一种用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒，它包括以下成分：松木及其制品松材线虫检测正向引物、反向引物和荧光探针；Premix?Ex?Taq；松材线虫DNA模板；灭菌双蒸水；DNA裂解液；蛋白酶K。本发明还公开了上述试剂盒检测松木及其制品中松材线虫的方法，与现有技术比较，本发明的松木及其制品松材线虫检测试剂盒中引物与探针具有更强的特异性、更高的灵敏度，且对松木及其制品可以进行直接松材线虫检测，检测程序与结果判读程序均为自动化处理，检测结果以样品“含有松材线虫”或“不含有松材线虫”显示。从而为松材线虫病的疫情检测、鉴定提供了更加快速、便利、高效的检测方法。
【专利说明】一种用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物保护领域，涉及一种用于直接检测松木及其制品是否含有松材线虫的检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是引起松树毁灭性传染病害-松材
线虫病的病原物。1982年我国在南京首次发现该病。三十多年来，该病迅速扩散到江苏、安徽、浙江、广东、山东等我国大陆十六个省(区)，直接经济损失42亿元，间接经济损失达千亿元。且每年以6000hm2的速度扩散。近年来，疫情逐步向我国北方省份蔓延。据国家林业局林业有害生物检验鉴定技术培训中心的统计，2009年该病已扩散到河南、陕西两省，已对我国部分地区松林资源、自然景观和生态环境造成严重破坏，并对大面积林区及松林景观生态区域构成严重威胁。分析我国疫情发生特点，病害流行大多由人为传播松木及其制品引起。此外，部分地区没能及时监测到疫情存在而导致疫情进一步扩散。松材线虫病之所以能够快速蔓延，畅通无阻，其主要原因之一就是在实践中缺乏快速、有效的检验检疫手段，以至于我国大多数森林植物检疫检查站的日常检疫工作流于形式而没有真正发挥其应有的效能。 [0003]由于松材线虫的形态学检疫技术存在一些形态学鉴别特征重叠现象，加之幼虫、雄虫不能够定性鉴定。因此,不少学者开始在遗传学、免疫学、病理学和生理生化(酶学、血清学、性外激素、染色体数)等方面做了大量工作，对于松材线虫的检测起到了积极的作用。
[0004]目前在松材线虫的分子检测方面，主要包含三大类。第一类是普通PCR检测方法，如南京农业大学的专利“松材线虫检测试剂盒及其检测方法”(申请号:200310106109.5)以及云南农业大学的专利“一种松树萎蔫病病原线虫的快速检测方法”(申请号:200510048722.5)，这些检测方法费时长、检测过程复杂，不便于生产上应用。且未应用于实际生产上；第二类是实时荧光PCR检测方法，如中国科学院微生物研究所的专利“一种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针”(申请号:200310109374.9)、上海市林业病虫害防治检疫站和南京农业大学植物保护学院的专利“松材线虫检测试剂盒及其检测方法”(申请号:200510026710.2)，以及南京林业大学的专利“一种松材线虫检测试剂盒及其检测方法”(申请号:200810124385.7)等，这些检测方法或多或少地存在检测特异性不强问题、且检测精度还有待提高，因而也没有在生产实践中应用；第三类是恒温扩增检测技术，如南京林业大学与杭州优思达生物技术有限公司的专利“一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法”(2012103035323)，该项检测技术还有待生产上的验证。
[0005]以上松材线虫分子检测方法，首先都必须从可疑松木或松木制品中分离获得线虫，然后再对线虫进行检测、鉴定。仅线虫分离这一项工作就需8-12小时。难以满足各森林植物检疫检查站的快速检疫需求。从快速检疫的角度而言，上述松材线虫分子检测技术与方法距离快速检疫还有一定的差距。为满足检疫检验实践中的快速鉴定要求，有必要开发更为简便、快速、高效的检测鉴定技术与方法。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种能够快速、准确、便利的直接检测松木及其制品是否含有松材线虫的检测试剂盒。
[0007]本发明还要解决的一个技术问题是采用上述试剂盒检测松材线虫的方法。
[0008]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下:
[0009]一种用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒，其特征在于，它包括以下成分:
[0010](I)松木及其制品松材线虫检测正向引物、反向引物和荧光探针:
[0011]正向引物(F):5' -GAGCAGAAACGCCGACTT-3'；
[0012]反向引物(R):5' -CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3'；
[0013]荧光探针(P):5,-FAM-TGCACGTTGTGACAGTCGT-BHQ1-3'；
[0014](2) Premix Ex Taq (Probe qPCR) (2XCone.);
[0015](3)阳性对照:松材线虫DNA模板，浓度为0.5_5ng/ μ L ；
[0016](4)阴性对照:灭菌双蒸水；
[0017](5) DNA 裂解液 '2.0 ~3.0mM 二硫苏糖醇(DTT)，1.0 ~1.5ν/ν% 吐温 20(Tween20),0.8 ~1.2mM 明胶(Gelatin)，1.0 ~1.5mM KCl, 1.0 ~2.0mM ρΗ8.3 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)，3.0~4.0mM MgCl2 ；
[0018](6)蛋白酶 K (Proteinase K)。
[0019]其中，所述的DNA裂解液，其配方优选为:2.0mM 二硫苏糖醇，1.0ν/ν%吐温20，0.8禮明胶，1.01111 KCl, 1.0mM pH8.3三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，3.0mM MgCl2。
[0020]其中，所述的蛋白酶K浓度为20~40mg/mL,优选为20mg/mL。所述的蛋白酶的酶活力要求30U/mg以上。酶活定义是:在37°C，以血红蛋白为底物，I分钟内可以产生相当于I微摩尔酪氨酸Folin阳性的氨基酸或多肽的蛋白酶K的量，定义为一个单位蛋白酶K酶活力。
[0021]上述试剂盒检测松木及其制品中松材线虫的方法，它包括如下步骤:
[0022](I)取样:对每份送检松木或其制品，用电钻钻取3~5个不同位置的碎木屑，混合；
[0023](2)DNA的提取:取碎木屑I~2g于50mL的离心管内，使木屑集中在离心管底部，加入5~8mL的DNA裂解液，再加入20~40mg/mL5 μ L蛋白酶K，将离心管置于68~70°C条件下反应40~45min，然后置于93~95°C条件下反应5~IOmin ;以12000~13000rpm的转速离心3~5min，取上清液100~300 μ L，置于1.5mL离心管，再向其中加入400~500 μ L灭菌双蒸水，以12000~13000rpm的转速离心3~5min,取3.5 μ L上清液，用于检测；
[0024](3)检测体系:总体积 IOyL,包括 5yL Premix Ex Taq、0.5 μ LlO μ M 正向引物、0.5 μ LlO μ M反向引物、0.5 μ LlO μ M荧光探针、3.5 μ L检测样品的上清液；
[0025](4)样品检测:将上述检测体系置于松材线虫自动化分子检测系统进行自动程序检测，自动程序判读检测结果。
[0026]步骤(1)中，电钻钻头直径为8~10mm。[0027]步骤(2)中，优选的方式是:取碎木屑I~2g于50mL的离心管内，使木屑集中在离心管底部，加入6mL的DNA裂解液，再加入20mg/mL5 μ L蛋白酶K，将离心管置于68~70°C条件下反应40min，然后置于95°C条件下反应10min ;以12000rpm的转速离心3min，取上清液100 μ L，置于1.5mL离心管，再向其中加入400 μ L灭菌双蒸水，以12000rpm的转速离心3min，取3.5μ L上清液，用于检测。
[0028]有益效果:与现有技术比较，本发明的进步在于:
[0029](1)检测准确性。本发明的引物和探针，经过全国550多分不同地点的样品检测，其准确率达到100%。在检测验证样品的数量上，超过其它检测技术。
[0030](2)检测灵敏度。本发明的引物和探针，达到的最大检测精度为样品模板的DNA浓度为0.0002pg。超过现有的其它检测技术。
[0031](3)检测实用性。本发明的裂解液，具有直接裂解松木及其制品中线虫的DNA作用。因此，在实际检测过程中，可以省略从松木或其制品中分离线虫的过程，可以直接用松木或松木制品进行检测。具有很强的实用性。
[0032](4)检测便利。本发明的检测方法，采用松材线虫自动化分子检测而系统，拥有自动化的检测程序、结果判读程序，操作更便利。
[0033](5)实际应用。并且已经在全国危险性林业有害生物检验鉴定技术培训中心实践应用3年以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1利用本发明的正引物、反向引物与荧光探针对不同种类线虫的特异性检测结果。其中，B1:松材线虫AMA3 ；B2:拟松材线虫NL5 ；B3:莱奴尔夫伞滑刃线虫ZH13 ；B4:李氏长尾线虫JClO ；B5:泰国伞滑刃线虫JLOl ；B6:吴氏长尾线虫JY13 ；B7:霍夫曼尼伞滑刃线虫SF2 ；B8:大核滑刃线虫GHHC2 ；B9:赫列尼库斯伞滑刃线虫ZNOl ；B10:阳性对照01 ；Bll:阴性对照01。
[0035]BI (松材线虫AMA3)与BlO (阳性对照01)含有松材线虫，而其它8种线虫均不含有松材线虫。
[0036]图2利用本发明的正引物、反向引物与荧光探针灵敏度检测结果。B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9 (阴性对照)的松材线虫 DNA 浓度分别为 1.75ng/ μ L、0.175ng/ μ L、0.0175ng/μ L、l.75pg/μ L、0.175pg/μ L、0.0175pg/μ L、0.00175pg/μ L、0.000175pg/μ L>0pg/μ L0
【具体实施方式】
[0037]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0038]实施例1:引物与探针设计
[0039]根据本研究小组测定的6种伞滑刃属线虫Bursaphelenchus hellenicus、B.hofmann1、B.mucronatus、B.rainulf1、B.thailandae、B.xylophilus 以及 2 种长尾属线虫 Seinura li1、S.wuae 和 I 种滑韧线虫属线虫 Aphelenchoides macronucleatus 的ITS序列，再结合从Genebank中搜索到的30种伞滑刃属线虫B.abietinus、B.anamurius、B.antoniae、B.arthur1、B.borealis、B.braaschae、B.clavicauda、B.conicaudatus、B.corneolus、B.eggers1、B.eremus、B.fungivorus、B.gerber1、B.hildegardae>B.hylobianum、B.0kinawaensis、B.paracorneoIus、B.paraparvispicularis、B.parathailandae、B.pinaster1、B.pinophilus、B.platzer1、B.poligraph1、B.sean1、B.sexdentat1、B.sinensis、B.tusciae、B.vallesianus、B.willibald1、B.yongensis 的ITS序列，采用BioEid软件对上述39种线虫的Its区序列进行比对，在存在较多的碱基差异的内部转录区2区域,利用Premier express3.0软件设计了松材线虫的引物与突光探针。
[0040]其中，
[0041]正向引物(F):5' -GAGCAGAAACGCCGACTT-3'，
[0042]反向引物(R): 5' -CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3'，
[0043]荧光探针(P):5,-FAM-TGCACGTTGTGACAGTCGT-BHQ1-3'。
[0044]将以上引物与探针用于松木及其制品的松材线虫分子检测。
[0045]实施例2:
[0046]—种用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒，其特征在于，它包括以下成分:
[0047](I)松木及其制品松材线虫检测正向引物、反向引物和荧光探针:
[0048]正向引物(F):5' -GAGCAGAAACGCCGACTT-3'；
[0049]反向引物(R):5' -CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3'；
[0050]荧光探针(P):5,-FAM-TGCACGTTGTGACAGTCGT-BHQ1-3'；
[0051](2) Premix Ex Taq (Probe qPCR) (2XCone.);
[0052](3)阳性对照:松材线虫DNA模板，浓度为0.5_5ng/ μ L ；
[0053](4 )阴性对照:灭菌双蒸水；
[0054](5) DNA 裂解液:2.0 ~3.0mM 二硫苏糖醇(DTT)，1.0 ~1.5v/v% 吐温 20(Tween20),0.8 ~1.2mM 明胶(Gelatin)，1.0 ~1.5mM KCl, 1.0 ~2.0mM ρΗ8.3 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)，3.0~4.0mM MgCl2 ；
[0055](6)蛋白酶 K (Proteinase K)。
[0056]实施例3:
[0057]上述试剂盒检测松木及其制品中松材线虫的方法，它包括如下步骤:
[0058](I)取样:对每份送检松木或其制品，用电钻钻取3~5个不同位置的碎木屑(钻头直径为8~IOmm),混合；
[0059](2)DNA的提取:取碎木屑I~2g于50mL的离心管内，使木屑集中在离心管底部，加入5~8mL的DNA裂解液，再加入20~40mg/mL5 μ L蛋白酶K，将离心管置于68~70°C条件下反应40~45min，然后置于93~95°C条件下反应5~IOmin ;以12000~13000rpm的转速离心3~5min，取上清液100~300 μ L，置于1.5mL离心管，再向其中加入400~500 μ L灭菌双蒸水，以12000~13000rpm的转速离心3~5min,取3.5 μ L上清液，用于检测；
[0060](3)检测体系:总体积 IOyL,包括 5yL Premix Ex Taq、0.5 μ LlO μ M 正向引物、
0.5 μ LlO μ M反向引物、0.5 μ LlO μ M荧光探针、3.5 μ L检测样品的上清液；[0061](4)样品检测:将上述检测体系置于松材线虫自动化分子检测系统(BX-48，生产厂家:杭州博日科技有限公司，销售公司:南京生兴有害生物防治技术有限公司)进行自动程序检测，自动程序判读检测结果。
[0062]实施例4:特异性检测。
[0063]1、线虫DNA提取
[0064]分别将9种不同的线虫(见表1)置于9个1.5mL的离心管中，再加入20 μ L的线虫 DNA 裂解液(2.0mM DTT, 1.0% (v/v) Tween20,0.8mM Gelatin, 1.0mM KCl, 1.0mMTris-Cl (pH8.3),3.0mM MgCl2, 20mg/mL Proteinase K)。置于 68_70°C条件下 40min，然后置于95°C条件下IOmin ;以12000rpm的转速离心3min,取3.5 μ L上清液用于检测。
[0065]2、检测体系
[0066]总体积10 μι,包括 5 μ L Premix Ex Taq (Probe qPCR) (2XConc.)、0.5 μ L 正向引物(F)、0.5μ L反向引物(F)、0.5μ L荧光探针、3.5 μ L检测样品的上清液。阳性对照用3.5 μ L浓度为0.5ng/ μ L的松材线虫DNA液，阴性对照用3.5 μ L灭菌双蒸水。
[0067]3、样品检测
[0068]将上述检测体系置于松材线虫自动化分子检测系统(ΒΧ-48)进行自动程序检测。
[0069]4、结果判读
[0070]自动程序判读结果 如图1所示，BI (松材线虫ΑΜΑ3)与BlO (阳性对照01)含有松材线虫，而其它8种线虫Β2(拟松材线虫NL5)、Β3 (莱奴尔夫伞滑刃线虫ΖΗ13)、Β4 (李氏长尾线虫JC10)、B5 (泰国伞滑刃线虫JL01)、B6 (吴氏长尾线虫JY13)、B7 (霍夫曼尼伞滑刃线虫SF2)、B8 (大核滑刃线虫GHHC2)、B9 (赫列尼库斯伞滑刃线虫ZN01)以及Bll (阴性对照01)均不含有松材线虫。
[0071]表1供试线虫株系代号和来源
[0072]
【权利要求】
1.一种用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒，其特征在于，它包括以下成分: (1)松木及其制品松材线虫检测正向引物、反向引物和荧光探针: 正向引物:5' -GAGCAGAAACGCCGACTT-3'； 反向引物:5' -CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3'； 荧光探针:5' -FAM-TGCACGTTGTGACAGTCGT-BHQ1-3'；
(2)Premix Ex Taq ； (3)阳性对照:松材线虫DNA模板； (4)阴性对照:灭菌双蒸水； (5)DNA裂解液:2.0~3.0mM 二硫苏糖醇，1.0~L 5v/v%吐温20，0.8~L 2mM明胶，1.0~1.5mM KCl，1.0~2.0mM pH8.3三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，3.0~4.0mM MgCl2 ； (6)蛋白酶K。
2.根据权利要求1所述的用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒，其特征在于，所述的DNA裂解液，其配方为:2.0mM 二硫苏糖醇，1.0ν/ν%吐温20，0.8mM明胶，1.0mM KCl,1.0mM pH8.3三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，3.0mM MgCl20
3.根据权利要求1所述的用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒，其特征在于，所述的蛋白酶K浓度为20~40mg/mL。
4.根据权利要求3所述的用于松木及其制品的松材线虫检测试剂盒，其特征在于，所述的蛋白酶K浓度为20mg/mL。`
5.权利要求1所述的试剂盒检`测松木及其制品中松材线虫的方法，其特征在于，它包括如下步骤: (1)取样:对每份送检松木或其制品，用电钻钻取3~5个不同位置的碎木屑，混合； (2)DNA的提取:取碎木屑I~2g于50mL的离心管内，使木屑集中在离心管底部，加入5~8mL的DNA裂解液，再加入20~40mg/mL5 μ L蛋白酶K，将离心管置于68~70°C条件下反应40~45min，然后置于93~95°C条件下反应5~IOmin ;以12000~13000rpm的转速离心3~5min，取上清液100~300 μ L，置于1.5mL离心管，再向其中加入400~500 μ L灭菌双蒸水，以12000~13000rpm的转速离心3~5min,取3.5 μ L上清液,用于检测； (3)检测体系:总体积10μL，包括5μ L Premix Ex Taq、0.5 μ LlO μ M正向引物、0.5 μ LlO μ M反向引物、0.5 μ LlO μ M荧光探针、3.5 μ L检测样品的上清液； (4)样品检测:将上述检测体系置于松材线虫自动化分子检测系统进行自动程序检测，自动程序判读检测结果。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，电钻钻头直径为8~10mm。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，取碎木屑I~2g于50mL的离心管内，使木屑集中在离心管底部，加入6mL的DNA裂解液，再加入20mg/mL5 μ L蛋白酶K，将离心管置于68~70°C条件下反应40min，然后置于95°C条件下反应10min ;以12000rpm的转速离心3min，取上清液100 μ L，置于1.5mL离心管，再向其中加入400 μ L灭菌双蒸水，以12000rpm的转速离心3min,取3.5 μ L上清液,用于检测。
【文档编号】C12Q1/68GK103667497SQ201310732392
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】陈凤毛, 叶建仁, 吴小芹 申请人:南京林业大学