拟南芥MYB家族转录因子AtMYB17基因、编码序列及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，具体为拟南芥MYB家族转录因子AtMYB17基因、编码序列及其应用。具体包括基因AtMYB17的克隆、含有该基因的表达载体构建、基因AtMYB17基因器官表达模式，不同激素、不同胁迫处理后AtMYB17的表达量的变化。本发明还公开了基因AtMYB17在拟南芥中过表达后，可以改变拟南芥对盐敏感程度。该基因AtMYB17可用于植物品种改良。
【专利说明】拟南芥MYB家族转录因子/1故防/7基因、编码序列及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种在拟南芥中表达的MYB家族转录因子AtMYB17基因编码序列及其应用。具体包括:MYB家族转录因子基因的核苷酸编码序列和启动子序列的克隆，表达载体的构建，对拟南芥此基因内源的不同器官、组织的空间表达模式，高低温、PEG、高盐胁迫以及植物激素处理后的表达模式变化进行分析鉴定，以及转化此基因于拟南芥内，进行分子鉴定和胁迫实验，检测其基因表达量变化及抗性改变等。
【背景技术】
[0002]MYB是植物转录因子中最大的家族之一，大多数植物的MY B以在其N端含有一段约51-52个氨基组成的MYB结构域为共同特征，MYB蛋白的分类主要是根据这个高度保守的DNA结合结构域，这个结构域通常是由至多4个氨基酸残基序列的重复(R)组成，每一个都形成3个α -螺旋，每一个重复的第二个和第三个螺旋形成一个带有3个有规律的间隔色氨酸残基(或疏水的)的螺旋一转角一螺旋(HTH)结构，形成一个3 D (HTH)疏水核心结构，对维持HTH的构型有极为重要的意义。
[0003]MYB基因家族在不同的物种中存在结构和序列上的差异，甚至同一物种中的MYB家族也发生了多个分支。杨树与陆地棉水稻和拟南芥的部分MYB序列高度同源，但是拟南芥的MYB家族序列却发生很大的变化，产生多个分支，具有了多样的功能。根据相邻的MYB结构域的数目MYB转录因子可简单分成4个亚类，包括只含有一个R结构域的，R2R3结构域的，R1R2R3结构域的，四个类似R1/R2结构域的。
[0004]MYB转录因子的生物学功能很广泛，MYB在拟南芥中已经有很多报道。主要集中于次生代谢调节、抗逆性的研究等 ，具有广泛的转录调节作用。主要包括，植物初生和次生代谢的调控；控制细胞的成长和分化；调控植物体对生物和非生物胁迫反应；参与植物生长过程的信号转导。大多数MYB转录因子是基因表达的正调控因子，但是也有一部分是负调控因子。目前除了拟南芥，大豆、棉花、玉米、栽培稻、矮牵牛、葡萄、白杨和苹果中都有报导MYB家族转录因子的功能。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提出一种新的拟南芥基因，还提供该拟南芥基因的蛋白编码序列，并提供该拟南芥基因的应用。
[0006]本发明通过克隆拟南芥中MYB家族转录因子基因沒77，对其时空表达模式及胁迫响应方式进行确定，结果显示该基因在花和果荚中高表达，在根、茎、叶中表达量较低。AtMYB17的表达在GA、ABA、ACC、NAA处理后变化不明显。盐胁迫处理3、6、12h后，AtMYB17的表达量上升；在PEG、高温处理后的表达量并没有变化，在冷处理I天后表达量反而有所下调。将转入拟南芥后，观察到转基因株系对盐胁迫敏感性下降，该结果表明基因在盐胁迫的适应过程中起作用，这为研究拟南芥非生物胁迫响应打下基础，从而为通过提高拟南芥的胁迫耐受性，进而提高农作物的非生物胁迫抗性并最终实现产量提高提供基因来源与技术支持。
[0007]本发明首先从拟南芥中克隆出一种新的MYB家族转录因子基因，命名为J tMYBl 7 ；为具有特定序列的DNA分子，其中基因组长1737bp，核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。
[0008]本发明还提供这种拟南芥蛋白编码序列，该序列编码299个氨基酸残基，分子量33.288kDa，等电点为6.757，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。
[0009]本发明还提供用于调取获得拟南芥样品中基因的一对核苷酸引物。该引物根据基因设计，使用此对引物对拟南芥样品基因组DNA进行PCR扩增可获得长1.737kbp的基因片段。具体的引物序列为:
Forward Primer:5' AGCTGGAGAACACTTCCTAAAC 3’ (SEQ ID N0.3)
Reverse Primer:5' GGGATCAAGACCCATAGATAAA3’ (SEQ ID N0.4)。
[0010]本发明还提供检测拟南芥基因在不同器官表达模式的方法，即利用所述基因的核苷酸序列作为设计引物的保守区段，调取其序列的引物序列:
Forward Primer:5’AGCACCAGCATCAGCA3’ (SEQ ID N0.5)
Reverse Primer:5’CATTACCTCTCTTTTCCCC3’ (SEQ ID N0.6)。
[0011]对拟南芥cDNA样品进行Real-timePCR，然后检测该基因在花、果荚、茎、叶、根中的表达；样品为拟南芥的RNA经过逆转录后所得cDNA ;其步骤如下:
(1)提取拟南芥各器官的总RNA(Trizol，市售)；
(2)利用反转录试剂盒(市售)`将总RNA反转录成cDNA，根据SEQID N0.1序列，设计SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6引物，进行实时定量PCR检测。
[0012]本发明还提供检测拟南芥基因在高盐、高低温、PEG胁迫以及激素处理下的表达模式变化的方法，即将拟南芥进行高盐、低温、干旱胁迫以及激素处理后，提取拟南芥苗中的RNA;利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID N0.5与SEQ IDN0.6，进行定量PCR检测。其步骤如下:
(1)将两周大的拟南芥苗置于300mM氯化钠溶液中，23°C培养2d以进行高盐胁迫处理；置于水中，4°C培养Id以进行低温处理；置于ΙΟμΜ ΝΑΑ、50μΜ ΑΒΑ、10μΜ ΟΑ,ΙΟμΜ -ACC中，23°(:分别培养241!以进行激素处理；置于309?^6中，23°(:培养2(1以进行干旱胁迫处理；置于水中，23° C培养2d作为对照；
(2)提取前述处理的拟南芥苗的叶和根中的总RNA(Trizol，市售)；
(3)利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA，根据SEQID N0.1序列，设计SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6引物，进行实时定量PCR检测。
[0013]本发明还提供检测转入外源基因的拟南芥与野生型拟南芥对盐胁迫敏感程度改变的方法，其步骤如下:
(1)转基因株系与野生型的种子经70%酒精消毒处理，无菌水清洗，置于无菌操作台晾干后，将种子MS培养基上，同时置于22°C培养室培养；
(2)观察统计每天实验组与对照组的发芽率和生根率情况，并在第6天时，观察并测量转基因株系与野生型株系的株高、最长根长、鲜重、地上部分鲜重以及地下部分鲜重，并分别做比较。
[0014]本发明中，可选用本领域已经知道的各种载体，如市售的载体以及质粒。[0015]可见，本发明提供的拟南芥基因Ji#7S77可用于植物品种改良，如用于改善拟南芥抗低温、干旱胁迫、激素胁迫的等性能，从而应用于拟南芥等农作物，提高其产量。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1拟南芥拟南芥不同器官中的表达谱分析。
[0017]图2不同激素处理后J 7的表达谱分析。
[0018]图3不同胁迫处理条件下的表达谱分析。其中CK为对照，处理后的数字代表处理时间，单位是小时。例如ΑΒΑ3表示ABA处理了 3h。
[0019]图4奶477突变体以及过表达转基因拟南芥的分子鉴定WT为野生型，mybl7为突变体，3#、4#为过表达株系3号和4号。
[0020]图5 WT和奶477突变体在不同浓度NaCl处理下的表型。数字代表浓度，单位是
mMo
[0021]图6 WT和奶突变体在不同浓度NaCl处理下的存活率。数字代表浓度，单位是mM。
[0022]图7 WT和过表达株系在不同浓度NaCl处理下的表型。数字代表浓度，单位是mM。【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如Sambrook 等分子克隆:实验手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。
[0024]实施例1拟南芥基因A tMYBl 7的克隆
1.拟南芥Col生态型在培养室中培养:生长条件为光周期16h /8h (L/D)，22°C。
[0025]2.基因组DNA提取。取100毫克左右新鲜的拟南芥植物组织材料，液氮充分研磨。iJP 600 μ I CTAB提取液，65°C放置25 min。加等体积酚氯仿异戊醇，去蛋白，12000rpm离心IOmin后上清转移至新的离心管,加等体积异丙醇,充分混匀，室温放置10 min, 12000rpm离心IOmin,弃上清,用75%乙醇I ml洗漆沉淀,重复一次。室温干燥5_10 min,溶于100 μ I去离子水中。
[0026]3.基因的克隆。根据NCBI数据库中拟南芥的基因序列设计引物，以拟南芥基因组DNA为模板，进行PCR，获得基因全长，具体序列信息参见SEQ ID N0.1。
[0027]实施例2拟南芥J7基因器官表达模式分析
分别提取拟南芥花、果荚、茎、莲座叶、茎生叶、根等中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6，进行实时荧光定量PCR检测(图1)。结果显示，该基因在花和果荚中表达量最高，茎、叶和根中表达量较少。
[0028]实施例3拟南芥基因价7在高低温、PEG、高盐胁迫以及植物激素处理下的表达模式分析
对两周大的拟南芥幼苗分别进行ΙΟμΜ ΚΤ、10μΜ 6_ΒΑ、10μΜ ΙΑΑ、5μΜ 6Α,50μΜ ΑΒΑ、ΙΟμΜ ΚΤ、100μΜ JA、4°C低温分别处理 24h，10%PEG、200 μ M NaCl 处理 ld、4d，并同无处理的对照组一起，分别提取叶中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6，进行实时荧光定量PCR检测。结果显示，不同激素处理，目标基因7不受ABA、GA、ACC、NAA等激素的诱导(图2)。NaCl处理3h后即被诱导，随后表达量开始下降，24h后，表达量恢复CK水平。低温处理后表达量逐渐下降，PEG和高温处理不影响的表达(图3)。
[0029]实施例4突变体以及过表达转基因拟南芥的分子鉴定
分别提取J四个株系3#、4#、5#、6#以及野生型WT对照组中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8，进行实时荧光定量PCR检测(图4)，结果显示，3#和4#中J?#7沒77基因表达量比野生型明显要高，之后即选用3#和4#两个株系作为实验材料。
[0030]实施例5 WT和奶42 7突变体在不同浓度NaCl处理下的表型
将种子经消毒处理后，播到1/2 MSO平板上，春化2天，待幼苗长到4天后，将廣奶幼苗移栽到含有不同浓度NaCl的1/2 MSO平板上(图5)，14天后拍照，结果显示突变体比野生型耐盐。
[0031]实施例6 WT和奶7突变体在不同浓度NaCl处理下的存活率
将种子经消毒处理后，播到1/2 MSO平板上，春化2天，待幼苗长到4天后，将廣幼苗移栽到含有不同高浓度NaCl的1/2 MSO平板上(图6)，5天后拍照，结果显示突变体比野生型耐盐。
[0032]实施例7转入基因的拟南芥对高NaCl敏感的改变
J价7转基因株系3#和4#`以及野生型WT的种子经消毒液处理，无菌水清洗，置于无菌操作台晾干后，将其转移至添加不同浓度NaCl以及未添加NaCl的MS培养基上，同时置于23°C培养箱培养，14天后拍照；结果显示，转基因过表达3#和4#两个株系的耐盐性情况均比WT高(图7)。
[0033]参考文献
Raffaele, S., et al.(2008) A MYB transcription factor regulatesvery-long-chainfatty acid biosynthesis for activation of the hypersensitivecell death response in Arabidopsis.Plant Cell 20， 752—767
Li, L，et al.(2009) Arabidopsis MYB30 is a direct target of BESl andcooperates with BESl to regulate brassinosteroid-1nduced gene expression.PlantJ 58， 275-286
Cominellij E.，et al.(2005) A guard-cel1-specific MYB transcriptionfactor regu—lates stomatal movements and plant drought tolerance.Curr Biol 15，1196-1200
Seoj P.J.，et al.(2009) The MYB96 transcription factor mediates abscisicacid signaling during drought stress response in Arabidopsis.Plant Physiol151， 275-289
Kirikj V.，et al.(1998) Ectopic expression of a novel MYB gene modifiesthe architecture of the Arabidopsis inflorescence.Plant J 13， 729—742
Agarwalj M.，et al.(2006) A R2R3 type MYB transcription factor is involvedin the cold regulation of CBF genes and in acquired freezing tolerance.J BiolChem 281， 37636-37645
Ding, Z.，et al.(2009) Transgenic expression of MYB15 confers enhancedsensitivity to abscisic acid and improved drought tolerance in Arabidopsisthaliana.J Genet Genomics 36， 17—29
Zhou, J.，et al.(2009) MYB58 and MYB63 are transcriptional activatorsof the lignin biosynthetic pathway during secondary cell wall formation inAra-bidopsis.Plant Cell 21， 248-266
Dubosj C.，et al.(2008) MYBL2 is a new regulator of flavonoid biosynthesisin Arabidopsis thaliana.Plant J 55， 940-953
Jinj H.，et al.(2000) Transcriptional repression by AtMYB4 controlsproduction of UV-protecting sunscreens in Arabidopsis.EMBO J.19， 6150—6161Preston, J.， et al.(2004) AtMYB32 is required for normal pollendevelopment in Arabidopsis thaliana.Plant J.40， 979—995
Nesij N.，et al.(2001) The Arabidopsis TT2 gene encodes an R2R3 MYB domainprotein that acts as a key determinant for proanthocyanidin accumulation indeveloping seed.Plant Cell 13， 2099-2114
Borevitzj J.0., et al.(2000) Activation tagging identifies a conserved MYBregulator of phenylpro panoid biosynthesis.Plant Cell 12， 2383-2394.Gonzalez, A.，et al.(2008) Regulation of the anthocyanin biosyntheticpathway by the TTGl/bHLH/Myb transcriptional complex in Arabidopsis seedlings.Plant J 53， 814-827
Strackej R.，et al.(2007) Differential regulation of closely relatedR2R3-MYB transcription factors controls flavonol accumulation in differentparts of the Arabidopsis thaliana seedling.Plant J 50， 660—677
Mehrtensj F.，et al.(2005) The Arabidopsis transcription factor MYB12 isa flavonol-specific regulator of phenylpropanoid biosynthesis.Plant Physiol138， 1083-1096
Baumann, K.， et al.(2007) Control of cell and petal morphogenesis by R2R3MYB transcription factors.Development 134， 1691-1701
Zhang, Y.，et al.(2009) Characterization of Arabidopsis MYB transcriptionfactor gene AtMYBI7 and its possible regulation by LEAFY and AGL15.J GenetGenomics 36， 99-107
Jakobyj M.J., et al.(2008) Transcriptional profiling of mature Arabidopsistrichomes reveals that NOECK encodes the MIXTA-1ike transcriptional regulatorMYB106.Plant Physiol 148， 1583-1602.。
【权利要求】
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，为从拟南芥中克隆出的基因，记为全长1737bp，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1。
2.一种如权利要求1所述的基因编码的蛋白质分子，其特征在于，该序列编码299个氨基酸残基，氨基酸序列为SEQ ID N0.2。
3.一对用于调取获得拟南芥样品中基因的引物序列，其特征在于，根据核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示基因X?#7价7设计，序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
4.一种检测拟南芥基因价7mRNA表达模式的方法，其特征在于利用SEQ ID N0.1所示基因的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列:SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6，对拟南芥cDNA样品进行Real-time PCR，然后检测该基因在花、茎、叶、根中的表达；样品拟南芥的RNA经过逆转录后所得cDNA ;其步骤如下: 提取拟南芥不同器官的总RNA ;利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA ;利用引物SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6，进行定量 PCR 检测。
5.一种检测拟南芥在高低温、PEG、高盐胁迫以及植物激素处理后，基因Ji#7S77表达含量变化的方法，其特征在于具体步骤为:将拟南芥进行高低温、PEG、高盐胁迫以及植物激素处理后，提取拟南芥的总RNA ;利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA ;利用引物SEQID N0.5和SEQ ID N0.6，进行定量PCR检测。
6.一种检测拟南芥在转入基因后 ，拟南芥中表达含量变化的方法，其特征在于具体步骤为:提取转入核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示的拟南芥基因和野生型对照组拟南芥的总RNA ;利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQID N0.5和SEQ ID N0.6，进行定量PCR检测。
7.一种核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示的拟南芥基因在植物品种改良中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103695438SQ201310685847
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】明凤, 卢松冲, 张璇, 奚丹丹 申请人:复旦大学