一株富含甘油酯型DHA的破囊壶菌Aurantiochytrium sp.及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及了一株经过选育可用于生产甘油酯型DHA的破囊壶菌Aurantiochytrium?sp.及其应用。所述破囊壶菌分离自中国深圳沿海水域，已于2013年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China?General?Microbiological?Culture?Collection?Center，CGMCC），保藏编号为CGMCC?No.8575。所述破囊壶菌菌体的非极性脂质占总脂质的含量高，为富含甘油酯型DHA的菌株，可应用于工业生产甘油酯型DHA。
【专利说明】—株富含甘油酯型DHA的破囊壶菌
sp.及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物破囊壶菌CGMCC N0.8575,其脂质的主要成分为非极性脂质，其中DHA占总脂质含量高，可以获得高产量的甘油酯型DHA，适用于甘油酯型DHA的工业生产。
【背景技术】
[0002]多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是保持人体健康重要的营养成分之一，特别是DHA和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acids,EPA)具有非常重要的医药应用和营养价值。
[0003]在食品行业中，甘油酯型DHA可添加至牛奶或奶粉中，用作功能性营养物质。
[0004]目前，DHA的商业来源主要是海洋鱼油，沙丁鱼、鳍鱼等含有较高的脂肪组织，在很多国家都被用来生产鱼油，鱼油中DHA的含量可以达到20-30%。但是以鱼油为原料生产DHA具有很多缺点，如鱼油产量不稳定，成分复杂，含有鱼腥味，可能存在重金属污染。
[0005]在海洋环境中，微生物如海洋微藻、真菌等才是DHA的原始生产者。在这些微生物中，DHA的相对含量要远高于鱼油中的含量。
[0006]破囊壶菌是 一类异养的真菌类原生生物，近年来由于其广阔的生物技术应用前景而备受关注。破囊壶菌可以用来生产胞外酶、胞外多糖、类胡萝卜素、ω-3多不饱和脂肪酸如DHA和ΕΡΑ，以及其他一些工业应用的生物活性物质。
[0007]破囊壶菌的脂肪酸组成简单、培养条件成本低，利用破囊壶菌生产DHA，可以有效地解决鱼油DHA存在的问题。因此，作为多不饱和脂肪酸新的生产来源，破囊壶菌是极具潜力进行工业化生产DHA的微生物。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供甘油酯型DHA含量高的破囊壶菌Jarafliioc及Firiw? sp.CGMCC N0.8575，可用于工业化生产DHA，添加于牛奶、奶粉或保健品中。
[0009]根据本发明，提供了一种甘油酯型DHA产量高，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，保藏编号为CGMCC N0.8575的破囊壶菌。该菌株的分类命名为應sp.;保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2013年12月13日。
[0010]该菌株于2012年7月，分离自深圳大鹏湾沿海水域。分离方法的特点在于:采用不同的抗生素组合，利用松花粉垂钓选育。当破囊壶菌富集于松花粉边缘时，挑取松花粉粒，划线培养于琼脂平板上，3-5天后，挑取单菌落划线培养于新的琼脂平板上，以获得纯种破囊壶菌。根据此分离方法，从一个采样点共获得8株破囊壶菌。
[0011]在本发明中，涉及破囊壶菌脂质的提取和分析。其特点在于:利用氯仿:甲醇=1:2体系的混合物作为抽提溶剂，提取细胞内的总脂质，通过气象色谱对结果进行分析，从而选育出 DHA 含量高的菌株，即sp.CGMCC N0.8575。
[0012]在本发明中，还包括破囊壶菌非极性脂质的分离鉴定。利用尼罗红染色，在荧光显微镜下观察显示，破囊壶菌sp.CGMCC N0.8575胞内非极性脂质含量高，定量分析显示，冻干的破囊壶菌sp.CGMCC N0.8575每克包含
0.65-0.85g脂质，其中约有75%为非极性脂质，其中甘油酯型DHA约占总DHA的73%。
[0013]根据本发明，破囊壶菌sp.CGMCC N0.8575细胞内脂肪酸主要为DHA和十六烷酸，两者之和为脂肪酸含量的80-90%，即十六烷酸含量可达35-65%。高含量的十六烷酸说明该菌株也适用于生物柴油的工业生产。
【具体实施方式】
[0014]本发明发现了存在于中国深圳沿海水域中的破囊壶菌，并从中挑选出了一株富含甘油酯型DHA的菌株。18S rRNA测序结果显示该破囊壶菌为應sp.,该菌株被命名为Aurantiochytrium sp.PKU#SW7,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC),保藏编号为 CGMCC N0.8575。
[0015]破囊壶蔑Aurantiochytriuni sp.CGMCC N0.8575保藏于琼脂平板上。琼脂培养基组成如下:每100ml过滤海水中含葡萄糖Ig,蛋白胨0.15g,酵母提取物0.01g,琼脂lg。将划线培养的破囊壶菌^?/'<3/?0'0<^_7(/^_8卩.CGMCC N0.8575置于室温保藏。
[0016]可以根据如下方案制备接种培养液。
[0017]从保藏的琼脂平板中挑取生长良好的菌落，接入10_20ml海水培养基中培养，用作接种液。接种液在培养2天后，以大于5%的比例接种于新鲜的海水培养基中。培养条件温度为25-30°C，转速为160rpm，在培养4天后，收集生物质。
[0018]培养过程中，利用尼罗红染料对破囊壶菌sp.CGMCC N0.8575细胞进行染色，于荧光显微镜下观察，细胞体内的金黄色荧光显示其非极性脂质含量闻。
[0019]称取一定量的冻干生物质样品，可以利用氯仿:甲醇=1:2体系的混合物作为抽提溶剂，提取细胞内的总脂质。首先，将称取的干燥生物质放置具塞三角瓶中，添加抽提溶剂后，160rpm振荡I小时后添加氯仿:甲醇=1:1体系溶剂，混合均匀后静置lh，转移出氯仿层，氮吹浓缩即得到总脂质。获得总脂质含量为细胞干重的65-85%，即每克破囊壶菌Aurantiochytrium sp.CGMCC N0.8575 冻干细胞含有脂质的量为 0.65-0.85g。
[0020]对提取的总脂质进行柱色谱分离。采用sigma Discovery DSC-NH2固相萃取柱，利用正己烷老化柱子，以正己烷:氯仿:甲醇=95:3:2的体系上样。非极性脂质部分首先通过氯仿洗脱得到，极性脂质部分通过两步洗脱得到，第一步采用甲醇:氯仿=6:1洗脱，第二步采用0.05M醋酸钠溶液(溶剂为甲醇:氯仿=6:1)洗脱。结果显示非极性脂质占总脂质的75%左右。
[0021]对柱色谱分离获得的非极性脂质进行薄层色谱分析。采用G型薄层层析硅胶板，进行二维色谱分离。在第一个方向，采用正己烷:乙醚=80:20为展开剂，第二个方向，采用正己烷:乙醚:甲醇=70:20:10为展开剂。结果显示非极性脂质中的主要成分为甘油三酯。[0022]对总脂质、非极性脂质和极性脂质分别进行转酯化反应。采用4%的硫酸甲醇溶液，于80°C酯交换反应I小时，冷却至室温后，用正己烷抽提，用于气象色谱分析。发现DHA占总脂质含量的28-35%，非极性脂质中DHA的含量为20_25%，即甘油酯型DHA达到总DHA含量的73%左右,表明破囊壶菌sp.CGMCC N0.8575是一株非常适用于生产甘 油酯型DHA的菌株。
【权利要求】
1.一株富含甘油酯型DHA的破囊壶菌sp.CGMCC N0.8575,其特征在于:保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center, CGMCC)。
2.根据权利要求1，从深圳大鹏湾沿海水域分离出破囊壶菌，并从中挑选出了一株富含甘油酯型DHA的菌株，实验室编号为及Firiws sp.PKU#SW7，保藏编号为CGMCCN0.8575。
3.权利要求2中所述的分离方法，其特点在于:采用不同的抗生素组合，利用松花粉垂钓选育，当破囊壶菌富集于松花粉边缘时，挑取松花粉粒，划线培养于琼脂平板上，3-5天后，挑取单菌落划线培养于新的琼脂平板上，以获得纯种破囊壶菌。
4.权利要求1和2中所述的破囊壶菌CGMCCN0.8575,其生产 DHA的特征在于:DHA为总脂肪酸含量的25-45%，其中甘油酯型DHA占总DHA的73%左右。
5.根据权利要求4，其包含在海水培养基中培养微生物，利用尼罗红染色法，在显微镜下检测非极性脂质。
6.根据权利要求4，收集生物质后进行冷冻干燥，从干燥细胞中提取脂质，将提取的脂质通过柱色谱分离，分别得到非极性脂质(脂肪酸甘油酯)和极性脂质(磷酸甘油酯)，对非极性脂质部分进行薄层色谱分析，发现甘油三酯为非极性脂质的主要成分。
7.根据权利要求6,破囊壶菌sp.CGMCC N0.8575的细胞脂质中，75%左右为非极性脂质，甘油酯型DHA占总DHA的73%左右。
【文档编号】C12R1/645GK103725617SQ201410000036
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月1日 优先权日:2014年1月1日
【发明者】刘瑛, 李晶晶, 张善发, 成家杨, 温志友, 袁文桥 申请人:北京大学深圳研究生院