降解角蛋白的方法以及制备的角蛋白水解产物的用途

降解角蛋白的方法以及制备的角蛋白水解产物的用途
【专利摘要】本发明涉及一种用于制备角蛋白水解产物的方法，包括以下步骤：i)将角蛋白材料与蛋白酶和不含硫的表面活性剂混合，还涉及如此制备的角蛋白水解产物及其用途。
【专利说明】降解角蛋白的方法以及制备的角蛋白水解产物的用途
[0001] 序列表的引用
[0002] 所附的是包括SEQIDN0 :1_4的序列表，其全部内容以引用的方式并入本文。

【技术领域】
[0003] 本发明涉及蛋白酶和不含硫的表面活性剂的组合在降解角蛋白方面的方法和用 途，以及所制备的角蛋白水解产物的后续用途。

【背景技术】
[0004] 角蛋白是存在于多种结构中的一家族坚韧蛋白的总称。它是被许多类的动物用作 结构元件的蛋白，并且是纤维蛋白的经典例子。为了实现此结构功能，角蛋白分子是螺旋 和纤维状的，从而围绕彼此缠绕形成称为中间丝的链。据认为，这使得许多蛋白难以在一 开始就被酶消化。另外，角蛋白含有高百分比的含硫氨基酸，主要是半胱氨酸，这些氨基酸 在各个分子之间形成二硫桥并有助于形成相当刚性的角蛋白结构。遗憾的是，二硫桥也使 得角蛋白的消化和降解相当困难。存在两种主要类型的角蛋白：a-角蛋白和角蛋白。 a-角蛋白主要存在于哺乳动物的毛发（包括羊毛）、兽角、指/趾甲、爪子和兽蹄中。更硬 的角蛋白存在于爬行动物的趾甲中及鳞和爪子中，它们的壳中（龟鳖目（Testudines)， 诸如乌龟、海龟、水龟），鸟类的羽毛、鸟喙、爪子中，以及豪猪的刚毛中。0 -角蛋白主要以 折叠的形式形成，但一些折叠也存在于a-角蛋白中。
[0005] 角蛋白的降解可具有重大的商业价值。一种特别的角蛋白来源，即羽毛，由家禽 业大量产生。在2002年，家禽业中使用了大约490亿只鸡。家禽羽毛通常含有大约90% 的角蛋白形式的蛋白。然而，角蛋白必须在裂解后其蛋白内容物才能被动物消化 (McCaslandandRichardson1966,Poult.Sci., 45:1231-1236(McCasland和Richardson, 1966年，《家禽科学》，第45卷，第1231-1236页）；Moranetal. (Moran等人））。羽毛的降 解因此可提供可消化蛋白和氨基酸的廉价来源。相应地，羽毛水解产物（即，降解的羽毛） 能够以多种方式使用，诸如用于动物饲料中。然而，回收该营养物的现行方法是如此低效和 高昂以至于绝大部分角蛋白废物流只是在垃圾填埋场处置或经由焚烧处置，这两者均可导 致环境问题并降低主要商业化工艺（通常为用于人类食用的肉类生产）的可持续性。遗憾 的是，用于制备角蛋白水解产物的一些当代工艺所制备的羽毛粉比鸡肉更贵。
[0006] 角蛋白的降解可通过蒸汽水解、化学水解和酶水解实现。例如，蒸汽水解在 M.J.Considine,2000,NewEnzymeTechnologiesForPoultryBy-Products.Proc.Aust.Poult.Sci.Sym. 2000. -- 12,pages163-165,ISSNNo. 1034-6260 (M.J.Considine，2000 年， "用于家禽副产品的新型酶技术"，《2000年12月澳大利亚家禽科学专题讨论会会议记录》， 第163-165页，ISSN号1034-6260)中进行了公开。蒸汽水解的一个缺点在于该工艺会使 热敏性氨基酸降解，从而耗减所得的羽毛水解产物的营养含量。此外，已发现，通过蒸汽水 解制备的羽毛水解产物具有相对低的可消化性。这对于将羽毛水解产物用于饲料是明显不 可取的，因为可供动物获取的蛋白质和氨基酸的量并不理想。
[0007] 用于降解角蛋白的另一种方法是化学水解。例如，可使用酸（诸如盐酸）、碱（诸 如氢氧化钠）和氧化剂（诸如过酸）来分解存在于角蛋白中的二硫键。化学水解的一个缺 点在于使用此类化学试剂的成本可较高昂。另一个缺点在于与酶方法相比，氨基酸的量可 减少，参见Kim等人（PoultryScience，2002,85 :95-98(《家禽科学》，2002年，第85卷，第 95-98页）-表2)。另一个严重的缺点在于，许多被建议用于化学水解的试剂是不适用于食 品用途的含硫试剂（例如，十二烷基硫酸钠（SDS)、二硫苏糖醇（DTT)、巯基乙醇、L-半胱氨 酸、亚硫酸钠、氨基磺酸铵和二甲基亚砜（DMS0))。此类刺激性化学试剂可能擅于破坏二硫 桥，但它们使所得的角蛋白水解产物不适宜在食品或动物饲料产品中使用。
[0008] 降解角蛋白的另一种方法是借助酶水解。多份以北卡罗莱纳州立大学（North CarolinaStateUniversity)的名义授予Shih等人的专利涉及使用地衣芽孢杆 菌（B.lichenif〇rmis)PWD-l或从该细菌分离的角蛋白酶来降解家禽羽毛。参见US 4,908,220、旧 4,959,311、旧 5,063,311、旧5，171，682、旧5，186,961 和旧5,712，147。 酶降解可以是有利的，因为与使用蒸汽水解或化学水解相比，一些工艺可导致存在更易消 化的蛋白质和氨基酸。
[0009]然而，如Cai等人（J.ZhejiangUniv.Sci.B20089 (9) :713-720 (《浙江大学学报 B辑》，2008年，第9卷第9期，第713-720页））所公开，单独使用蛋白酶（诸如角蛋白酶） 降解角蛋白可能非常低效。Cai等人公开了含硫化学试剂诸如SDS、氨基磺酸铵（ammonium sulfatate)和DMS0刺激了羽毛粉水解，原因是含硫化学试剂所引起的反应。然而，使用含 硫化学试剂的一个缺点在于，高含量的亚硫酸盐可导致潜在有害的副作用。例如，高含量的 亚硫酸盐与某些人的哮喘加重有关，并且如果其在工业过程中于高温下使用，则会带来危 害。
[0010] 因此，期望提供一种用于降解角蛋白的方法，该方法提供了在所得水解产物的效 率、成本效益和营养含量方面的所需平衡。例如，期望提供一种降解角蛋白的方法，该方法 得到可消化蛋白质和氨基酸的良好来源，同时使成本最小化和/或同时减少了所利用的含 硫化学试剂的量。

【专利附图】

【附图说明】
[0011] 图1显示了鸡羽毛在与以下物质（从左到右）反应之后的降解：20mg亚硫酸氢钠 (K2)，150iilProtex 30L(E0) ;150iilProtex 30L和 20mg亚硫酸钠（E1-两根试管）；以 及150y1 Protex 30L和20mg亚硫酸氢钠（E2-两根试管）。
[0012] 图2显示了鸡羽毛在存在或不存在GrinsteduSSLP55VEGK-A(E481，硬脂酰乳 酸钠）和亚硫酸钠的情况下与蛋白酶（Protex30L)反应之后的降解。所有管均包含Protex 30L，此外从左到右：试管1. 0和1. 1包含20mj4'GHnstecTSSL和20mg亚硫酸钠；试管1. 2 包含20mg亚硫酸钠，并且试管1. 3包含20mgGrinstecTSSL。
[0013] 图3显示了鸡羽毛在存在或不存在Pan〇danu517K0SHER(E472e，单和二甘油酯 的二乙酰酒石酸酯）和亚硫酸钠的情况下与蛋白酶（Protex30L)反应之后的降解量。所 有管均包含Protex30L，此外从左到右：试管2. 0和2. 1包含20mgpan〇dailU 517和20mg 亚硫酸钠，试管2. 2包含20mg亚硫酸钠，并且试管2. 3包含20mgpan〇dan* 517。
[0014] 图4显示了角蛋白材料在各种蛋白酶ProtexP浓度下的反应之后，通过吸光度测 得的角蛋白水解。
[0015] 图5显示了不含硫的表面活性剂与蛋白酶结合使用时对羽毛水解的影响，以角蛋 白水解单位表示。添加全部五种不含硫的表面活性剂，连同1%V/V蛋白酶（ProtexP)， 达到0.1%w/v的最终浓度。ProtexP:在不存在不含硫的表面活性剂时的反应。对照： 在既不存在不含硫的表面活性剂、也不存在蛋白酶时的反应。误差条代表标准偏差。根据 Holm-Sidak成对比较，带有字母a-f的平均值显著不同，P= 0. 05。
[0016] 图6显示了仅有不含硫的表面活性剂时对羽毛水解的影响，以角蛋白水解单位表 示。添加全部五种不含硫的表面活性剂，达到〇. 1%w/v的最终浓度。对照：在不存在表面 活性剂时的反应。误差条代表标准偏差。根据Holm-Sidak成对比较，带有字母a-c的平均 值显著不同，P= 0.05。
[0017] 图7显示了不含硫的表面活性剂与蛋白酶结合使用的协同增强效应。通过将来自 使用单独的蛋白酶的实验的数据与来自使用单独的不含硫的表面活性剂的实验的数据相 加生成计算数据。*指示根据使用SigmaPlot11.0软件执行的t检验，在观察值和计算值 之间存在统计上的显著差异，P= 〇. 05。
[0018]图 8 显不 了序列IDNO1ProtexP
[0019]图 9 显不 了序列IDNO2Protex6L
[0020] 图10显示了序列IDNO3
[0021] 图11显示了序列IDNO4


【发明内容】

[0022] 本发明的开创性发现在于不含硫的表面活性剂可刺激蛋白酶对角蛋白的降解。该 发现特别令人惊讶，因为在本发明之前，人们普遍认为在刺激蛋白酶对角蛋白的水解时，存 在硫或使用还原剂是关键的。
[0023] 本发明人首次证实，不含硫的表面活性剂（诸如硬脂酰-2-乳酸钠和脂肪酸的单 和二甘油酯的二乙酰基酒石酸酯）增强了蛋白酶对角蛋白的降解和/或溶液化。这一令人 惊讶的发现使得角蛋白能够降解和/或溶解以提供可消化蛋白质和氨基酸的良好来源，和 /或能够制备具有可消化蛋白质和氨基酸的良好来源的角蛋白水解产物。有利的是，在角 蛋白的酶降解过程中使用不含硫的表面活性剂可以导致以下有利效果中的一者或多者：i) 使工艺能够更快地实现期望的降解水平或期望的可消化蛋白质和/或氨基酸的水平；ii) 改善获得具有可消化蛋白质和/或氨基酸来源的期望水平的角蛋白水解产物的成本效益； 和/或iii)使在工艺中利用的含硫化学试剂的量减少。
[0024]发明陈沭
[0025] 在一个方面，本发明提供制备角蛋白水解产物的方法，该方法包括以下步骤：i) 将角蛋白材料与蛋白酶和不含硫的表面活性剂任选地在封闭系统中或在受控的氧气水平 下混合。
[0026] 在另一个方面，本发明提供降解角蛋白的方法，其中将角蛋白材料与蛋白酶和不 含硫的表面活性剂混合。
[0027] 在又一个方面，本发明提供制备动物饲料的方法，该方法包括将通过本发明的方 法制备的角蛋白水解产物与一种或多种动物饲料组成组分混合。
[0028] 在又一个方面，本发明提供包含不含硫的表面活性剂的组合物用于刺激角蛋白的 酶降解的用途。适宜地，所述包含不含硫的表面活性剂的组合物可任选地包含蛋白酶。适 宜地，所述组合物可以是药物组合物或化妆品组合物。
[0029] 在另一个方面，本发明提供通过本发明的方法制备的角蛋白水解产物在饲料中的 用途。
[0030] 在另一个方面，本发明提供通过本发明的方法制备的角蛋白水解产物。
[0031] 在又一个方面，本发明提供包含本发明的角蛋白水解产物的饲料添加剂组合物。
[0032] 在另一个方面，本发明提供包含本发明的角蛋白水解产物的饲料。
[0033] 本发明的这些和其他方面在下文的【具体实施方式】中更详细地描述。

【具体实施方式】
[0034] 除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开文本所属技术 领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton，etal.，DICTIONARYOFMICROBIOLOGY ANDMOLECULARBI0L0GY，20ED.JohnWileyandSons，NewYork(1994) (Singleton等人， 《微生物学和分子生物学词典》，第20版，约翰威利父子出版公司，纽约，1994年）以及Hale &Marham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,NY(1991) (Marham，《哈珀柯林斯生物学词典》，哈珀永久出版社，纽约，1991年）为技术人员提供本公 开所使用的许多术语的通用词典。
[0035] 本公开文本并不受本文公开的示例性方法和材料的限制，任何与本文所述的那些 方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公开文本的实施例的实施或试验。数值 范围包括限定该范围的数字。除非另外指明，否则分别是，任何核酸序列从左至右以5'至 3'取向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。
[0036] 本文提供的标题并非对本公开文本的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施 例可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。相应地，下面就要定义的术语通过将说明 书作为一个整体来参考会得到更完全的定义。
[0037] 在更详细地描述示例性的实施例之前，应理解本公开文本并不限于所描述的具体 实施例，因为这些实施例当然是可变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体的实施 例的目的，并不意在具有限制意义，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限定。
[0038] 在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间数值 (至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定）也被具体公开。规定的范围中的任 何规定值或中间值与该规定的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被 涵盖在本公开文本内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而 且其中任一个、没有一个或两个界限被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开文 本中，但依据该规定的范围中的任何被具体排除的界限而定。在规定的范围包括界限中的 一个或两个的情况中，排除这些被包括的界限中的任一个或两个的范围，也被包括在本公 开文本中。
[0039] 必须指出，本文和所附权利要求书中用到的名词既有单数含义也有复数含义，除 非上下文另有清楚规定。因此，例如，提到"蛋白酶"包括多种此类酶，而提到"饲料"包括 提到一种或多种饲料以及本领域技术人员知道的它们的等同物，以此类推。
[0040] 本文述及的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文 的任何内容都不能被解释为承认这些出版物构成本文所附权利要求的现有技术。
[0041] 方法
[0042] 在一个方面，本发明涉及降解角蛋白或制备角蛋白水解产物的方法，该方法包括 将角蛋白材料与蛋白酶和不含硫的表面活性剂混合。
[0043] 如本文所用的术语"角蛋白水解产物"是指在通过例如蛋白酶水解角蛋白材料后 所得的产物。
[0044] 混合可在容器或反应器中进行。在一个实施例中，容器或反应器是自由落体容器 或反应器。自由落体容器的例子包括圆筒混合器和滚筒混合器。
[0045] 适宜地，可将角蛋白材料、一种或多种蛋白酶和一种或多种表面活性剂任选地与 一种或多种另外的组分混合（同时地或依次地）。
[0046] 混合角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性剂，直至已出现期望的角蛋白材料 降解程度（例如，直至角蛋白材料的可消化性升高，从而在其中富集可消化蛋白质和肽的 浓度）。本领域的普通技术人员将容易地理解，所用的最佳时间段将取决于许多因素，诸如 涉及所使用蛋白酶的最佳pH和最佳温度的温度和pH;存在于待降解的角蛋白材料中的交 联度；是否在所述工艺中使用其他组分诸如还原剂、化学氧化剂、酸或碱，以及例如蛋白酶 与角蛋白材料的量比率。
[0047] 在一个实施例中，可将角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性剂混合约30分钟 至约48小时。适宜地，可将角蛋白材料和蛋白酶混合约1小时至约42小时；或约2小时至 约36小时；或约3小时至约30小时；或约4小时至约24小时；或约5小时至约18小时。
[0048] 在一个实施例中，可将角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性剂混合约30分钟 至约16小时；或约30分钟至约14小时；或约1小时至约12小时；或约1. 5小时至约10小 时；或约2小时至约8小时；或约3小时至约7小时。
[0049] 适宜地，可将角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性剂混合至少30分钟；或至 少45分钟；或至少1小时；或至少1. 5小时；或至少2小时；或至少2. 5小时；或至少3小 时；或至少3. 5小时；或至少4小时；或至少4. 5小时；或至少5小时；或至少5. 5小时；或 至少6小时；或至少7小时；或至少8小时；或至少9小时；或至少10小时。
[0050] 在一个实施例中，将角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性剂混合至少2小时。
[0051] 适宜地，可将角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性剂混合少于16小时、少于 15. 5小时、少于15小时、少于14. 5小时、少于14小时、或少于13小时。
[0052] 在一个实施例中，可将角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性剂混合少于16小 时。
[0053] 在一个实施例中，可将角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性剂混合少于13小 时。
[0054] 在一个实施例中，可将角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性剂混合约1. 5小 时至约10小时。
[0055] 在一个实施例中，可将角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性剂混合直到至少 50重量％的角蛋白材料降解。任选地，可将角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性剂混 合直到至少55重量％ (适宜地，至少60重量％或至少70重量％或至少80重量％或至少 90重量％或100重量％ )的角蛋白材料降解。100%降解的羽毛材料或使羽毛材料100% 降解可通过以下方式定义：羽片、羽支和后羽完全从羽轴和空心轴脱离；并且羽轴和空心 轴碎片化，使得羽毛粉在一个单步骤中制得。
[0056] 在一个实施例中，可将角蛋白材料（例如，湿羽毛）加工（例如，机械地加工）成小 碎片。可将角蛋白材料加入容器（例如，处于环境温度）中并加热（例如，加热至50-80°C)， 同时添加蛋白酶、不含硫的表面活性剂以及任选的化学试剂和/或还原剂（例如，亚硫酸 盐）。容器可以是任选地具有减小的空气空间以控制氧气水平的封闭反应器。使角蛋白材 料和蛋白酶反应合适的时间（例如，30小时至48小时）。可将容器旋转，或可对容器内容 物进行混合（例如，使用搅拌桨以l_200rpm混合）。在反应过程期间，混合可导致一些氧气 被连续引入反应液体中。相应地，容器的空气空间可有利地具有较低的氧气水平（例如，通 过使用料流将空气驱出反应器）。所得的角蛋白材料（例如，羽毛粉）可被干燥并且可被用 作饲料组分。适宜地，这种工艺具有降低与研磨角蛋白材料并利用特定高温（例如120°C) 相关联的能量的优点，所述能量可导致某些氨基酸破坏。
[0057] 适宜地，反应期间的pH在所使用蛋白酶的工作范围内。本领域的普通技术人 员能按常规确定所使用蛋白酶的最佳工作范围，并添加缓冲剂以将反应溶液调节到适当 的pH。例如，蛋白酶Protex30L(可得自杜邦工业生物科学公司（DuPontIndustrial 13;[08(^6110684口3))的工作口11范围可以为约5.5至约12。当将？1'(^61301^用作蛋白酶 时，混合步骤期间的pH可以为约5. 5至约12。适宜地，该pH范围可以为约7至约11、或约 8至约10。优选地，当使用Protex30L时，pH为约pH9。
[0058] 在一个实施例中，所用的pH为处于所使用蛋白酶的约最佳pH的pH。例如，该pH可 以为所使用蛋白酶的最佳pH(例如，对于Protex30L而言，为约8至约10的pH)的+/-约 lpH。适宜地，该pH可以为所使用蛋白酶的最佳pH的+/-约0. 5pH。
[0059] 在另一个实施例中，所用的pH是蛋白酶的最佳pH。
[0060] 适宜地，将反应期间的温度调节到所使用蛋白酶的工作范围内。本领域的普通技 术人员能按常规确定所使用蛋白酶的最佳工作范围并在期望的温度下执行所述反应。例 如，蛋白酶Protex30L的工作范围可以为约30°C至约80°C。当将Protex30L用作蛋白酶 时，混合步骤期间的温度可以为约30°C至约80°C。适宜地，该温度可以为约40°C至约80°C， 或约50°C至约80°C。适宜地，该温度可以为约60°C至约80°C。优选地，当使用Protex30L 时，该温度为约70°C。
[0061] 适宜地，所用的温度可以为所使用蛋白酶的最佳温度的+和/或-15°C;或者+和/ 或-10°C;或者+和/或-5°c ;或者+和/或-4°c ;或者+和/或-3°c ;或者+和/或-2°c ; 或者+和/或-rc。优选地，所用的温度为所使用蛋白酶的约最佳工作温度。
[0062] 在一个实施例中，所用的温度为所使用蛋白酶的最佳温度的+和/或-10°C。
[0063] 在另一个实施例中，所用的温度为所使用蛋白酶的最佳温度的+和/或_5°C。
[0064] 在一个实施例中，在混合步骤中可存在不止一种酶。适宜地,所用的温度、pH和其 他反应条件可随后被选择为在所使用酶的工作范围内。适宜地，所使用酶（例如，不止一种 蛋白酶和/或其他额外的酶）被选择为具有重叠的工作范围。优选地，酶被选择为具有相 容的、优选相似的工作范围。
[0065] 适宜地，在将角蛋白材料与蛋白酶和/或不含硫的表面活性剂混合之前，可对羽 毛进行灭菌，例如以减少和/或防止细菌污染。该灭菌步骤可通过任何可用的方式执行。例 如，可通过使角蛋白材料与福尔马林或环氧乙烷气体接触而实现熏蒸。作为另一种选择和 /或除此之外，可通过在压力下汽蒸而实现蒸汽灭菌。适宜地，为了有助于角蛋白材料的后 续酶降解，蒸汽灭菌可能是优选的。
[0066] 在一个实施例中，可使用蒸汽对角蛋白材料进行预处理，以便将空气从容器中排 出、将容器加热至40至121°C(优选50-80°C)的温度、和/或对角蛋白材料进行灭菌。适 宜地，可在这种蒸汽处理之前或之后将蛋白酶和/或亚硫酸盐与角蛋白材料混合。
[0067] 在一个实施例中，在反应步骤之前对角蛋白材料进行蒸汽灭菌。适宜地，蒸汽灭菌 包括使角蛋白与蒸汽在足以促进其后续酶水解的温度下接触一段时间的步骤，即使该蒸汽 处理步骤不实现角蛋白材料的完全灭菌。适宜地，蒸汽灭菌可包括使角蛋白材料与蒸汽在 压力下于封闭室内在120至125°C下接触至少2分钟、或至少5分钟、或至少10分钟、或至 少15分钟、或至少20分钟。适宜地，蒸汽处理的时间和温度可小于商业蒸汽水解工艺中所 采用的那些时间和温度，所述商业蒸汽水解工艺在约35p.s.i.或更高的蒸汽压力下采用 35分钟或更长的处理时间。
[0068] 在本发明的一个实施例中，本发明的方法可包括可以在与蛋白酶和/或不含硫的 表面活性剂的反应步骤之前、期间和/或之后进行的化学水解步骤。
[0069] 在本发明的一个实施例中，本发明的方法可包括可以在与蛋白酶和/或不含硫的 表面活性剂的反应步骤之前和/或期间进行的化学水解步骤。
[0070] 在本发明的一个实施例中，本发明的方法可包括可以在与蛋白酶和/或不含硫的 表面活性剂的反应步骤之后进行的化学水解步骤。
[0071] 在一个实施例中，适宜地，在化学水解中使用的酸或碱可提供将pH调节到蛋白酶 的最佳工作条件的手段。
[0072] 在一个实施例中，化学水解可以在与蛋白酶的反应步骤之后进行。
[0073] 本发明的工艺可以作为分批、分批补料或连续工艺执行。
[0074] 在一个实施例中，本发明的工艺可以分批工艺执行。有利的是，分批工艺更容易适 于控制氧气水平。
[0075] 在一个实施例中，通过本发明的方法制得的羽毛水解产物可以是沉淀物的形式。 适宜地，将大于1. 〇cm(适宜地，大于0.lcm)的颗粒物回收，以进行预处理或水解。
[0076] 在一个实施例中，通过本发明的方法制得的羽毛水解产物可以是溶液的形式。
[0077] 表面活件剂
[0078] 本发明的方法和用途利用不含硫的表面活性剂。
[0079] 在一个实施例中，如本文所用的术语"表面活性剂"是指降低其溶解于其中的液体 的表面张力的物质。例如，表面活性剂可降低水的表面张力。表面活性剂可优选地充当洗 涤剂、润湿剂、乳化剂或分散剂。适宜地，表面活性剂可以是两亲的（即，可同时包含疏水基 团和亲水基团）。
[0080] 在另一个实施例中，"表面活性剂"可以是"乳化剂"。如本文所用的术语"乳化剂" 是指通过增加乳液的动力学稳定性而使乳液稳定的物质。
[0081] 优选地，所用的表面活性剂（例如，乳化剂）对动物和/或人类无毒。
[0082] 优选地，表面活性剂选自：癸酸钠；TritonX-100 ;吐温20 ;吐温80;卵磷脂；聚氧 乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯；聚氧乙烯山 梨醇酐单棕榈酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸酯；磷脂 酸铵；脂肪酸的钠盐、钾盐或钙盐；脂肪酸的镁盐；脂肪酸的单和二甘油酯的乙酸酯；脂肪 酸的单和二甘油酯的乳酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的柠檬酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯 的单和二乙酰基酒石酸酯；脂肪酸的蔗糖酯；蔗糖甘油酯；脂肪酸的聚甘油酯；聚甘油聚蓖 麻酸酯；脂肪酸的丙烷-1，2-二醇酯；与脂肪酸的单和二甘油酯相互作用的热氧化大豆油； 硬脂酰-2-乳酸钠；硬脂酰-2-乳酸钙；山梨醇酐单硬脂酸酯；山梨醇酐三硬脂酸酯；山梨 醇酐单月桂酸酯；山梨醇酐单油酸酯和山梨醇酐单棕榈酸酯。
[0083] 在一个实施例中，表面活性剂选自：癸酸钠；TritonX-100 ;吐温20和吐温80。优 选地，表面活性剂为癸酸钠。
[0084] 在一个实施例中，表面活性剂是选自以下的乳化剂：癸酸钠；TritonX-100;吐 温20 ;吐温80 ;卵磷脂；聚氧乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯；聚氧乙烯山梨 醇酐单油酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯；聚氧乙烯 山梨醇酐三硬脂酸酯；磷脂酸铵；脂肪酸的钠盐、钾盐或钙盐；脂肪酸的镁盐；脂肪酸的单 和二甘油酯的乙酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的乳酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的柠檬酸 酯；脂肪酸的单和二甘油酯的单和二乙酰基酒石酸酯；脂肪酸的蔗糖酯；蔗糖甘油酯；脂肪 酸的聚甘油酯；聚甘油聚蓖麻酸酯；脂肪酸的丙烷-1，2-二醇酯；与脂肪酸的单和二甘油酯 相互作用的热氧化大豆油；硬脂酰-2-乳酸钠；硬脂酰-2-乳酸钙；山梨醇酐单硬脂酸酯； 山梨醇酐三硬脂酸酯；山梨醇酐单月桂酸酯；山梨醇酐单油酸酯和山梨醇酐单棕榈酸酯。 有利的是，此类表面活性剂是目前用于食品行业并通常被认为能安全用于食品的乳化剂。
[0085] 在一个实施例中，在本发明的方法和用途中仅将一种表面活性剂与蛋白酶结合使 用。在另一个实施例中，使用两种或更多种表面活性剂的任意组合。例如，可以使用2种或 3种或4种或5种或6种或7种或8种或9种或10种表面活性剂的任意组合。
[0086] 待使用的表面活性剂的最佳量可容易地由本领域的普通技术人员确定。
[0087] 在一个实施例中，所用的表面活性剂的量可在约0. 01%w/v至约1%w/v的范围 内。优选地，表面活性剂的量可在约0. 05-0. 9%w/v的范围内。
[0088] 适宜地，所用的表面活性剂的量可以大于或等于0. 01%w/v角蛋白材料。优选地， 所用的表面活性剂的量可以大于或等于〇. 02%w/v、或0. 05%w/v或0. 1%w/v角蛋白材 料。
[0089] 适宜地，所用的表面活性剂的量可以小于或等于1%w/v角蛋白材料。优选地，所 用的表面活性剂的量可以小于或等于〇. 9%w/v、或0. 8%w/v或0. 5%w/v角蛋白材料。
[0090] 在一个实施例中，所用的表面活性剂的量可以在约0.lg/Kg角蛋白材料至约10g/ Kg角蛋白材料（例如羽毛）的范围内。适宜地，所用的表面活性剂的量可以在约0.5g/Kg 角蛋白材料至约5g/Kg角蛋白材料（例如羽毛）的范围内。
[0091] 适宜地，所用的表面活性剂的量可以大于或等于0.lg/Kg角蛋白材料。优选地，所 用的表面活性剂的量可以大于或等于〇. 5g/Kg、或lg/Kg、或2g/Kg角蛋白材料。
[0092] 适宜地，所用的表面活性剂的量可以小于或等于10g/Kg角蛋白材料。优选地，所 用的表面活性剂的量可以小于或等于8g/Kg、或5g/Kg或3g/Kg角蛋白材料。
[0093] 在一个实施例中，表面活性剂与角蛋白材料的比率可以在约1 : 100至约 1 : 10, 000的范围内。优选地，表面活性剂与角蛋白材料的比率可以在约1 : 500至约 1 : 5,000的范围内。
[0094] 适宜地,表面活性剂与角蛋白材料的比率可以大于1 : 10, 000。
[0095] 适宜地，表面活性剂与角蛋白材料的比率可小于1 : 100。
[0096] 在一个实施例中，表面活性剂是不含硫的表面活性剂。不希望受理论的束缚，据 信，表面活性剂可通过打开溶液中的疏水性角蛋白材料而起作用，从而允许酶更好地进入 结构中以进行水解。作为另一种选择，表面活性剂可有助于将经水解的蛋白质从羽毛的表 面移除到溶液中，使得羽毛的下层表面暴露于蛋白水解。
[0097] 在一个实施例中，如果在降解角蛋白材料（例如羽毛）的过程中，在过程结束时存 在于溶液中的可溶性蛋白的量与存在于不使用不含硫的表面活性剂的对照方法的溶液中 的可溶性蛋白的量相比有所增大，则该不含硫的表面活性剂可以是用于本发明的方法和用 途的表面活性剂。适宜地，可溶性蛋白的增加可通过在215-280nm处的吸光度的增加来衡 量。
[0098] 角蛋白材料
[0099] 角蛋白是存在于羽毛、毛发、毛皮、兽蹄、指/趾甲、羊毛、爪子和鳞中的纤维结构 蛋白。角蛋白可被分成两个独立的组：a-角蛋白和角蛋白。角蛋白通常比a-角 蛋白更硬，因为它们含有更多的半胱氨酸键。
[0100] 用于本发明的方法和用途的角蛋白材料可以是包含角蛋白的任何物质。适宜地， 角蛋白材料可包括羽毛、毛发、毛皮、兽蹄、指/趾甲和羊毛。
[0101] 在一个实施例中，角蛋白材料包含角蛋白。角蛋白可存在于爬行动物的趾 甲和爪子中，龟鳖目的壳中，鸟类的羽毛、鸟喙和爪子中，以及豪猪中。适宜地，角蛋白材料 可以是羽毛，优选地是家禽羽毛，优选地是鸡羽毛。
[0102] 在一个实施例中，角蛋白材料包含a-角蛋白。a-角蛋白可存在于哺乳动物的毛 发（包括羊毛）、兽角、指/趾甲、爪子和兽蹄中。适宜地，角蛋白材料可以是毛发、兽角或兽 蹄。
[0103] 在一个实施例中，角蛋白材料包括羽毛、毛发、兽角、兽蹄或羊毛。适宜地，角蛋白 材料可以是羽毛、毛发、兽角、兽蹄或羊毛。
[0104] 在一个实施例中，将至少5g角蛋白材料用于本发明的工艺和用途。适宜地，将至 少50g、优选至少100g、优选至少500g角蛋白材料用于本发明的工艺和用途。
[0105] 在一个实施例中，使用至少1kg角蛋白材料，优选地使用至少2kg、或至少10kg、或 至少20kg、或至少30kg角蛋白材料。
[0106]蛋白酶
[0107] 如本文所用的术语"蛋白酶"与肽酶或蛋白酶同义。
[0108]用于本发明中的蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶（E.C.3. 4.21.62)或芽孢杆 菌溶素（bacillolysin) (E.C. 3. 4. 24. 28)或碱性丝氨酸蛋白酶（E.C. 3. 4. 21.x)或 角蛋白酶（E.C. 3.4.x.x)。适宜地，用于本发明中的蛋白酶可以是蛋白酶肽链内切 酶K(EC3. 4. 2. 1. 64)、肽链内切酶Arg-C、内切蛋白酶Gluc-C(EC3. 4. 21. 19)、肠激 酶（EC3. 4.21.9)、胶原酶（EC3. 4.24.3)、嗜热菌蛋白酶（EC3. 4.24. 27)、胰蛋白酶(EC3. 4. 21. 4)、胰凝乳蛋白酶（EC3. 4.21. 1)、胃蛋白酶（EC3.4.23.1)、曲霉胃蛋白酶 (aspergillopepsin)(EC3. 4. 23. 18)、sedolisin(EC3. 4. 21. 100)、或二肤基肤酶（EC 3. 4. 14. 1)。
[0109] 优选地，根据本发明的蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、酸 性蛋白酶、中性蛋白酶或角蛋白酶。
[0110] 合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些。化学改性的或蛋白质工程改 造的突变体也是合适的。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如，碱性微生物蛋 白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子为枯草杆菌蛋白酶，尤其是源自芽孢杆菌属 (Bacillus)菌种的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌 蛋白酶309 (参见，例如美国专利No. 6, 287, 841)、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶 168 (参见，例如W0 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子为胰蛋白酶（例如猪或牛起源的 胰蛋白酶）和镰刀菌（Fusarium)蛋白酶（参见，例如W0 89/06270和W0 94/25583)。可用 的蛋白酶的例子还包括但不限于W0 92/19729和W0 98/20115中所述的变体。所有这些均 以引用方式并入本文。
[0111] 根据本发明的术语"野生型蛋白酶"或"野生型"描述具有存在于自然界中的氨基 酸序列的蛋白酶。
[0112] 根据本发明的术语"蛋白酶变体"或"变体"描述具有衍生自亲本蛋白酶的氨基酸 序列的氨基酸序列但差别在于一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失（它们一起称为"突 变"）的蛋白酶。可以设想，蛋白酶变体也可以是用于另外多轮制备蛋白酶变体的方法诸如 分子进化的亲本蛋白酶。
[0113] 根据本发明的术语"同源多肽"（在本文中也被描述为"同源物"）描述与第一多 肽/蛋白酶/酶氨基酸序列相比具有高于75 %的序列同一性，优选地具有至少80 %、85 %、 90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的多肽，优选蛋白酶（即，"同源蛋白酶" 或"同源酶"）。
[0114] 术语"其功能等同物"意指该酶必须具有与本文详述的蛋白酶大致相同的功能特 性。术语"修饰形式"或"变体"意指所述酶已从其初始形式进行了修饰但保持相同的酶功 能特性。具体地讲，术语"变体"或"修饰形式"涵盖这样的蛋白酶，其氨基酸序列衍生自亲 本/野生型蛋白酶的氨基酸序列，但具有一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失（它们一 起称为突变）。修饰形式或变体与亲本酶相比可显示出改变的酶特性。优选地，修饰形式或 变体具有以下增强的表型中的一种或多种：增加的热稳定性，和/或增加的蛋白水解（例如 胃蛋白酶）稳定性，和/或增加的比活性，和/或更宽的底物特异性，和/或更宽pH范围内 的活性。术语"功能"或"有效"片段意指蛋白酶的保持大致相同的酶功能或效果的片段或 部分。
[0115] 如本文所用，术语"热稳定的"涉及酶在暴露于高温后保持活性的能力。
[0116] 如本文所用，术语"pH稳定的"涉及酶在宽pH范围内保持活性的能力。
[0117] 在一个优选的实施例中，用于本发明中的蛋白酶可为如下商业产品中的一者或多 者中的一种或多种蛋白酶：
[0118]

【权利要求】
1. 一种制备角蛋白水解产物的方法，包括以下步骤： i)将角蛋白材料与蛋白酶和不含硫的表面活性剂混合。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤i)在受控的氧气水平下进行。
3. -种降解角蛋白的方法，其中将角蛋白材料与蛋白酶和不含硫的表面活性剂混合。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂选自以下中的一者 或多者：癸酸钠；Triton-X-100 ;吐温20 ;吐温80 ;卵磷脂；聚氧乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯山 梨醇酐单月桂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯；聚氧乙 烯山梨醇酐单硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸酯；磷脂酸铵；脂肪酸的钠盐、钾盐或 钙盐；脂肪酸的镁盐；脂肪酸的单和二甘油酯的乙酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的乳酸酯； 脂肪酸的单和二甘油酯的柠檬酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的单和二乙酰基酒石酸酯；月旨 肪酸的蔗糖酯；蔗糖甘油酯；脂肪酸的聚甘油酯；聚甘油聚蓖麻酸酯；脂肪酸的丙烷-1， 2_二醇酯；与脂肪酸的单和二甘油酯相互作用的热氧化大豆油；硬脂酰-2-乳酸钠；硬脂 酰-2-乳酸钙；山梨醇酐单硬脂酸酯；山梨醇酐三硬脂酸酯；山梨醇酐单月桂酸酯；山梨醇 酐单油酸酯和山梨醇酐单棕榈酸酯。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂为硬脂酰-2-乳酸 钠和/或单和二甘油酯的二乙酰酒石酸酯。
6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述角蛋白材料选自以下中的一者或 多者：羽毛、毛发、毛皮、兽蹄、指/趾甲和羊毛。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述羽毛为家禽羽毛（例如，鸡羽毛）。
8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶为选自以下的属中的一者 或多者：芽孢杆菌属（Bacillus)、曲霉属（Aspergillus)、沙雷氏菌属（Serratia)和拟诺卡 氏菌属（Nocardiopsis) 〇
9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶得自芽孢杆菌属 (Bacillus)〇
10. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶包含如SEQ ID NO :1或2 中任一者所定义的多肽序列，或其功能性片段或变体，所述功能性片段或变体在至少50个 氨基酸残基上与SEQ ID NO :1或2中的任一者具有至少75%的序列同一性。
11. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶可由与SEQ ID NO :3或 SEQ ID NO :4具有至少75%同一性的编码蛋白酶的核酸序列、或在严格条件下能够杂交至 SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4的核酸序列或其互补序列的核酸序列转录。
12. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中还原剂在反应步骤i)之前或期间添 加。
13. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括化学水解步骤。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述化学水解步骤在反应步骤i)之前和/或期 间进行。
15. 根据权利要求13所述的方法，其中所述化学水解步骤在反应步骤i)之后进行。
16. -种制备动物饲料的方法，包括将通过根据前述权利要求中任一项所述的方法制 备的角蛋白水解产物与一种或多种动物饲料组成组分混合。
17. 包含不含硫的表面活性剂的组合物用于刺激角蛋白的酶降解的用途。
18. 根据权利要求17所述的用途，其中所述组合物包含蛋白酶并且其中所述组合物为 药物产品或化妆产品。
19. 根据权利要求17所述的用途，其中执行所述角蛋白降解的所述酶包含如SEQ ID NO :1或2中任一者所定义的多肽序列，或其功能性片段或变体，所述功能性片段或变体在 至少50个氨基酸残基上与SEQ ID NO :1或2中的任一者具有至少75%的序列同一性。
20. 通过根据权利要求1至16中任一项所述的方法制备的角蛋白水解产物在饲料中的 用途。
21. 通过根据权利要求1至16中任一项所述的方法制备的角蛋白水解产物。
22. -种饲料添加剂组合物，其包含根据权利要求21所述的角蛋白水解产物。
23. -种饲料，其包含根据权利要求21所述的角蛋白水解产物。
24. -种方法，其是如本文结合实施例和附图充分描述的。
25. -种用途，其是如本文结合实施例和附图充分描述的。
26. -种产品，其是如本文结合实施例和附图充分描述的。
【文档编号】C12P21/06GK104507329SQ201380038641
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2012年7月20日
【发明者】于 S., H. 波尔森 C., G. 汉斯特德 J. 申请人:杜邦营养生物科学有限公司