一种干旱和盐诱导特异性启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种干旱和盐诱导特异性启动子及其应用，涉及基因工程领域。本发明提供的干旱和盐诱导特异性启动子是具有如下所述任一序列的DNA分子：(1)序列表中序列1-1429位核苷酸所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)所述的DNA分子杂交且具有干旱和盐诱导启动子功能的DNA分子；(3)与(1)或(2)所述DNA分子具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。该启动子应用于启动GUS基因的表达或者应用于培育抗干旱和抗盐的转基因植物。
【专利说明】一种干旱和盐诱导特异性启动子及其应用【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，尤其涉及的是一种干旱和盐诱导特异性启动子及其应用。
【背景技术】
[0002]诱导型启动子是指在正常环境条件下活性很低但是在受到外界特殊信号的刺激下能够很大程度的提高基因表达量的启动子。诱导型启动子一方面可以通过特殊的信号源刺激目的基因的表达，另一方面可以避免植株生长发育过程中由组成型启动子的超量表达所引起的负面效应。因此，诱导型启动子在植物基因工程中有着广泛应用前景。
[0003]Δ 1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶(Pyrroline-5-carboxylate synthetase,P5CS)是参与脯氨酸合成的关键酶，脯氨酸是小分子的渗透物，在植物的抗逆性中起到重要的作用。脯氨酸的积累是通过脯氨酸合成的生物活化和生物降解的抑制作用而共同产生的。研究表明，将外源P5CS基因转化到植物受体中可以提高植物受体内游离的脯氨酸含量，从而增强转基因植株抵抗渗透胁迫的能力。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的 技术问题是针对现有技术。
[0005]本发明的技术方案如下:
[0006]一种干旱和盐诱导特异性启动子，其是具有如下所述任一序列的DNA分子:
[0007](I)序列表中SEQ ID NO:5所示序列1-1429位核苷酸所示的DNA分子；
[0008](2)在严格条件下与(I)所述的DNA分子杂交且具有干旱和盐诱导启动子功能的DNA分子；
[0009](3)与⑴或⑵所述DNA分子具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
[0010]所述严格条件为在0.1 X SSPE或0.1XSSC、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗月吴。
[0011]所述的干旱和盐诱导特异性启动子应用于启动GUS基因的表达或者应用于培育抗干旱和抗盐的转基因植物。
[0012]本发明所述的MspScs启动子为抗盐和干旱相关的启动子,对该启动子的研究可为诱导型启动子的研究打下坚实的基础，也为培育出抗逆植株提供了前提。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为在重组表达载体pCAMBIA1304-GUS中，插入Msp5cs启动子部分的结构示意图；A为pCAMBIA1304质粒结构简图，B为pMsp5cs-1304_GUS质粒简图。
[0014]图2为转基因烟草植株再生的示意图；其中，A为叶盘侵染共培养；B为诱导愈伤组织形成；C为愈伤组织诱导出小芽；D为长出抗性幼苗；E为抗性幼苗生根；F & G为抗性苗的移栽。
[0015]图3为转pl304Msp5cs-GUS质粒烟草PCR结果；注:M.DL2000DNA标准分子质量；1，2，3，5，6，8，9，11，12，14，15 & 17 为转 PMSP5CS-1304 质粒烟草 PCR 阳性植株。
[0016]图4为转pCAMBIA1304质粒烟草PCR结果；注:M.DL2000DNA标准分子质量；1，2，3,5,6,8,10 & 11为转pCAMBIA1304质粒烟草PCR阳性植株。
[0017]图5为转pl304Msp5cs-GUS质粒和转pCAMBIA1304质粒的烟草叶片在盐胁迫后的⑶S检测结果；其中A为转pl304MSpScS-GUS质粒烟草盐胁迫⑶S染色图，B为转PCAMBIA1304质粒烟草盐胁迫⑶S染色图。 [0018]图6为转pl304Msp5cs-GUS质粒和转pCAMBIA1304质粒的烟草叶片在干旱胁迫后的⑶S检测结果；其中A为转pl304MSp5cS-GUS质粒烟草干旱胁迫⑶S染色图，B为转PCAMBIA1304质粒烟草干旱胁迫⑶S染色图。
【具体实施方式】
[0019]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0020]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定性实验，均设置三次重复实验，取实验图片一致的图片展示实验结果。
[0021]本赛姆氏烟草(Nicotiana benthamiana):来自新疆农业大学生物化学与分子生物学重点实验室，种子编号:K326。
[0022]GUS染色液及GUS活性检测:50 μ LX-Gluc (20mg/ml)、500 μ L磷酸缓冲液(0.lmol/L PH7.0) ,50 μ LEDTA (0.5mol/L, PH8.0) UOy LlO % Trion X-100 和 390 μ L 去离子水配置成Iml Gus染色液中过夜,然后吸出染色液,加入70%乙醇脱色,室温放置过夜脱色后进行拍照。
[0023]pCAMBIA1304 载体:此载体从 pcambia institute 获得。
[0024]Msp5Cs启动子的获得方法:参考文献:张桦，新牧I号杂花苜蓿抗逆相关基因的克隆和功能分析，新疆农业大学，2011。
[0025]实施例1转基因烟草的获得与鉴定
[0026]一、重组表达载体pMsp5cs-1304_GUS的构建
[0027]1、根据参考文献得到Msp5Cs启动子的序列，设计特异性引物:MSP5CS SF:5’ATCGAGCTCGATTGACCTAGAACAGGGA-3，，MSP5CS SR: TCACCATGGGCAAGAGACAGTTCACGTA-3，，PCR 扩增体系为:ddH2018.25μ 1，IOXTaq DNA Polymerase Buffer2.5 μ I, dNTPl μ 1，引物 11 μ 1，引物 21 μ 1，DNA 模板 I μ 1，Taq DNA Polymerase0.25 μ 1，总共 25 μ I ；PCR 反应循环参数为:94°C 5min ；94°C 30s, 63.9°C 30s, 72°C lmin，循环 35 次；72°C IOmin ;4°C保存。
[0028]2、将 PCR 的产物和 18-T simple 连接:将 pMD_18T vector I μ 1，PCR 产物 4 μ 1，Solution Ι5μ 1，共10μ 混匀，于16°C连接仪中过夜，最后获得连接载体pMD18-TMsp5cs。
[0029]3、用Nco I和Sac I两种酶双酶切连接载体pMD18_T Msp5cs，回收酶切产物。
[0030]4、用Nco I和Sac I两种酶双酶切pCAMBIA1304载体，回收载体骨架。
[0031]5、将步骤3和步骤4的回收产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接:将 10XT4Buffer2.5 μ 1，DNA 片段 6 μ 1，载体 DNA 片段 5 μ 1，T4DNA 连接酶 I μ 1，ddH2010.5yl，(S*25yl)混合均匀，然后在16°C条件下，连续反应25小时，得到重组表达载体pMsp5cs-1304-GUS，如图1所示。
[0032]二、转基因烟草的获得
[0033](I)将(一)中构建的重组表达载体pMsp5cs-1304-GUS和植物表达载体PCAMBIA1304通过冻融法转化到农杆菌LBA4404中，获得两种转基因农杆菌LBA4404菌株。
[0034](2)将烟草种子消毒后放置于1/2MS中，25°C培养10天左右获得无菌烟草幼苗。
[0035](3)将剪下的无菌幼苗叶盘放置预培养基中(MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L6-BA,pH5.8)，25°C暗培养2天。同时将含有转基因农杆菌菌株接种于YEB培养基，28 °C，200rpm,培养至0D600 = 0.5，浸染暗培养结束的叶盘15min。
[0036](4)将侵染结束的叶盘转移到灭菌滤纸上，吸干叶盘表面菌液后转移至共培养基上(MS+0.lmg/LNAA+1.0mg/L6_BA+，pH5.8)，25°C左右暗培养 2 天。
[0037](5)然后将叶盘转移至分化培养基培养(MS+0.05mg/L NAA+1.0mg/L6-BA+300mg/LCef+60mg/L Kan, pH5.8)，16/8光/暗培养大约一个月，保持室温28°C。长出小苗后，将小苗转移至生根培养基上(1/2MS+0.lmg/L NAA+250mg/L Cef+50mg/L Kan，ρΗ5.8)，16/8 光 /暗培养。生根后将苗移栽到含土壤的花盆中，如图2所示。
[0038](6)获得两种转基因幼苗后，待长出4-5片真叶后，采取叶片，提取植物基因组DNA,分别对两种转基因烟草植株的基因组DNA进行PCR。
[0039]转pMsp5cs-1304-GUS质粒植株以Msp5cs启动子为目的基因设计引物。
[0040]Msp5cs SF:5，`-ATCGAGCTCGATTGACCTAGAACAGGGA-3，，
[0041]Msp5cs SR:5，-TCACCATGGGCAAGAGACAGTTCACGTA-3，。
[0042]PCR体系为:ddH2018.25 μ I, IOXTaq DNA Polymerase Buffer2.5 μ I, dNTPl μ 1，引物 11 μ 1，引物 21 μ 1，DNA 模板 I μ 1，Taq DNA Polymerase0.25 μ I (总共 25 μ I)。
[0043]PCR 反应循环参数为:94°C 5min ；94°C 30s, 63.9 °C 30s, 72 °C lmin，循环 35 次；72 °C 10min，4°C 保存。
[0044]转pCAMBIA1304质粒植株以npt II基因为目的基因设计引物。
[0045]NPT II SF:5，-CAGGGGCGCCCGGTTCTTTT-3，，
[0046]NPT II SR:5，-CGCCTTGAGCCTGGCGAACA-3，。
[0047]PCR体系为:ddH2018.25 μ I，IOXTaq DNA Polymerase Buffer2.5 μ I, dNTPl μ 1，引物 11 μ 1，引物 21 μ 1，DNA 模板 I μ 1，Taq DNA Polymerase0.25 μ I,(总共 25 μ I)。
[0048]PCR 反应循环参数为:94 °C 5min94 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C lmin,循环 35 次；72 °C 10min，4°C 保存。
[0049]经过PCR筛选后的结果表明，两种转基因烟草均有15株可作为实验材料，如图3和图4所示。
[0050]三、⑶S化学性质分析
[0051]将(二)获得的两种阳性转基因烟草进行胁迫实验，并进行GUS化学性质分析。
[0052]具体如下:
[0053](I)对两种转基因烟草进行盐胁迫处理:用200mmol/L NaCl处理转PMsp5cs-1304质粒和转PCAMBIA1304质粒的烟草叶，分别在胁迫第I天、第3天、第5天、复水后第I天和复水第3天对叶片进行GUS染色检测，结果如图5所示。[0054]经200mmol/L NaCl盐胁迫后，检测不同阶段的烟草叶片⑶S染色情况，并进行拍照。从图5中可以很清楚的看出，转p5cs::⑶S质粒的烟草叶片在盐胁迫后随着天数增加，叶片染色后颜色明显加深，其中盐胁迫第5天颜色最深；而转CaMV35S AUS质粒的烟草叶片GUS染色后叶片颜色变化不太明显，反而在盐胁迫第5天叶片颜色变浅。研究表明，在盐胁迫的情况下，随着天数增加，p5cs::GUS质粒上的⑶S基因表达量增加；CaMV35S::GUS质粒上的GUS基因表达变化不太明显，且第5天植株叶片颜色有变浅趋势，可能由于植物细胞渗透压过高而不能正常生长所致。
[0055]复水后，植株能够正常吸收水分调节细胞渗透压，Msp5cs启动子受外界环境的诱导减弱，⑶S基因的表达减少，转p5cs::⑶S质粒的植株叶片颜色逐渐变浅；转CaMV35S:GUS质粒烟草植株叶片的颜色变化不是太大。由Msp5Cs基因启动子和CaMV35S启动子调控⑶S基因表达量的多少可以说明，在盐胁迫下，Msp5Cs启动子的表达能力明显比组成型启动子CaMV35S强。研究表明，Msp5Cs基因启动子是一种盐诱导型启动子。
[0056](2)对两种转基因烟草进行干旱胁迫处理:对转基因烟草进行预先控水5天处理，减少土壤水分的干扰，然后在干旱胁迫的第I天、第3天、第5天、复水后第I天和复水第3天对叶片进行GUS染色检测，结果如图6所示。
[0057]分别对转基因烟草进行干旱胁迫后，检测不同胁迫时间段的转基因烟草叶片GUS染色情况，并进行拍照。对两种转基因烟草进行预控水5天处理是防止天土壤中水分的干扰，从图6中可以看出，在干旱处理后，转p5cS::GUS质粒的转基因烟草随着胁迫天数增多，叶片颜色也不断加深，其中干旱胁迫第5天时叶片颜色最深；转CaMV35S::GUS质粒的烟草随着天数的增加，叶片颜色变化不大。 研究表明，在干旱胁迫下，随着天数增多，转P5cs::GUS质粒的烟草叶片GUS基因表达不断增多；转CaMV35S::GUS质粒的烟草叶片中GUS基因表达差异不明显，而且在干旱胁迫第5天，叶片中GUS基因表达有下降趋势，可能是干旱影响烟草植株正常生长导致⑶S基因表达减少。
[0058]在复水后，植株能够正常吸收水分调节自身渗透压，转基因烟草受到的干旱胁迫逐渐减弱并消失，苜蓿Msp5Cs基因启动子受外界逆境环境诱导减弱，GUS基因表达逐渐减少；而转CaMV35S::GUS质粒的烟草叶片中⑶S基因表达基本不变。由此说明，在干旱胁迫下，Msp5Cs基因启动子的表达能力比组成型启动子CaMV35S强，说明苜蓿Msp5Cs基因启动子也是一种干旱诱导型启动子。
[0059]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种干旱和盐诱导特异性启动子，其特征是，是具有如下所述任一序列的DNA分子: (1)序列表中SEQID NO:5所示序列1-1429位核苷酸所示的DNA分子； (2)在严格条件下与(I)所述的DNA分子杂交且具有干旱和盐诱导启动子功能的DNA分子; (3)与(I)或(2)所述DNA分子具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
2.根据权利要求1所述的干旱和盐诱导特异性启动子，其特征是，所述严格条件为在0.1 X SSPE或0.1XSSC、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
3.根据权利要求1所述的干旱和盐诱导特异性启动子的应用，其特征是，应用于启动GUS基因的表达或者应用于`培育抗干旱和抗盐的转基因植物。
【文档编号】C12N15/113GK103773765SQ201410000113
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】张桦, 钱进, 任燕萍, 曲延英, 许磊 申请人:新疆农业大学