表达猪博卡病毒vp2蛋白的重组杆状病毒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达猪博卡病毒VP2蛋白的重组杆状病毒及其应用，PCR扩增一种猪博卡病毒VP2基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示。将扩增到的猪博卡病毒VP2基因插入到杆状病毒转移质粒pFastBacTMHTB的BamHⅠ和XhoⅠ位点构建为重组转移质粒pFastBac?HTB-VP2，然后将该重组转移质粒转化至含有杆状病毒骨架质粒的DH10Bac感受态细胞，通过同源重组将VP2基因整合至杆状病毒骨架质粒Bacmid中，提取重组Bacmid?DNA转染sf9细胞后获得重组杆状病毒rBV-VP2，保藏号为：CCTCC?V201401。在昆虫细胞中大量表达产生VP2蛋白及病毒样颗粒，开发成一种有效的PBoV?VLPs亚单位疫苗。
【专利说明】表达猪博卡病毒VP2蛋白的重组杆状病毒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物病毒学与基因工程学【技术领域】，具体地指一种表达猪博卡病毒VP2蛋白的重组杆状病毒及其应用。
【背景技术】
[0002]猪博卡病毒(Porcine Bocavirus)于2009年首次在瑞典患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)和猪圆环病毒 2 型共感染的病猪体内发现(Blomstrom AL 等.Detection of a novel porcine boca-like virusin the background of porcine circovirus type2induced postweaning multisystemicwasting syndrome.Virus Res2009，146:125-129)。2011 年我国首次报道了猪博卡样病毒(PBo-1ikeV)的近全长基因组序列，并从系统进化分析确认了 PBo-1ikeV属于博卡病毒属，命名为猪博卡病毒WHl株。通过流行病学检测分析发现，证实猪博卡病毒在中国也存在广泛的流行(Zeng S 等.Complete coding sequences and phylogenetic analysis ofporcine bocavirus.J Gen Virol，92:784-788)。 [0003]猪博卡病毒为无囊膜的单链DNA病毒，体积小，结构简单，直径约为25~30mn，属于细小病毒科细小病毒亚科博卡病毒属(Moron VG等.1n vivo, dendritic cells cancross-present virus-like particles using an endosome-to-cytosol pathway.JImmunol2003, 171:2242-2250;
[0004]Cheng WX 等.1dentification and nearly full-length genomecharacterization of novel porcine bocaviruses.PLoS One, 5: el3583)。本属其它成员包括牛细小病毒(Bovine Parvovirus)、犬微小病毒(Canine Minute virus)、人博卡病毒(Human Bocavirus)。猪博卡病毒基因组全长约为5kb,编码三个开放阅读框(OpenReading Frames, ORFs)，其中ORFl和0RF3负责编码病毒的非结构蛋白(NSU NPl)，0RF2编码结构蛋白(重叠的VP1/VP2)。0RF3为博卡病毒特征性的开放性阅读框，其功能尚不明确。作为博卡病毒主要的结构蛋白，0RF2基因编码的衣壳蛋白——VP2蛋白可以在体外自我组装成病毒样颗粒(VLPs)并可能含有特异的抗原表位(Cecchini S等.Evidence ofprior exposure to human bocavirus as determined by a retrospective serologicalstudy of404serum samples from adults in the United States.Cl in VaccineImmunol2009, 16:597-604)。滕灵方等在昆虫细胞中表达人博卡病毒VP2蛋白后用于临床标本的筛查，证实VP2蛋白具有一定的抗原性(滕灵方等.博卡病毒VP2基因在sf9昆虫细胞中表达及临床标本筛查.中华实验和临床病毒学杂志2009,23(6))。Martinez C等利用昆虫细胞表达的猪细小病毒VP2蛋白(VLPs)免疫猪体后可以激发特异的免疫反应(Martinez C 等.Production of porcine parvovirus empty capsids with highimmunogenic activity.VaccinelO:684-690),表明 VP2 蛋白具有较好的免疫原性。
[0005]现有研究表明博卡病毒与繁殖障碍、消化道和呼吸道疾病有关，尤其在幼龄群体中发病率较高。瑞典学者通过对猪博卡病毒流行病学的调查发现，发生断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪，其猪博卡病毒的感染率是没有患PMWS的猪的两倍(BlomstromAL 等.Studies of porcine circovirus type2,porcine boca-like virus and torqueteno virus indicate the presence of multiple viral infections in postweaningmultisystemic wasting syndrome pigs.Virus Res, 152:59-64)。此外，据翟少伦等人报道，从有呼吸道症状的患病猪体内所收集的样品检测发现，猪博卡病毒普遍存在，具有较高的流行率(69.7%) (Zhai S 等.High prevalence of a novel porcine bocavirusin weanling piglets with respiratory tract symptoms in China.Arch Virol,155:1313-1317)。
[0006]目前，猪群中出现了一系列的猪博卡病毒变异体，对其研究还刚刚起步，其单独的致病性不得而知。在发生断奶仔猪多系统衰竭综合征的动物中，存在多种病毒(猪圆环病毒2型，猪博卡 病毒，猪细小病毒，猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒等)，这表明猪博卡病毒可能作为一种辅助因子在疾病的发展过程中起作用。但多数(PBoVl、PBoV2及PBoV4)分离于患PMWS的病猪，并且在病猪的检出率高于健康猪，这表明猪博卡病毒对断奶后多系统衰竭综合征的发生有一定相关性，其也可能与猪圆环病毒2型、猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒等病原混合感染发生更严重的疾病，导致呼吸道感染和腹泻，以及引发流产、死胎，甚至死亡。
[0007]作为一个新发现的病毒，猪博卡病毒在消化道、呼吸道以及腹泻等疾病中的病原学作用以及它的潜在致病性在很大程度上是未知的。因此，对猪博卡病毒的密切监控及有效防控将是未来研究的发展趋势。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题就是提供含有猪博卡病毒VP2基因的重组质粒。
[0009]作为优选方案，所述重组质粒为含有猪博卡病毒VP2基因的pFastBac HTB-VP2重组转移质粒。
[0010]所述重组质粒还包括与重组转移质粒pFastBac HTB-VP2进行同源重组后的杆状病毒穿梭质粒，该重组穿梭质粒命名为rBacmid-VP2。
[0011]本发明还提供了一种含有猪博卡病毒VP2基因的重组杆状病毒，其表达的猪博卡病毒VP2蛋白，能够在昆虫细胞中表达后形成病毒样颗粒(VLPs)。
[0012]作为优选方案，通过PCR扩增一种猪博卡病毒VP2基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。将扩增到的猪博卡病毒VP2基因插入到杆状病毒转移质粒pFastBac?HTB的BamH I和Xho I位点构建为重组转移质粒pFastBac HTB-VP2，然后将该重组转移质粒转化至含有杆状病毒骨架质粒的DHlOBac感受态细胞，通过同源重组将VP2基因整合至杆状病毒骨架质粒Bacmid中，提取重组Bacmid DNA转染sf9细胞后获得重组杆状病毒rBV-VP2。该重组杆状病毒，命名为:含有猪博卡病毒VP2基因的重组杆状病毒E2/rBV-VP2Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus E2/rBV_VP2,其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为:2013年12月20日，保藏号为=CCTCCNO:V201401o
[0013]本发明还提供了上述重组杆状病毒rBV_VP2在制备猪博卡病毒疫苗中的应用。
[0014]作为优选方案，所述猪博卡病毒疫苗为亚单位疫苗。其制备方法为:将重组杆状病毒rBV-VP2感染sf9细胞后表达VP2蛋白(VLPs)获得的亚单位疫苗。[0015]选用杆状病毒的理论基础:
[0016]杆状病毒(Baculovirus)是一类感染无脊椎动物的病毒，呈杆状，具有较高的宿主特异性。苜猜银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(Autographa califonica multiplenuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)的基因组为约130kb的共价闭合环状双链DNA,是最广泛使用和最有特征性的杆状病毒，能感染许多昆虫种类，包括A.夜蛾、草地贪夜蛾(夜蛾)、粉纹夜蛾(甘蓝尺蠖)等。
[0017]Bac-to-Bac 杆状病毒载体表达系统(Bac-to-Bac Baculovirus ExpressionVector System, BEVS)使用一个或多个启动子，将外源目的基因插入到启动子下游，获得重组病毒，这种重组病毒在昆虫细胞或昆虫体内复制的同时，使外源基因得到表达。总体来说，Bac-to-Bac杆状病毒载体表达系统有很多优点:
[0018](I)重组杆状病毒易于构建，容易操作，生物安全性比较高，有很单一的宿主范围。
[0019](2)杆状病毒是一种强大的基因表达载体，本身基因组很大，能够容纳较大的外源片段，具有很高的蛋白表达水平，现已被广泛用来表达分子量较大的外源基因。因此杆状病毒可以表达融合蛋白也可以供表达目的基因以及报告基因等多个基因(Prabakaran M 等.Protective immunity against influenza H5Nlvirus challenge inmice by intranasal co-administration of baculovirus surface-displayed HA andrecombinant CTB as an adjuvant.Virology2008, 380:412-420)?
[0020](3)重组杆状病毒感染效率较高，高滴度病毒粒子容易获得，能感染非分裂期细胞，并能有效介导体内基因的投递，具有很高的靶细胞和组织特异性(胡少敏等.杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体及其在医学中的应用.国外医学寄生虫病分册2004，31 (5):222-226)。
[0021](4)宿主昆虫细胞能够适当地修饰杆状病毒表达的蛋白，其方式和动物哺乳细胞相似(Altmann F 等.Insect cells as hosts for the expression of recombinantglycoproteins.Glycoconj J1999, 16:109-123)。据报道，经杆状病毒表达系统表达的产物，往往会翻译后修饰，具有与天然蛋白类似的生物活性。
[0022]如今，以杆状病毒为载体表达重组蛋白，制备亚单位疫苗取得了较好的效果(Li Z 等.Expression of foot-and-mouth disease virus capsid proteinsin silkworm-baculovirus expression system and its utilization as asubunit vaccine.PLoS 0ne2008,3:e2273;Thomas C 等.Evaluation of efficacyof mammalian and baculovirus expressed E2subunit vaccine candidates tobovine viral diarrhoea virus.Vaccine2009, 27:2387-2393;ffilson S 等.Deliveryof vaccine peptides by rapid conjugation to baculovirus particles.Vaccine2008, 26:2451-2456),在基因治疗领域研究也取得一些进展(Roy P等.Virus-like particles as a vaccine delivery system:myths and facts.HumVaccin2008,4:5-12;Lee YJ 等.Protection of chickens from Newcastle diseasewith a recombinant baculovirus subunit vaccine expressing the fusion andhemagglutininneuraminidase proteins.J Vet Sci2008, 9:301-308)。因此，杆状病毒成为一种优良的表达载体，广泛应用于生物医学各领域。
[0023]更详细的方案如下所述:[0024]一、重组杆状病毒转移载体pFastBac HTB-VP2的构建
[0025]1、引物的设计
[0026]根据本实验室报道的PBoV基因组序列(GenBank登录号为HQ223038.1)设计一对扩增VP2基因的特异引物VP2-F/VP2-R，并在上游引物中引入BamH I酶切位点，下游引物中引入Xho I酶切位点。引物由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列如下:
[0027]VP2-F:5’-TTTGGATCCATGTCCGCACACAGGGGGGC-3’
[0028]VP2-R:5’-GGGCTCGAGTTACAACACTTGGTTGAT-3’
[0029]2、PCR 扩增
【权利要求】
1.一种重组质粒载体，其特征在于:该重组质粒载体是含有猪博卡病毒VP2基因的质粒载体。
2.根据权利要求1所述的重组质粒载体，其特征在于:所述质粒载体为pFastBacTMHTB，该重组质粒命名为PFastBac HTB-VP2。
3.根据权利要求1或2所述的重组质粒载体，其特征在于:所述质粒载体为杆状病毒穿梭质粒Bacmid,该重组穿梭质粒命名为rBacmid_VP2。
4.含有权利要求3所述的猪博卡病毒VP2基因的重组杆状病毒。
5.根据权利要求4所述的重组杆状病毒，其特征在于:所述重组病毒为重组杆状病毒rBV-VP2，该重组杆状病毒保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为:2013年12 月 20 日，保藏号为=CCTCC V201401。
6.—种权利要求1~4中任意一项在制备猪博卡病毒疫苗中的应用。
7.根据要求6所述的应用，其特征在于:所述猪博卡病毒疫苗为亚单位疫苗。
8.一种权利要求6所述亚单位疫苗的制备方法，其特征在于:将重组杆状病毒rBV-VP2感染sf9细胞后表达VP2蛋白(VLPs)获得的亚单位疫苗。
【文档编号】C12R1/93GK103740743SQ201310750497
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】肖少波, 方六荣, 刘丽枝, 马俊, 曾松林, 王荡, 罗锐, 陈焕春 申请人:华中农业大学