一株香味菌属菌株及其在制备烯丙基甲基硫醚中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株香味菌属菌株，菌株名为WTC05-2，分类命名为Myroides?sp.，已于2013年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.7113。本发明的菌株，产烯丙基甲基硫醚能力强，可以用于生产制备烯丙基甲基硫醚，采用微生物发酵法生产烯丙基甲基硫醚，较之化学生产法具有反应温和、原料绿色天然、工艺简单、能耗低等优点，并且有利于环境保护，易于推广使用，为利用微生物发酵生产烯丙基甲基硫醚奠定了技术基础。
【专利说明】一株香味菌属菌株及其在制备烯丙基甲基硫醚中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株香味菌属菌株及其在制备烯丙基甲基硫醚中的应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]烯丙基甲基硫醚(Allyl methyl sulfide),中文别名:丙烯基甲基硫醚,烯丙基甲基硫化物；CAS号=10152-76-8 ;分子式=C4H8S ;分子量:88.17 ;分子结构:、沸点:88.60C at 760mmHg ;密度 0.85g/mL[1]。
[0003]天然烯丙基硫化物多存在于大蒜、洋葱等蔬菜中。其中，烯丙基甲基硫醚是一种普遍使用的食品添加剂，医药中间体，它具有重要的生物活性，如下:(I)抗氧化活性，可清除自由基，阻隔体内亚硝胺的生成，抑制脂质过氧化物对膜结构的损伤，从而起到保护肝脏的作用[2’3]。祁红兵等人对纳豆芽孢杆菌米糠发酵物中抗氧化成分进行分析，发现乙酸乙酯相和乙醚相的抗氧化活力最强，分别为168和163kU/g，其中乙酸乙酯相抗氧化活性成分主要是烯丙基甲基硫醚tt]。(2)赵怀清、难波恒雄研究了茗葱(Allium victorialis)浸膏及其化合物对培养心肌细胞的作用，实验结果表明挥发性提取物对培养心肌细胞心率和振幅有明显的增强作用，进而对具有生物活性的挥发性提取物进行成分分析，表明二甲基二硫、烯丙基甲基三硫、烯丙基甲基硫醚和二烯丙基二硫对培养心肌细胞心率和振幅均有不同程度的增强作用[5]。(3)烯丙基硫化物还是降血糖药物的主要成分，可提高胰岛素的功能或在谷胱甘肽、半胱氨酸等硫醇化合物参与下提高生物体内的氧化还原作用。值得注意的是，烯丙基硫化物仅降低不正常的高血糖，而对正常血糖值无影响[3’6]。刘浩，崔美芝，李春艳研究了大蒜素对糖尿病大鼠血糖的影响，大蒜素的化学名为二烯丙基二硫化物，是从大蒜球莖中分离出的一种化合物m。结果显示大蒜素能够降低糖尿病大鼠的血糖，降糖效果与给药剂量成正相关。同时研究了大 蒜素对正常大鼠血糖的影响，实验前后比较差异无显著性意义(P>0.05)，与阴性对照组比较差异无显著性意义(P>0.05)。可知大蒜素对正常大鼠的血糖没有影响[8]。(4)以烯丙基甲基硫醚为主要成分的大蒜精油，在抗肿瘤方面可抑制细胞生长，调控细胞周期依赖素激酶，参与肿瘤发生的信号转导，诱导肿瘤细胞分化和凋亡，减少癌基因、增加抑癌基因表达，调节生物酶活性[9]。
[0004]目前，烯丙基甲基硫醚的制备方法主要是化学合成或天然提取。化学合成生产工艺复杂，包括回流、蒸馏、冷冻、酸化、碱化、压滤等工艺过程，常有高温、高压、负压，并大量使用易燃易爆的有机试剂，反应中间体或副产品较多；并且化学合成中常会产生大量废气、废水、废渣，从而污染环境；因而其应用受到生产中的高危险性、产品安全性以及环境污染性的限制。随着人民生活水平的提高，对产品安全性的要求日益严格，绿色、纯天然的食品成为大家共同的追求。但天然提取的化合物常常因为含量低、资源有限、结构复杂、不能采用化学方法合成等缺点而难以开发成新产品。生物合成法是由酶催化的化学反应，具有位置选择性和立体选择性好、催化效率高、反应条件温和、反应类型多、环境友好等特点，因此，利用生物合成法制备烯丙基甲基硫醚将会成为烯丙基甲基硫醚天然生产制备中具有巨大潜力的研究方向。然而经过文献和专利的检索，国内外利用这一思路的相关技术和方法至今未见文献或专利报道。
[0005]香味菌(Myroides)是一类革兰氏阴性杆菌，目前尚未见关于香味菌产烯丙基甲基硫醚的专利信息或科研文献报道。在普通琼脂营养培养基上严格需氧，在血琼脂上不溶血_，具有一定生物安全性。本发明专利申请从泥土中筛选到一株产烯丙基甲基硫醚的香味菌属菌株CGMCC 7113，并首次报道了其发酵生产烯丙基甲基硫醚的方法。
[0006]参考文献:
[0007][I]烯丙基甲基硫醚.中国化工制造网(http://www.chemmade.com/)。
[0008][2]刘书成.大蒜精油对食用油脂的抗氧化特性[J].食品科学，2001(6):128—131。
[0009][3]孙君社，高孔荣.大蒜的化学与药效及利用[J].广州食品科技，1994(S1):8—11。
[0010][4]祁红兵，宋军霞，陈钧.纳豆芽孢杆菌米糠发酵物中抗氧化成分分析[J].安徽农业科学，2012,40 (12):7414— 7416，741。
[0011][5]赵怀清，难波恒雄.苳葱浸膏及其化合物对培养心肌细胞的作用[J].沈阳药科大学学报，1999，16 (4):274-277。
[0012][6]Yin MC, Hwang Sff, Chan KC.Nonenzymatic antioxidant activity of fourorganosulfur compounds derived from garlic.J Agric Food Chem,2002,50 (21):6143-6147。
`[0013][7]马凤英，王文英.大蒜素的药理学研究进展[J].中草药，1997，28 (11):697—702。
[0014][8]刘浩，崔美芝，李春艳.大蒜素对糖尿病大鼠血糖的影响[J].中国临床康复，2004,8(21):4264-4265。
[0015][9]向妹霖，苏琦.烯丙基硫化物抗肿瘤进展[J].国外医学:肿瘤学分册，2004，31(10):736—738ο
[0016][10]Μ.VANCA丽EYT, P.SEGERS, U.T0RCK，et al.Reclassification ofFlavobacterium odoraturn(Stutzer 1929)Strains to a New Genus,Myroides, asMyro ides odoratu scomb.nov.and Myroides odorat imimus sp.nov.1JSEM[J]，1996，46(4):926-932。
【发明内容】
[0017]针对上述现有技术，针对人们对安全健康天然产品的大量需求，本发明提供了一株产烯丙基甲基硫醚的香味菌属菌株，并提供了其在制备烯丙基甲基硫醚中的应用，以及制备方法。
[0018]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0019]一株香味菌属菌株，菌株名为WTC05-2,分类命名为Myroides sp.,已于2013年I月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.7113。
[0020]本发明的菌株是 申请人:(滕州市悟通香料有限责任公司)从所采集的土样中筛选获得的，其生物学特征符合已报道的香味菌属特征:革兰氏阴性好氧杆菌，直径0.5 μ m，长度I~2μπι(如图1B所示)，无鞭毛，无滑行能力，非聚集生长，能够产生黄色素(如图1A所示)，培养物具有水果香味，发酵培养48h时香味最浓。
[0021]本发明的菌株，经测定，其16S rRNA的基因序列长度为1481bp JBSEQ ID N0.1所不。通过使用美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI) BLASTN程序比对，本发明的菌株的16S rRNA的基因序列与NCBI注册的香味菌标准菌株(Myroides) 16S rRNA的基因序列具有较高的同源性(98~99%)，并进一步构建系统发育树(如图2所不),本发明所筛选到的菌株与Myroides odoratimimus,Myroides profundi亲缘关系较近。
[0022]本发明中，用于菌体形态观察的培养基为TSB培养基(胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，PH7.2)。
[0023]本发明中，形态特征观测方法为普通荧光倒置显微镜观测。
[0024]本发明中，16SrRNA基因系统发育树构建方法:应用MEGA4.0中的Clustal W对测得的序列以及基因库中的相似序列一起进行多序列比对，用Neighbor-Joining法构建系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验。
[0025]本发明的菌株的分离纯化与16S rRNA基因测序的基本方法是:用于分离微生物的土壤样品由 申请人:(滕州市悟通香料有限责任公司)采集并提供。将土壤样品在LB培养基中富集培养，30°C,200转/分钟培养12h后，取不同稀释度的菌液涂布LB琼脂平板，挑单菌落进行划线分离，30°C培养24h ;挑单菌落至LB液体中，3(TC、200转/分钟培养12h，超低温冰箱保存菌种，同时利用细菌基因组提取试剂盒(天根)提取菌株基因组DNA，以菌株基因组DNA为模板，使用细菌16S rDNA通用引物进行扩增，用胶回收试剂盒(天根)纯化PCR扩增产物，电泳验证，连接到PMD19-T载体，转化到E.coli DH5 α。经氨苄抗性筛选，获得阳性克隆。16S rDNA测序由山 东省农业科学院完成，将序列与美国国家生物信息中心(NCBI)收录的DNA序列进行比对。按照此流程，获得了一株产烯丙基甲基硫醚能力强的菌株，编号为WTC05-2，命名为Myroides sp.，于2013年I月9日进行了保藏，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7113。
[0026]上述用于菌株分离纯化的LB培养基组成为:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L, ρΗ7.2。
[0027]上述用于菌株16S rDNA扩增的通用引物为:
[0028]正向引物为27f:5’ - AGAGTTTGATCCTG GCT CAG-3’，如 SEQ ID N0.2 所示；
[0029]反向引物为1492r:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，如 SEQ ID N0.3 所示。
[0030]上述用于菌株16S rDNA扩增的体系为:每30 μ L反应体系中加入浓度为IOmmol/L 的 27f 和 1492r 各 1.0μ L，2mmol/L 的 dNTP 2.4μ L,2XGC Buffer I 15yL，5U/yL 的LA-Taq DNA聚合酶0.2 μ L,模板3uL，18.2ΜΩ.cm超纯水8.0yL0所用基因扩增试剂购自大连宝生物技术有限公司。
[0031]上述用于菌株16S rDNA扩增的条件为:94°C预变性5min ;94°C变性30S，55°C退火30S，72°C延伸90S，共35个循环；72°C延伸15min ;降温至4°C并保温15min。
[0032]本发明的菌株的发酵条件优化方法为:将供试菌株在LB斜面培养基上活化后，接种于装有50ml LB培养基的300ml三角瓶中，30°C，200转/分钟，摇床培养12h，然后分别按照1.5%接种量接种于LB、TB、SOB、TSB培养基中，30°C，200转/分钟摇床培养，分别在3h、6h、9h、12h、18h、24h、30h、42h 时，于 600nm 波长测定菌体浓度(OD6J。
[0033]上述用于菌株发酵的培养基组成分别为:
[0034]TB:蛋白胨 12g/L、酵母浸粉 24g/L、甘油 4ml/L、ΚΗ2Ρ042.31g/L、Κ2ΗΡ0412.54g/L、ρΗ7.2。
[0035]2ΧΥΤ:蛋白胨 16g/L、酵母浸粉 10g/L、NaC15g/L、ρΗ7.0。
[0036]SOB:蛋白胨 20g/L、酵母浸粉 5g/L、NaCl0.5g/L、KC10.186g/L、MgCl20.95g/L、pH7.0。
[0037]TSB:胰蛋白胨17g/L、植物蛋白胨3g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、葡萄糖
2.5g/L、pH7.2。
[0038]上述用于菌株发酵条件优化的判断依据是:(I)通过嗅觉直接判断菌株发酵过程中香味浓淡的变化；(2)通过产物的纯化、气质联用的半定量分析来估算产量。
[0039]本发明的菌株，产烯丙基甲基硫醚能力强，可以用于生产制备烯丙基甲基硫醚。应用时，具体方式如下:
[0040](I)菌种选择:选用本发明的菌株Myroides sp.WTC05-2，其菌种保藏编号为CGMCCN0.7113 ；
[0041](2)菌种活化:将上述菌种划线于固体培养基，在30°C静置培养18小时，备用；
[0042](3)种子培养:将上`述步骤(2)培养的菌株用接种环挑取单菌落，接种于装有50mL液体种子培养基的300mL三角瓶中，置摇床中震荡培养，其转速为200转/分钟，30°C培养12小时,得种子液；
[0043](4)发酵培养:以体积比为1.0%的接种量，将步骤(3)所得种子液继续接种于装有IOOmL发酵培养基的500mL摇瓶中，在30°C、转速为200转/分钟的条件下摇瓶培养42h，得发酵液；
[0044](5)产物富集及纯化:向上述发酵液中加入DlOl大孔吸附树脂，提取24h，过滤，然后进行洗脱:先用水淋洗树脂，再用有机试剂淋洗树脂，收集有机试剂洗脱液，蒸除有机溶剂，即得烯丙基甲基硫醚。
[0045]进一步地，还可以包括以下步骤(6):上述有机试剂洗脱液的检测:采用气质联用(GC-MS)鉴定有机试剂洗脱液中是否含有烯丙基甲基硫醚及其浓度。
[0046]上述应用中，步骤(2) (3) (4)中所述的固体培养基、液体种子培养基、发酵培养基均为胰蛋白胨大豆肉汤培养基，其配方组成为:胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH7.2。区别仅在于:固体培养基中还加入了浓度为2%的琼脂。
[0047]上述的应用中，步骤(5)具体为:按照20g/L添加量向上述发酵液中加入DlOl大孔吸附树脂，提取24h，以100目的絹布过滤，将树脂加入玻璃柱(内径20mm)中，树脂装填高度10mm，按照2ml/min流速，先用4体积去离子水淋洗树脂，再用3体积的有机试剂淋洗树脂，收集第3柱体积的有机试剂洗脱液(第一、二柱体积的有机试剂洗脱液中由于杂质较多，不利于目标产物的分离纯化，因此只收集杂质少、纯度高的第三柱体积的有机试剂洗脱液)即为含有烯丙基甲基硫醚的洗脱液，蒸除有机溶剂，即得烯丙基甲基硫醚。
[0048]上述的应用中，步骤(5)中的DlOl大孔吸附树脂，使用前需进行预先处理，处理方式为:用2倍树脂体积的饱和食盐水，浸泡18~20h，然后排尽食盐水，用清水漂洗净，使排出的水不显黄色，再用质量百分数为2%~4%的氢氧化钠溶液(其用量为树脂体积的2倍)，浸泡2~4h，排尽碱液后，冲洗树脂直至水为中性，待用。
[0049]上述的应用中，步骤(5)中的有机试剂为乙醚。
[0050]上述的应用中，步骤(6 )所述的GC-MS分析条件为:
[0051](I)气相色谱条件=RTX-1色谱柱，柱温80°C，载气He，载气流量3.0ml/min ；
[0052](2)质谱检测条件为:检测器温度250°C，4.5min后开始检测，扫描质量范围45~700。
[0053]经实验证实:利用本发明的菌株发酵，500ml三角瓶进行摇瓶发酵，经过42小时，烯丙基甲基硫醚的产量可达到70mg/L。
[0054]本发明的菌株，产烯丙基甲基硫醚能力强，采用微生物发酵法生产烯丙基甲基硫醚，较之化学生产法具有反应温和、原料绿色天然、工艺简单、能耗低等优点，并且有利于环境保护，易于推广使用，为利用微生物发酵生产烯丙基甲基硫醚奠定了技术基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0055]本发明的香味菌属菌株，菌株名为WTC05-2，分类命名为Myroides sp.，已于2013年I月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.7113，保藏地址: 北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编:100101。
[0056]图1:本发明的菌株的基本形态学特征，其中，A图示本发明的菌株在TSB培养基上生长24h后的形态；B图示本发明的菌株的细胞形态。
[0057]图2:本发明的菌株基于16S rRNA基因序列绘制的进化树。
[0058]图3:本发明的菌株的发酵条件优化图，图中描绘了 WTC05-2分别在LB、TB、2XYT、S0B、TSB培养基中的生长曲线，并通过嗅觉判断，选取适合发酵生产烯丙基甲基硫醚的培养基。
[0059]图4:本发明的菌株在胰蛋白胨大豆肉汤中发酵42h后，乙醚萃取发酵液的气相色谱图，图中显示，烯丙基甲基硫醚的出峰时间为9.858min。
[0060]图5:本发明的菌株所产烯丙基甲基硫醚的质谱图。
[0061]图6:稀丙基甲基硫酿标准曲线图。
【具体实施方式】
[0062]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0063]实施例1菌株的筛选获得及16S rRNA基因测序
[0064]用于分离微生物的土壤样品由 申请人:(滕州市悟通香料有限责任公司)采集并提供。将土壤样品在LB培养基中富集培养，30°C,200转/分钟培养12h后，取不同稀释度的菌液涂布LB琼脂平板，挑单菌落进行划线分离，30°C培养24h ;挑单菌落至LB液体中，30°C、200转/分钟培养12h，超低温冰箱保存菌种，同时利用细菌基因组提取试剂盒(天根)提取菌株基因组DNA，以菌株基因组DNA为模板，使用细菌16S rDNA通用引物进行扩增，用胶回收试剂盒(天根)纯化PCR扩增产物，电泳验证，连接到PMD19-T载体，转化到E.coli DH5 α。经氨苄抗性筛选，获得阳性克隆。16S rDNA测序由山东省农业科学院完成，将序列与美国国家生物信息中心(NCBI)收录的DNA序列进行比对。按照此流程，获得了一株产烯丙基甲基硫醚能力强的菌株，编号为WTC05-2，命名为Myroides sp.，于2013年I月9日进行了保藏，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7113。
[0065]上述用于菌株分离纯化的LB培养基组成为:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L, ρΗ7.2。
[0066]上述用于菌株16SrDNA扩增的通用引物为:
[0067]正向引物为27f:5’ -AGAGTTTGATCCTG GCT CAG-3’ ；
[0068]反向引物为1492r:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3，。
[0069]上述用于菌株16S rDNA扩增的体系为:每30 μ L反应体系中加入浓度为IOmmol/L 的 27f 和 1492r 各 1.0μ L，2mmol/L 的 dNTP 2.4μ L,2XGC Buffer I 15yL，5U/yL 的LA-Taq DNA聚合酶0.2 μ L,模板3uL，18.2ΜΩ.cm超纯水8.0yL0所用基因扩增试剂购自大连宝生物技术有限公司。
[0070]上述用于菌株16S rDNA扩增的条件为:94°C预变性5min ;94°C变性30S，55°C退火30S，72°C延伸90S，共35个循环；72°C延伸15min ;降温至4°C并保温15min。
[0071]实施例2菌株发酵条件的优化
[0072]将供试菌株(WTC05-2)在LB斜面培养基上活化后，接种于装有50ml LB培养基的300ml三角瓶中，30°C，200转/分钟，摇床培养12h，然后分别按照1.5%接种量接种于LB、TB、SOB、TSB 培养基中，30°C，200 转 / 分钟摇床培养，分别在 3h、6h、9h、12h、18h、24h、30h、42h时，于600nm波长测定菌体浓度(OD6J，结果如图3所示，通过图3可以看出，WTC05-2在TSB培养基中相对其他四种培养基生长缓慢，使其能更好的积累次级代谢产物，因此选择TSB培养基作为后续的发酵培养基。
[0073]上述用于菌株发酵的培养基组成分别为:
[0074]TB:蛋白胨 12g/L、酵母浸粉 24g/L、甘油 4ml/L、ΚΗ2Ρ042.31g/L、Κ2ΗΡ0412.54g/L、ρΗ7.2。
[0075]2 X YT:蛋白胨 16g/L、酵母浸粉 10g/L、NaCl 5g/L、pH7.0。
[0076]SOB:蛋白胨 20g/L、酵母浸粉 5g/L、NaCl 0.5g/L、KCl 0.186g/L、MgCl20.95g/L、pH7.0。
[0077]TSB:胰蛋白胨17g/L、植物蛋白胨3g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L、pH7.2。
[0078]上述用于菌株发酵条件优化的判断依据是:(I)通过嗅觉直接判断菌株发酵过程中香味浓淡的变化；(2)通过产物的纯化、气质联用的半定量分析来估算产量。
[0079]实施例3菌株在生产制备烯丙基甲基硫醚中的应用
[0080]具体方式如下:
[0081](I)菌种选择:选用本发明的菌株Myroides sp.WTC05-2，其菌种保藏编号为CGMCCN0.7113 ；
[0082](2)菌种活化:将上述菌种划线于固体培养基，在30°C静置培养18小时，备用；
[0083](3)种子培养:将上述步骤(2)培养的菌株用接种环挑取单菌落，接种于装有50mL液体种子培养基的300mL三角瓶中，置摇床中震荡培养，其转速为200转/分钟，30°C培养12小时,得种子液；
[0084](4)发酵培养:以体积比为1.0%的接种量，将步骤(3)所得种子液继续接种于装有IOOmL发酵培养基的500mL摇瓶中，在30°C、转速为200转/分钟的条件下摇瓶培养42h，得发酵液；
[0085](5)产物富集及纯化:按照20g/L添加量向发酵液中加入预先处理好的DlOl大孔吸附树脂，提取24h，以100目的絹布过滤，将树脂加入玻璃柱(内径20mm)中，树脂装填高度IOmm,按照2ml/min流速，先用4体积去离子水淋洗树脂，再用3体积的有机试剂淋洗树脂，收集第3柱体积的有机试剂洗脱液，即为含有烯丙基甲基硫醚的洗脱液，蒸除有机溶剂，即得烯丙基甲基硫醚；
[0086]上述的应用中，步骤(5)中的DlOl大孔吸附树脂，使用前需进行预先处理，处理方式为:用2倍树脂体积的饱和食盐水，浸泡20h，然后排尽食盐水，用清水漂洗净，使排出的水不显黄色，再用质量百分数为3%的氢氧化钠溶液(其用量为树脂体积的2倍)，浸泡3h，排尽碱液后，冲洗树脂直至水为中性，待用。
[0087](6)洗脱产物粗浸膏的检测:采用气质联用(GC-MS)鉴定上述有机试剂洗脱液中是否含有烯丙基甲基硫醚，以及其浓度。
[0088]上述应用中，步骤(2) (3) (4)中所述的固体培养基、液体种子培养基、发酵培养基均为胰蛋白胨大豆肉汤培养基，其配方组成为:胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH7.2。区别仅在于:固体培养基中还加入了浓度为2%的琼脂。
[0089]上述的应用中，步骤(5)中的有机试剂为乙醚。
[0090]上述的应用中，步`骤(6)所述的GC-MS分析条件及其结果为:
[0091](I)气相色谱条件:RTX-1色谱柱，柱温80°C，载气He，载气流量3.0ml/min ；
[0092](2)质谱检测条件为:检测器温度250°C，4.5min后开始检测，扫描质量范围45~700 ；
[0093](3)所得到的气相色谱图中烯丙基甲基硫醚出峰时间为9.858min，如图4所示，通过该图谱可看出，烯丙基甲基硫醚在提取物中含量最多，峰面积为1429067。
[0094](4)烯丙基甲基硫醚的质谱结果如图5所示，通过该图谱可看出，该物质的分子量为88，符合烯丙基甲基硫醚的分子量大小。另外，与数据库中烯丙基甲基硫醚的标准质谱图进行比对，相似度大于99%，因此判断该物质为烯丙基甲基硫醚。
[0095](5)通过绘制烯丙基甲基硫醚标准曲线(图6)，依据烯丙基甲基硫醚的峰面积计算得发酵液中烯丙基甲基硫醚的浓度为70mg/L。
【权利要求】
1.一株香味菌属菌株，菌株名为WTC05-2，分类命名为Myroides sp.，已于2013年I月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7113。
2.权利要求1所述的香味菌属菌株在制备烯丙基甲基硫醚中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:应用时，包括以下步骤: (1)菌种选择:选用权利要求1的菌株； (2)菌种活化:将上述菌种划线于固体培养基，在30°C静置培养18小时，备用； (3)种子培养:将上述步骤(2)培养的菌株用接种环挑取单菌落，接种于装有50mL液体种子培养基的300mL三角瓶中，置摇床中震荡培养，其转速为200转/分钟，30°C培养12小时，得种子液； (4)发酵培养:以体积比为1.0%的接种量，将步骤(3)所得种子液继续接种于装有IOOmL发酵培养基的500mL摇瓶中，在30°C、转速为200转/分钟的条件下摇瓶培养42h，得发酵液； (5)产物富集及纯化:向上述发酵液中加入DlOl大孔吸附树脂，提取24h，过滤，然后进行洗脱:先用水淋洗树脂，再用有机试剂淋洗树脂，收集有机试剂洗脱液，蒸除有机溶剂，即得烯丙基甲基硫醚。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:还包括以下步骤(6):上述有机试剂洗脱液的检测:采用气质联 用(GC-MS)鉴定有机试剂洗脱液中是否含有烯丙基甲基硫醚，以及其浓度。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述步骤(2)(3)(4)中的固体培养基、液体种子培养基、发酵培养基均为胰蛋白胨大豆肉汤培养基，其配方组成为:胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH7.2 ;固体培养基中还加入了浓度为2%的琼脂。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述步骤(5)中的有机试剂为乙醚。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述步骤(5)具体为:按照20g/L添加量向上述发酵液中加入DlOl大孔吸附树脂，提取24h，以100目的絹布过滤，将树脂加入玻璃柱中，树脂装填高度IOmm,按照2ml/min流速,先用4体积去离子水淋洗树脂,再用3体积的有机试剂淋洗树脂，收集第3柱体积的有机试剂洗脱液，即为含有烯丙基甲基硫醚的洗脱液，蒸除有机溶剂，即得烯丙基甲基硫醚。
8.根据权利要求3或7所述的应用，其特征在于:所述步骤(5)中的DlOl大孔吸附树月旨，使用前需进行预先处理，处理方式为:用饱和食盐水浸泡18~20h，然后排尽食盐水，用水漂洗净，使排出的水不显黄色，再用质量百分数为2%~4%的氢氧化钠溶液浸泡2~4h，排尽碱液后，冲洗树脂直至水为中性。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述步骤(6)中，GC-MS分析条件为: (1)气相色谱条件=RTX-1色谱柱，柱温80°C，载气He，载气流量3.0ml/min ； (2)质谱检测条件为:检测器温度250°C，4.5min后开始检测，扫描质量范围45~700。
【文档编号】C12P11/00GK103756932SQ201310732431
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】古静燕, 李越中, 刘会会, 韩文君, 赵帅, 丁涛, 卫洁 申请人:滕州市悟通香料有限责任公司