和有益之处在于:本发明的甘蔗梢腐病病原菌小种gxl的分子检测方法，具有灵敏度高，特异性好，所需要的DNA用量少的特点，采用Taqman探针的实时定量PCR检测方法比特异引物的常规半定量PCR检测的灵敏度高1，OOO倍。实时定量PCR不仅可以检测从叶片中分离的病原菌DNA，而且可以直接从甘蔗发病的叶片中检测到病原菌，减少了病原菌的分离、纯化和培养过程，可用于田间对甘蔗梢腐病病原菌小种gxl诊断及检测，节省时间和经费。
【专利附图】
【附图说明】:
[0061]图1为不同稀释浓度的真菌DNA的qPCR反应扩增曲线，横坐标代表循环数Ct值，纵坐标代表荧光吸收值。
[0062]图2真菌DNA浓度与Ct值的关系，横坐标(X)代表循环数Ct值，纵坐标⑴代表DNA 浓度。Ygxl=-0.28x+7.5476 (R2=0.9986)
[0063]图3常规半定量PCR的检测。M为DNA分子量；1表示1000pg/ μ I ；2表示IOOpg/μ I ;3 表示 IOpg/ μ I ;4 表示 Ipg/ μ I ;5 表示 0.1pg/ μ I ;6 表示 0.01pg/ μ I ;7 表示0.0Olpg/μ I ；CK 为对照 Opg/μ I。
【具体实施方式】:
[0064]以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0065]实施例1:供试菌株的分离和培养
[0066]甘蔗梢腐病病原菌F.moniIiforme菌株于2013年甘蔗梢腐病发病盛期在广西、云南、广东和福建等9个市(区)县的甘蔗种植区采集典型发病的甘蔗梢腐病病梢(如表1所示)，采用PDA培养基进行分离培养。采取田间发病植株上的典型病斑，进行病原菌的分离培养，具体程序如下:取病健交界处(病斑与健康部分的交界处)的植株组织，剪成边长为
0.5cm大小的方块,在70%的酒精溶液中浸泡10秒钟,而后0.1%升萊中灭菌40秒,最后无菌水冲洗三次，置于灭菌滤纸上自然晾干`，接于含氨苄青霉素100μ g/ml的PDA培养基上，24-30°C倒置培养3-4天。菌丝长出后进行划线纯化培养，倒置培养2-3天后，挑取萌发的单菌落菌丝体再次划线纯化培养，纯化三代。采用无菌水稀释和水琼脂培养相结合的方法分离单孢，用弯曲的无菌玻璃棒将其均匀的涂抹在含有氨苄青霉素100 μ g/ml的水琼脂培养基上，倒置培养2-3天后，挑取单个孢子在含有含链霉素100 μ g/ml的查氏液体培养基中，于24-30°C下进行振荡培养，振荡速度为250r/min，该方法用于制备甘蔗梢腐病病原菌的菌丝体。
[0067]实施例2:病原菌DNA的提取
[0068]利用离心方法收集实施例1的菌体，即将菌液置于IOml的离心管中，4°C，
13,OOOrpm,离心15min，去上清液后，将沉淀的菌体置于无菌超净工作台吹干。然后，对采用SDS法提取菌丝体的基因组DNA，首先，将离心收集多得到的菌丝体置于研钵，加入液氮并研磨成粉末，转移到1.5ml eppendorf管；其次,加入DNA提取液和等体积的酹、氯仿、异戊醇(25:24:1)混合液，剧烈涡旋5min，离心收集上清液。最后，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),倒换数次充分混匀,4°C, 11，OOOrpm,离心5min,取上清液至新的离心管中。重新抽提一次后(以便除去杂质，提高纯化效率)，吸取上清液至新的离心管中，加入两倍体积预冷的无水乙醇(_20°C)，_20°C冰箱放置30min左右。取出后12，OOOrpm,离心12min，于浓缩冷冻离心干燥仪上干燥，然后加入Rnase水溶液，37°C水浴消化I小时，(除去RNA杂质)。琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增判断所提DNA质量后，-20°C保存备用。调整甘蔗梢腐病病原菌gxl小种的代表菌株CNO-1的样品DNA的终浓度为1000 μ g/ml。
[0069]实施例3:病原菌的引物和探针的设计
[0070]通过ITS-PCR方法对上述采集样品所携带的甘蔗梢腐病菌进行鉴定，以 ITS 真菌通用引物 ITS1/ITS4(ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ；ITS4:5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增ITS序列。PCR反应所采用的Taq酶购自大连宝生(TaKaRa)，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应总体积分别为25 μ I内含 10 X Buffer (含 15mmol/L MgCl2) 2.5 μ 1，dNTPs (10mmol/L) 0.5 μ 1，Taq 酶 IU，引物(10 μ mol/L)各 1.0 μ 1,40ng 模板 DNA。
[0071]ITS-PCR反应程序为:
[0072]94°C 预变性 5min ；
[0073]
【权利要求】
1.一种利用分子检测方法检测甘蔗梢腐病病原菌小种gxl的引物和探针组合FAM-gxl，其特征在于所述引物和探针组合为下列6个组合中的I个组合:
2.一种根据权利要求1所述的引物探针组检测甘蔗梢腐病病原菌小种gxl的方法，包括提取甘蔗梢腐病病原菌小种gxl的DNA、建立qPCR检测的反应体系、qPCR检测的反应程序、定量qPCR检测，其特征在于步骤如下: (1)提取甘蔗梢腐病病原菌小种gxl的DNA:采集甘蔗梢腐病样品，经分离纯化培养病原菌的样品提取病原菌DNA ;或直接提取病建交界处的叶片DNA ； (2)建立qPCR检测的反应体系:qPCR检测的反应体系为1/10体积的10倍PCR反应缓冲液；dNTP各0.1~0.5mmol/L ；Taq DNA聚合酶0.1~5国际单位；Taqman探针0.1~.0.5mmol/L;分离纯化的DNA模板液0.1~5μ 1，；一个组合的引物和探针，各0.1~2nmol/L ;加无菌去离子水使总体积达到10~100μ I ; (3)qPCR检测的反应程序:qPCR检测的反应程序为:90-100 V 30_60s ；.90-100°C 5-30s, 50-70°C 20_90s，20~50个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测，荧光模式设为FAM;(4)qPCR检测结果:qPCR检测结果Ct值为 O，表示样品未检出甘蔗梢腐病病原菌小种
gxl。
【文档编号】C12N15/11GK103882109SQ201310680156
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】张木清, 林镇越 申请人:广西大学